抽象的
基于差异1抗原区域的干扰素-γ释放检测提高了对潜伏结核感染(LTBI)的诊断。然而,这些检测不能区分最近获得的感染(发展为活动性结核病的高风险)和远处的LTBI。本研究的目的是评估t细胞干扰素-γ的反应分枝杆菌结核Dosr-Congondon编码的抗原(延迟抗原)与结核不同阶段的受试者中的Quantiferon TB-Gold管(QFT-Git)相比。
研究了总共16个具有偏远LTBI和最近感染的人;15控制未曝光玉米菌菌并对50例活动性肺结核患者和45例治愈肺结核患者进行了分析。
结果表明,与远程LTBI受试者显示显著更高的全血干扰素γ以响应玉米菌菌潜伏抗原Rv2628与近期感染、活动性肺结核患者和对照组相比(p<0.003),而其他潜伏抗原(Rv2626c、Rv2627c、Rv2031c和Rv2032)在这些组间无显著差异。qft - git阳性的远程感染患者对Rv2628应答的比例比近期获得感染患者高5倍。
这些数据表明玉米菌菌潜伏抗原Rv2628可能与免疫介导的抗结核保护有关。在接触者追踪调查中,这些初步数据可能区分近期(QFT-GIT阳性结果,对Rv2628无反应)和远程感染(两项检测均呈阳性)。
根据具有结核菌素皮肤测试(TST)的调查,世界卫生组织估计,世界上大约三分之一的人口潜伏期结核分枝杆菌.这一巨大的潜伏结核病(TB)感染库(LTBI)是大多数活动性结核病病例的来源,是实现全球控制结核病的主要障碍1.
使用属于的抗原引入T细胞的干扰素(ICN)-γ释放测定(IGRA)玉米菌菌差异区域1(包括6-KDA早期分泌的抗原靶(ESAT-6)和培养滤液蛋白(CFP)10),可以代表改善LTBI诊断的重要步骤2-4..有证据表明,商业IGRAS对检测LTBI非常敏感2,特异性高,不受Calmette-Guérin(卡介苗)接种影响。虽然IGRAs被设计为LTBI的检测方法,但这些检测方法不能区分活动性疾病和LTBI5.那6..此外,IGRAs不最近获得性感染和远程LTBI区分7..相比于远程LTBI该信息可能具有重要的临床意义,因为最近收购感染携带显著上升发展为活动性疾病的风险8..
在LTBI期间,结节杆菌包含在免疫介导的肉芽肿内9..据认为,持续的结节杆菌受营养和氧气剥夺10那11.作为自适应响应的一部分玉米菌菌对于缺氧,观察到DOSR调节件的表达。大多数Dosr-uralon-Cododed蛋白的功能,下文称为延迟抗原,是未知的12那13.然而,最近的研究表明,某些潜伏抗原在非活动性结核的tst阳性个体中比在患病患者中更容易被识别,而在CFP-10和ESAT-6中则发现了相反的情况13-17.特别地,已经证明RV2627C,RV2628和RV3407在TST阳性个体中诱导强的长期IFN-γ反应。这些研究,其中使用涉及冷冻/新鲜外周血单核细胞(PBMC)或全血的长期(6-7天)刺激的实验环境,表明免疫应答对控制LTBI的潜伏抗原的贡献。
最近,短期和长期全血igra17-19已经被证明是准确的检测免疫反应玉米菌菌2,因此有助于诊断。因此,这项原理论证研究的目的是评估全血IFN-γ对最近描述的潜伏期抗原(Rv2626c、Rv2627c、Rv2628、Rv2031c和Rv2032)在TB不同阶段的第1天(短期应答)和第7天(长期应答)的应答。长期反应评估与文献报道的结果一致。远程和近期感染的受试者,治愈结核病的患者,活动性结核病患者和未接触玉米菌菌研究过。还使用商业IGRA(QualRiferon-Tb金管(QFT-git))测试所有注册的个体,用纯化的蛋白质衍生物(PPD)作为对照抗原。
材料和方法
学习人口
下列个人注册。1)控制:没有风险的个人玉米菌菌tst阴性和qft - git阴性的感染者。2)近期感染:报告有家庭或相当程度密切接触(工作)的个人20.既往3个月痰涂片阳性肺结核患者,TST-和qft - git检测阳性,胸片肺部病变阴性,既往未进行预防治疗。3)远程LTBI: TST-和qft - gt检测阳性,并在登记前3年以上与涂片阳性肺结核患者有家庭或同等程度接触,且未接受预防性治疗的个人。4)治愈结核病:完成6个月疗程的培养阳性肺结核患者,治疗结束时培养阴性。在治疗结束时对患者进行评估。5)活动性结核病:诊断为结核病的个体(或培养阳性的玉米菌菌从痰或阳性玉米菌菌-特异性RNA扩增(MTD测试; GEN-PROBE,CA,USA)由活检标本和/或生物流体产生的结果是入学前的特异性治疗<8天。遥控器和最近的感染受试者在暴露方面是可比的(它们都是密切的接触)。测试阳性至艾滋病毒抗体(三项受试者)或在免疫抑制药物(两个受试者)中的个体未包括在研究中。在注册时,通过结构化问卷收集人口和流行病学信息。该研究得到了国家传染病研究所L. Spallanzani(罗马,意大利)的伦理委员会批准,并提供了书面知情同意书。
结核菌素皮肤试验
使用PPD(Chiron,Siena,Italy)的5 IU的Mantoux程序给予TST。72小时后读取结果。≥5或≥10mm的诱导分别为近期感染或其他条件进行阳性22.
遗传损伤elisa与玉米菌菌潜伏期表达抗原
1天(短期)反应
肝素化全血接种在48孔板中(Corning Costar;Corning, Inc., New York, NY, USA)-1并用5μg·ml的植物血晶素治疗-1(Sigma,圣路易斯,MO,美国),Rv2628和Rv2031c在1 μg·mL-1,和PPD(批量RT 47,达龄血清研究所,哥本哈根,丹麦),RV2626C,RV2627C和RV2032处为5μg·mL-1.这些浓度是在各种试剂滴定后选择的(数据未显示)。然后将样品孵育24小时。第1天,收集血浆并在-20°C保存至检测。
7天(长期)的反应
使用了前面描述的方法17那18.简单地说,在采集当天,用含有青霉素、链霉素和2mM的RPMI 1640稀释5倍的肝素化血L.-Glutamine(来自Euroclone,Paignton,UK),镀成48孔板(康宁肋骨)并如上所述刺激。在37℃下孵育后收获Day-7稀释的血浆并在-20℃下储存直至使用。
IFN-γ确定
采用商用ELISA法(CMI;celestis,卡耐基,澳大利亚),数据以每毫升的国际单位显示,在减去适当的控制后。对于浓度高于最高标准的,用稀释的血浆样品重复测定。
商用干扰素释放
进行QFT-GIT(Cellestis),其结果被制造商所示(阳性测试的截止值为0.35 IU·mL-1).
统计分析
该研究的主要结果是评估抗原刺激下IFN-γ的产生,使用连续(每毫升国际单位)或二分类(阳性/阴性)方法表达。对于连续测量,平均值±sdIFN-γ的产生进行计算,用于配对比较的不成对t检验和ANOVA用于各组之间进行比较的装置。(数据未显示)的结果是通过用Mann-Whitney检验用于成对比较和Kruskal-Wallis检验用于中位数和四分位数间距的计算后多重比较评价证实。对于两两比较,一后HOC.采用Bonferroni校正分析,在p值≤0.05时认为差异显著。
对于二的措施,使用了卡方检验。为两两比较,使用Bonferroni校正,和差异被认为是在≤0.05的p值显著。基于Rv2628的全血测定法的阳性定义的截止值通过接收器工作特性分析定义。对于Windows(SPSS意大利,博洛尼亚,意大利)和棱镜4软件(GraphPad Software,圣地亚哥,CA,USA)SPSS版本14人在分析中使用。
结果
人口特征
研究了总共15个对照和16个具有远程LTBI,50个具有活性TB,45的具有固化TB和23的16个个体。在不同的群体中报告了年龄,性别,BCG疫苗接种,起源和TST结果(表格1).大多数为男性,接种了卡介苗,近40%来自西欧,在活动性结核病患者中肺部局部化是最常见的。
体外短期IFN-γ响应玉米菌菌潜伏抗原:定量分析
到Rv2628,Rv2626c,Rv2627c,Rv2031c和Rv2032的IFN-γ特异性应答在各个群体进行了评价。所有受试者的回应有丝分裂原:对照组(平均±sd15.7±7.6 IU·毫升-1),近期感染(15.1±8.4 IU·mL-1)、远端LTBI(15.7±8.4 IU·mL .-1),有源TB(10.0±8.6 IU·mL-1),并固化TB(15.3±10.9 IU·毫升-1).在各种组的整体比较中发现了显着差异(P = 0.026),而在成对比较中没有发现显着差异。
分析对RV2628的IFN-γ响应,在不同组的整体比较中发现了显着差异(P <0.001)。对于成对比较,对RV2628的响应(图1)是那些具有远程LTBI(5.3±5.9 IU·毫升显著更高-1(0.3±0.5 IU·mL)-1;P = 0.001)和有源TB(1.1±3.4 IU·mL-1;p = 0.002),而与固化的Tb相比,没有观察到显着差异(3.1±5.1 iu·ml-1;p = 0.547)。此外,固化结核病和最近感染的差异(p = 0.056)接近意义。最后,在对照之间发现了显着的差异(0.1±0.1 iu·ml-1)并与远程LTBI(P = 0.003)的受试者。
关于测试的其他潜水抗原,RV2626C,RV2627C,RV2031C和RV2032未发现任何显着的IFN-γ差异,考虑到同时或执行成对比较(无花果。2A-D.).
作为内部对照,IFN-γ响应在QFT-GIT,其抗原是分泌抗原,并与结核分枝杆菌的复制状态相关联,并且向PPD,分枝杆菌抗原的非特异性混合物进行了评价。通过QFT-GIT测量定量响应示于图2E..在具有LTBI的个体中,在QFT-GIT阳性反应的基础上选择了谁,通过比较最近的感染没有观察到显着差异(9.2±10.0 IU·mL-1)至远端LTBI(10.3±8.4 IU·mL .-1).对QFT-Git的阳性反应的个体的比例在活性Tb(50分钟中为72.0%)之间相似,并且固化的Tb(31个中为45; 68.9%),并且当这些反应时没有观察到显着差异以定量术语进行比较两组(5.5±9.8和4.0±6.0 iu·ml-1, 分别)。
对大部分受试者(15名对照中的14名,23名近期感染的8名,16名远程LTBI的10名,50名活动性结核病的34名,45名治愈结核病的34名)的PPD反应进行了分析。定量数据分析发现,当同时考虑所有组时,对PPD的反应存在显著差异(p = 0.004)。在两两比较中,对照组之间有显著差异(5.5±7.4 IU·mL)-1)和远程LTBI(17.7±6.2 IU·ml-1;P = 0.004),在控制和固化的Tb之间(13.0±9.6 IU·ml-1;P = 0.041) (无花果。2f.).对照组与近期感染(13.8±6.3)IU·mL,对照组与活动性肺结核(10.3±7.1 IU·mL)无显著差异-1),活性和固化的Tb,或远程LTBI和最近的感染。
综上所述,这些数据表明IFN-γ对Rv2628的反应最常见于那些能够控制Rv2628的人玉米菌菌与活跃有效的那些相比,复制,自然(远程LTBI)或后续化疗(固化TB)玉米菌菌复制,可控制但急性(近期感染),或不控制(活动性疾病)。这些反应不同于所有其他抗原的反应,包括其余的玉米菌菌潜伏期抗原(Rv2626c, Rv2627c, Rv2031c, Rv2032)和QFT-GIT抗原(ESAT-6, CFP-10, Rv2654 (TB7.7)),以及PPD,因为这些反应在上述组间无显著性差异。
体外短期IFN-γ响应玉米菌菌潜伏抗原Rv2628:定性分析
基于定量分析中发现的显著差异,对Rv2628响应进行了接收者工作特征分析,以评估其在区分结核病不同阶段中的潜在用途。在这项分析中,远程LTBI和活动TB被用作比较组,因为他们代表了最好的例子玉米菌菌分别是包含和活动复制。曲线下面积分析得到显著结果(0.85;95%可信区间0.75 - -0.96;p < 0.001)。为了评分的目的,选择了一个最大限度的灵敏度和特异性的临界值。结果发现,0.5的临界值预测LTBI的敏感性为76.0% (95% CI 61.8-86.9%),特异性为87.5% (95% CI 61.6-98.4%)。
最后,基于发现对RV2628的响应的截止值,结果得分为负性和阳性。各组中发现了显着差异(P <0.001)。如图所示表2.中,阳性结果的最高比例远程LTBI(14 16的; 87.5%)中发现的,这是正对QFT-GIT根据定义,随后固化TB(24的45; 53.3%),其为68.9%阳性QFT-GIT(表3).在活动性结核病患者中,Rv2628阳性反应的比例较低(50人中有12人;24.0%)和最近感染的患者(23人中有4人;17.3%);两组中QFT-GIT阳性反应的比例分别为72.0和100%(定义)。对照组对Rv2628均无反应,QFT-GIT阴性。
在五组个体的阳性率对Rv2628的成对比较登记在还示出表2..的远程LTBI之间的积极响应比例明显高于中活动性TB,近期感染和控制记录显著高,而从固化LTBI差异不显着。甲显著差异也固化TB之间发现相比近期感染或控件,而固化和活性的TB(p值= 0.056)之间的差值接近显着性。
体外长期的IFN-γ响应玉米菌菌潜在抗原
长期的IFN-γ应答被评估为符合结果在文献中报道,虽然在不同的实验设置执行17-20..IFN-γ对Rv2628的长期反应在同时分析的组间有显著差异(p<0.001)。此外,这一反应在远端LTBI患者中显著升高(12.1±13.0 IU·mL)-1)近期感染的那些(2.9±5.3 IU·ml-1;P = 0.002),对照(0.55±1.6 IU·mL-1;p<0.001)和活动性TB(1.7±3.2 IU·mL)-1;p < 0.001)。类似于报告的短期反应的研究结果,与固化的Tb(P = 0.019)相比,活性TB中发现的反应之间发现了显着差异(P = 0.019),并且固化结核病和对照之间的差异接近显着水平(P<0.058)。在分析定性数据时发现类似于用于短期响应的结果(数据未显示)。关于其他潜伏期抗原(RV2626C,RV2627C,RV2031C和RV2032),对所有执行的所有比较没有发现IFN-γ释放的显着差异(数据未示出)。关于PPD,在不同组的总体比较中发现了显着差异(P = 0.001)。对于成对比较,仅在控制之间发现了显着的差异(8.6±7.4 IU·ml-1)和远端LTBI(21.1±4.6 IU·mL .-1;P = 0.001),并控制和固化TB(6.8±9.0 IU·毫升-1;p = 0.007)。
讨论
在目前的原理证明研究中,个体t细胞IFN-γ反应在不同的阶段玉米菌菌感染/疾病和未感染的一系列蛋白在玉米菌菌分析休眠(RV2626C,RV2627C,RV2628,RV2031C,RV2032)。回应玉米菌菌早期相分泌抗原(ESAT-6,CFP-10和TB7.7),如通过QFT-GIT评估,并以分枝杆菌抗原的混合物,如存在于PPD,也进行了评价。
在评估的所有抗原中,RV2628诱导显着更高的IFN-γ响应,并且与最近的感染和活性TB相比,在远程LTBI中发现对该抗原的阳性反应的增加的比例和固化的TB。与偏远LTBI的QFT-Git-阳性个体中,与最近感染的Qft-Git阳性的个体相比,响应者对RV2628的比例几乎高于5倍玉米菌菌(87.5相对17.3%)。当进行定量分析时,使用长期或短期分析也得到了类似的结果。然而,作为一种潜在的诊断工具,全血、第一天的格式似乎更有吸引力。综上所述,这些结果表明,对Rv2628的响应可以用来表征LTBI作为一个遥控器相对最近获得的感染。这可以有助于最近获得的感染的临床管理,因为这种情况的人可能会得到预防性治疗的最大益处8..
这玉米菌菌本研究中使用的潜伏期抗原由该研究编码玉米菌菌DosR调节,它已被证明在制备中起关键作用玉米菌菌对于与细菌休眠相关的代谢下降23那24.目前,DosR调节子产品的确切作用在人玉米菌菌感染不完全理解。RV2031C,原型DOSR调节件产物,是一种小的热休克蛋白,并且在具有LTBI的个体中观察到对RV2031C的细胞免疫应答25.最近,leyten等.14使用长期培养的解冻PBMC研究了对一组25 DOSR编码蛋白的人T细胞应答。结果提供了第一种支持TST阳性个体的人PBMC刺激测定中DOSR调节蛋白的免疫原性。随后,潜水抗原RV1733C,RV2029C,RV2627C和RV2628被鉴定为潜在感染的个体中最常见的识别抗原14那16.同样,IFN-γ对Rv3407的反应最近被证明是对LTBI的特异性反应15.本结果证实可以找到对这些潜伏抗原的细胞免疫应答体外,并表明这种反应也可以通过1天全血试验有效检测。研究还发现,对Rv2628抗原的应答与潜伏感染更明确相关,正如之前Leyten使用其他实验方法所显示的那样等.14和黑色等.16并得到了Roupie的确认等.26在老鼠身上。然而,从所有报告的研究来看,目前尚不清楚为什么对Rv2628的反应可以更好地区分结核病感染的不同阶段。在对人体样本进行的研究中14-17,舒克等.15没有显示出RV2628的任何免疫原性活性。这可能是由于选择未明确定义的LTBI受试者,这可能是最近或远程感染的。
可检测到的回复玉米菌菌潜伏抗原,尽管有限,也在活动性结核病患者中发现。这可能是由于这些抗原是在对细菌所经历的免疫和生理应激的反应中表达的,最终导致潜伏,在这一阶段诱导的对抗原的免疫反应可能仍然可以检测到23那26那27.
如前所示14发现,通过一些未感染的对照,发现潜伏抗原RV2626C和RV2627C的低水平识别,并与BCG接种疫苗接种(数据未显示)不相关)。这种结果可能最可能通过暴露于除去以外的分枝杆菌来解释玉米菌菌具有类似的休眠状态28-30..根据本研究,在BCG中也存在Dosr-Regubon-Encoded抗原,但是,如前所述,疫苗接种似乎与对对照或受试者的对照或受试者的反应诱导相关31.
目前的研究有一些局限性。近期感染者为最近3个月内痰涂片阳性结核病患者的接触者。根据定义,他们都是tst阳性。然而,其中只有8例记录了TST转换,因此不能排除在某些情况下发生了误分类的可能性。虽然所描述的免疫反应与潜伏期状态的关联是极有可能的,但目前的原则证明研究招募的个体数量有限。这表明需要在更大的独立研究中证实这些数据。此外,登记的群体并不完全匹配的原籍地区。为了评估结果是否可能受到不同群体的种族分布差异的影响,重复了分析,只包括那些来自西欧国家的人,这些国家代表着最大的人口群体。在这一组中,发现了在整个人群中观察到的相同的关联(数据未显示)。这一观察结果表明,目前的结果很可能不会因种族或原籍国而有偏见。 These results were obtained by evaluating the response to Rv2628 at a single time-point; however, an evaluation of those with active TB and recent infection over time is crucial in order to understand the meaning of the present study in a clinical context, and ongoing studies are in progress. Finally, several comparisons were performed in order to assess the possible association of each antigen with stage of TB, and this may have increased the chance of false-positive associations. However, the differences in response to Rv2628 between those able to control玉米菌菌复制,天然(远程LTBI)或后续化疗(固化TB),以及有活性的化疗玉米菌菌复制,无论是控制的,但急性(近期感染),还是不控制的(活动性疾病),在应用校正后进行多重比较仍然非常显著。
总之,在远程LTBI中经常检测到全血短期IFN-γ对Rv2628的应答,但在近期获得性感染中很少发现。当决定开始LTBI的预防性治疗时,这些结果可能对风险分层有重要的实际临床意义。
致谢
作者感谢所有参与这项研究的患者和护士(特别是M. Vecchi和C. coopertino(意大利罗马国家传染病研究所L. Spallanzani (INMI)的肺气科)和G. Cuzzi (INMI的流行病学部))。感谢A. Baker (Scientific Direction, INMI)的编辑。
脚注
支持声明
本研究得到了基金资助,用于当前的内际研究和研究计划项目授予06.76.1和07.103(意大利卫生部,意大利),欧洲委员会(布鲁塞尔,比利时)和比尔和梅林达盖茨基金会大挑战在全球健康计划(西雅图,WA,USA)。
感兴趣的语句
E. Girardi,D. Goletti和T.M.的兴趣陈述奥特恩霍夫和研究本身就可以找到www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl
- 已收到2009年9月4日。
- 公认2009年11月11日。
- ©ers 2010.