抽象的
暴露于猪粉尘导致激烈的气道炎症与炎症细胞的多变增加和促炎细胞因子的分泌。这在体外研究着重于swine-dust激活全血淋巴细胞的phagocyte-depleted全血和外周血单核细胞(PBMC),为了调查是否吞噬细胞和/或可溶性介质参与t细胞的激活后暴露于有机粉尘从猪监禁的房子。
通过流式细胞术分析T细胞活化,具有双染色CD3和活化标记CD69。
50µg的猪尘与肝素化的全血孵育(24小时)可激活27.6%的t细胞,而与吞噬细胞或PBMC耗尽的全血孵育的猪尘仅激活4.5%和4.8%的t细胞。从全血中分离的血浆与猪尘预培养24 h可刺激多达32.4%的PBMC t细胞,并含有高水平的白细胞介素(IL)-12 (14 pg·mL)和干扰素(IFN)-γ (2284 pg·mL)−1),而与猪尘培养的PBMC血浆中IL-12水平较低(2 pg·mL−1)和IFN-γ (196 pg·mL−1).
这项研究表明,从猪舍里的有机灰尘激活t细胞似乎需要吞噬细胞,最有可能通过释放可溶性介质。此外,从猪尘暴露的全血中提取的条状血浆能够激活t细胞,其中含有高浓度的白细胞介素-12和干扰素-γ。
在猪舍里接触灰尘三小时会导致严重的气道炎症,健康志愿者的炎症细胞(主要是中性粒细胞)会成倍增加1.曝光还诱导促炎细胞因子的分泌,例如肿瘤坏死因子(TNF)-α,白细胞介素(IL)-1,IL-8和IL-8在气道中体内通过支气管肺泡灌洗(BAL)评估2- - - - - -4.这些细胞因子的最可能的来源是肺泡巨噬细胞5和上皮细胞6.以前的体内研究结果显示,在猪舍接触灰尘后,BAL液中T-和B-淋巴细胞的数量增加,但T-淋巴细胞占淋巴细胞总量的比例没有改变7.在同一项研究中,还证实暴露于有机粉尘可诱导t淋巴细胞的活化(活化标志物CD69、CD25和人白细胞抗原- dr的表达增加)体内7.此外,来自猪舍的灰尘以剂量和时间反应的方式激活t细胞在体外与来自健康受试者的外周整体孵育时8.
的体内吸入有机粉尘引起的淋巴细胞活化可包括通过T细胞抗原受体的T淋巴细胞的特异性活化。还存在T细胞的激活是通过非特异性机制介导的,其中可以涉及从淋巴细胞以外的细胞中释放T细胞的脱离可溶性介质。
目前的目的在体外因此,研究是为了阐明吞噬细胞和/或可溶性介质是否参与在暴露于猪限制房屋的有机粉尘后的T细胞的激活。
材料和方法
主题
抽取7例(5名女性)静脉血,无过敏、不吸烟、健康、既往未接触过猪粉尘,平均年龄43岁(26-58岁)。所有受试者均知情同意,该研究由瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院伦理委员会批准。
用灰尘刺激
在猪混凝土建筑面上收集~1.5米的灰尘,溶解在罗斯威尔公园纪念学院(RPMI)1640媒体(Gibco实验室,佩斯利,英国),超声处理10分钟并稀释于肝素的全血中以最终浓度50μg·ml−1.多克隆激活剂植物血凝素(PHA)作为阳性对照,也溶解在RPMI 1640中,超声10分钟,全血稀释至10µg·mL−1.未经刺激的全血含有RPMI 1640,用作阴性对照。将血液样品孵育24小时,然后将亚乙基氨基氨氨酸乙酸(EDTA)加入到5mm的终浓度。在37°C和5%CO中,在24小时内重复进行所有刺激试验。2.
使用Vacutainer®品牌血液收集管收集血液,以及Vacutainer®CPTTM值,(细胞制备管,Becton Dickinson Vacutainer Systems, Franklin Lakes, NJ, USA)含有肝素钠抗凝血剂。采用梯度分离法筛选外周血单个核细胞(PBMC)。在第一个实验装置中,PBMC与来自全血的血浆(之前用50µg·mL培养过)一起孵育−1猪粉尘,即。“条件等离子体”,10μg·ml−1PHA或RPMI 24小时。在第二种实验组中,PBMC重新悬浮在自体血浆中并与50μg·mL温育−1猪粉尘,10μg·ml−1PHA或RPMI 24小时。
用羰基铁颗粒(4µg·mL)孵育,从全血中去除吞噬细胞−1, 5 μ g, Sigma Aldrich,斯德哥尔摩,瑞典)。血与羰基铁颗粒37℃孵育30分钟,偶尔混合。孵育后,将血样管置于磁铁池(Dynal a.s., Oslo, Norway)中4°C 10分钟。noniron包含即。非吞噬细胞被移走(试管仍然站在磁铁上),转移到另一根塑料管。细胞在4°C下再次放置在磁体上10分钟,重复上述步骤。在铁孵育前后,用单克隆抗体CD14-PE/CD45-FITC (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)对血液进行染色。用50µg猪尘·mL孵育非吞噬细胞−1,10μgpha·ml−1或用RPMI 1640(阴性对照)处理24 h。
单克隆抗体和流式细胞术分析
细胞由亚群特异性荧光标记单克隆抗体表征。为了分析t细胞的活化情况,我们对CD3和细胞表面活化标记CD69进行了双染色(Becton Dickinson)。CD14-PE/CD45-FITC检测单核细胞耗竭情况。20微升单克隆抗体加入到100µL等份溶解在血浆中的血液或PBMC样品中。样品在室温黑暗中孵育20分钟。使用荧光激活细胞分选(FACS)溶解液(Becton Dickinson)裂解红细胞,并使用Cellfix (Becton Dickinson)固定。背景染色采用同型对照。使用FACS Calibur (Becton Dickinson)流式细胞仪计算细胞计数百分比。
通过酶联免疫吸附测定分析细胞因子分析
血浆样本中的IL-12通过人IL-12免疫分析(R&D System Europe Ltd, Abingdon, UK)进行分析。采用OptEIA分析血浆样品中的干扰素(IFN)-γTM值人类IFN-γ套件(Pharmingen,San Diego,CA,USA)。
统计数据
使用STITVIEW®程序,版本4.02进行统计分析,适用于Macintosh和Super Anova 1.11(Abacus Concepts,Inc,Berkeley,CA,USA)。结果以中位数(25-75百分位数)呈现。通过分析方差(ANOVA)进行比较。P值<0.05被认为是统计学意义。
结果
全血孵育24小时后在体外CD3阳性淋巴细胞(T细胞)的27.6%(17.3-30.8)表达早期活化标志物CD69,与非刺激全血(P <0.0001)中的T淋巴细胞的3.3%(2.2-4.4)。与PHA和全血孵育产生71.3%(65.3-73.4)的T淋巴细胞,表达CD69(图1⇓).
在从全血中选择并与灰尘孵育24 h的PBMC中,4.8%(4.5-7.0)的t细胞表达CD69,而非刺激PBMC的t淋巴细胞表达率为2.2%(1.5-3.1)(无显著性)。PHA诱导PBMC中70.9%(36.0-78.8)的t淋巴细胞表达CD69(图1)⇑).
通过与羰基铁孵育来从全血中除去吞噬细胞,从58-35%(中位值)降低7至1%和粒细胞的单核细胞的比例。在这种“吞噬细胞减少”的全血,与粉尘孵育24小时,在T淋巴细胞的4.5%(3.6-9.7)中诱导CD69表达,而非刺激的T淋巴细胞中的1.5%(1.2-1.7)相比,“吞噬细胞减少了1.5%(1.2-1.7)“全血(不重要)。用PHA作为阳性对照孵育CD69表达在T淋巴细胞的71.3%(59.1-79.2)上(图1⇑).
血浆是从暴露在粉尘中的全血中提取的,即。“调节血浆”,并与PBMC孵育24小时。在这种孵育之后,32.4%(29.2-34.4)的CD3阳性T淋巴细胞表达了CD69,而PBMC的3.3%(2.8-3.6)与对照等离子体孵育的PBMC(P <0.0001)孵育。全血的血浆刺激PHA诱导的CD69表达37.1%(30.0-52.1)的T-淋巴细胞(图2⇓).
可溶性介质在条件等离子体中
试图鉴定对T淋巴细胞刺激的重要性的可溶性介质,测量IL-12和IFN-γ的IL-12和IFN-γ的浓度。在尘埃孵化全血,即。IL-12浓度为14.1 (8.3 ~ 22.1)pg·mL−1,浓度低于对照等离子体的检测限。来自PHA的血浆刺激全血含有47.4(25.7-73.2)PG·mL−1IL-12。在用灰尘刺激的PBMC血浆中,IL-12浓度为2.3(0.1-2.8)PG·mL−1.PHA刺激PBMC上清含有5.9 (3.5-10.6)pg·mL−1,虽然阴性对照具有明显不可检测的水平(图3⇓).
条件血浆中的IFN-γ水平为2284.1(1352.8-4025.9)pg·mL−1相比4775.8(3936.2-9381.8)PG·mL−1在pHa刺激的血浆和6.5(0.7-32.6)pg·ml−1在等离子体的控制。猪尘培养物PBMC血浆含量为195.9 (161.2 ~ 364.9)pg·mL−1804.1 (286.7-863.0) pg·mL−1在PHA刺激PBMC和6.0(1.9-15.0)PG·mL−1在对照上清液中(图3⇑).
讨论
符合作者之前的发现8本研究表明,猪粉尘可激活全血t淋巴细胞在体外,如早期活化标记CD69的T细胞表达检测到。但是,当用与全血分离的PBMC孵育猪粉尘时,不激活T淋巴细胞。与全血相比,PBMC主要由淋巴细胞组成,而几乎没有粒细胞,只有少数单核细胞。为了进一步研究蚯蚓细胞和单核细胞等吞噬细胞是否可以影响T淋巴细胞的粉尘介导的活化,整个血液中的单核细胞和粒细胞的数量减少,这显着降低了粉尘活化T淋巴细胞的容量。因此,从猪限制容纳获得的有机粉尘只能在吞噬细胞存在下激活T淋巴细胞。此外,来自猪粉尘的血浆暴露了全血,即。条件性血浆诱导淋巴细胞活化。基于这些数据,目前的作者得出结论,灰尘诱导的t细胞激活需要吞噬细胞,它是由吞噬细胞释放的介质诱导的,而不是通过细胞与细胞之间的直接相互作用。
本作者以前发现暴露于猪粉尘后,炎症细胞(特别是中性粒细胞)的炎性细胞,尤其是中性粒细胞的数量显着增加体内.在暴露于猪粉尘之后,还发现了在BAL流体中发现TNF-α,IL-1,IL-6和IL-8的浓度增加体内3.,4在暴露于灰尘后,在上皮细胞和肺泡巨噬细胞上清液中在体外9,10..粒细胞也被证明会释放许多这些细胞因子,即。脂多糖(LPS)刺激后TNF-α,IL -1和IL-811.- - - - - -15.,单核细胞可产生TNF-α16.il - 1,15.,17.,18.和IL-1219..许多这些粒细胞和单核细胞衍生的细胞因子涉及淋巴细胞的活化,直接(IL-1,IL-6,IL-12)或间接(IFN-γ)。在本研究中,在条件血浆后发现高水平的IL-12和IFN-γ在体外全血暴露到灰尘。因此,在猪粉尘孵育过程中,吞噬细胞如粒细胞和全血细胞的单核细胞似乎释放细胞因子IL-12和IFN-γ,这可能对猪粉体引起的T淋巴细胞刺激具有重要性。似乎单核细胞似乎产生细胞因子,例如IL-12,其可以通过淋巴细胞如天然杀伤剂(NK)细胞诱导IFN-γ产生。
为了得出结论,T淋巴细胞的粉尘活化是必需的吞噬细胞。吞噬细胞似乎通过释放淋巴细胞活化细胞因子,例如白细胞介素-12和干扰素-γ。为了改善暴露于有机粉尘后对免疫反应的理解,需要研究从猪粉尘激活的外周血细胞以及来自粉尘的个体的支气管肺泡灌洗细胞的细胞内细胞因子释放体内.
- 收到了2001年3月26日。
- 接受2001年9月7日。
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