摘要GydF4y2Ba
暴露于猪分娩建筑物引起剧烈的气道炎症和淋巴细胞活化,通过支气管肺泡灌洗评估的。为了进一步阐明T细胞活化,本GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba研究焦细胞内细胞因子生产在暴露于猪屋的有机粉尘后。GydF4y2Ba
来自健康捐赠者的全血与猪粉尘,植物症,植物葡萄球菌素(阳性对照)或罗斯韦尔公园纪念学院1640培养基(阴性对照),以及生产细胞内干扰素(IFN)-γ,肿瘤坏死因子(TNF)-α,白细胞介素通过流式细胞术分析(IL)-4和IL-12。在T细胞(CD3 +,CD4 +,CD8 +),天然杀伤(NK)细胞(CD56 + CD16 +)和单核细胞(定义为CD14 +细胞)上,细胞对特异性细胞表面标志物进行双染色。GydF4y2Ba
猪尘全血孵育1 h后,CD14+细胞产生高水平的TNF-α和IL-12,而CD3+、CD4+、CD8+ t细胞和CD56+CD16+ NK细胞需要更长时间(22 h)才能产生IFN-γ和TNF-α。当将阻断IL-12受体的抗体加入猪粉尘培养的全血中,NK细胞产生的IFN-γ降低,CD3+细胞上的CD69表达降低。GydF4y2Ba
总之,本研究表明,猪尘可以,至少部分地,刺激吞噬细胞通过产生白细胞介素-12的活化天然杀伤细胞和T淋巴细胞。GydF4y2Ba
本作者以前表明,在猪限制设施中暴露于灰尘诱导T细胞的激活GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba,通过分析支气管肺泡灌洗获得的细胞来评估GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.作者还表明,T细胞的全血暴露于灰尘GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba以剂量和时间依赖的方式表达活化标记CD69,CD25和人白细胞抗原-DRGydF4y2Ba2GydF4y2Ba.血浆从与灰尘孵育24小时的血液中提取,GydF4y2Ba即。GydF4y2Ba“条件血浆”,诱导全血t细胞(CD3+)高表达CD69GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba.由于在吞噬细胞耗尽的血液中没有观察到t细胞上CD69的表达增加,而且由于在猪粉尘刺激的全血中检测到白细胞介素(IL)-12和干扰素(IFN)-γ的产生增加,作者认为,来自吞噬细胞的可溶性介质可能是淋巴细胞激活的原因。GydF4y2Ba
众所周知,肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-12等细胞因子能够诱导t细胞活化GydF4y2Ba4GydF4y2Ba,GydF4y2Ba5GydF4y2Ba.IL-12由活化的单核细胞产生,也可由其他抗原提呈细胞和中性粒细胞产生,对t细胞和自然杀伤细胞具有多效性作用GydF4y2Ba6GydF4y2Ba.本研究的目的是研究猪粉是否可以诱导吞噬细胞(CD14 +单核细胞)以产生细胞因子TNF-α和IL-12和/或T-和NK细胞,以产生TNF-α,IFN-γ和IL-4。此外,作者希望通过使用IL-12受体阻塞抗体来阐明IL-12在淋巴细胞活化中的作用。GydF4y2Ba
材料和方法GydF4y2Ba
主题GydF4y2Ba
Venous blood was collected from 10 (two males) nonallergic, nonsmoking, healthy subjects, with a mean age of 44 yrs (range 27–60). All subjects gave their informed consent and the study was approved by the Ethics Committee of Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden.
刺激与灰尘GydF4y2Ba
Dust was collected in a swine confinement building ∼1.5 m above the ground and dissolved in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Gibco Laboratories, Paisley, UK), sonicated for 10 min and diluted in whole blood to a final concentration of 100 µg·mL−1GydF4y2Ba.多克隆激活剂植物血凝素(PHA),作为T细胞和NK细胞分析的阳性对照,也溶解在RPMI 1640中,超声10分钟,在全血中稀释至10µg·mLGydF4y2Ba−1GydF4y2Ba.未经刺激的全血含有RPMI 1640作为阴性对照。GydF4y2Ba
表面标记物和细胞内细胞因子的染色GydF4y2Ba
For analyses of monocytes (CD14+ cells) (n=6), whole blood was incubated for 1 h with dust or RPMI 1640 in the presence of brefeldin A (Golgi PlugTM值GydF4y2Ba;pharingen, San José, CA, USA)。Brefeldin A抑制细胞内运输,这意味着在激活过程中产生的细胞因子被保留在细胞内(根据制造商的协议)。GydF4y2Ba
淋巴细胞分析(n=10),全血用含l -谷氨酰胺的RPMI按1:1稀释,与猪尘或PHA共孵育12小时,然后在1µg brefeldin A·mL血液中再孵育10小时GydF4y2Ba−1GydF4y2Ba.在37℃下在5%二氧化碳存在下进行所有孵育。GydF4y2Ba
刺激后,红细胞被裂解(PharmLyse;phingen)和染色缓冲液(含1%胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS))清洗。细胞按500×离心至颗粒状GydF4y2BaGGydF4y2Bafor 5 min, the supernatant was aspirated and cells (∼200×103.GydF4y2Ba)用100µL染色缓冲液稀释。加入各自的细胞亚群和/或激活标记物特异性单克隆抗体(Mab),孵育30分钟,在染色缓冲液中洗涤,然后加入Cytofix/Cytoperm solution (PharMingen)固定和渗透20分钟。用Perm/Wash溶液(PharMingen)清洗细胞,室温(RT)黑暗孵育10分钟。然后在500×离心5分钟GydF4y2BaGGydF4y2Ba.吸出上清液,将电池沉淀重悬于含有细胞因子特异性mAb的渗透溶液中,用于细胞内染色,在室温下在室温下孵育30分钟。用烫发/洗涤溶液(没有MAb)洗涤细胞,然后以500×离心5分钟GydF4y2BaGGydF4y2Ba.吸出上清液,并将细胞重悬于含有4%甲醛(Cellfix; Becton Dickinson公司,圣何塞,CA,USA)的PBS将细胞。然后将细胞通过流式细胞术分析。GydF4y2Ba
在第二个实验中(n=6),结合2.4E6单克隆抗体和2B10单克隆抗体(PharMingen)直接靶向IL-12受体β1亚基,用于阻断人IL-12受体GydF4y2Ba7GydF4y2Ba.阻断抗体或同型对照(小鼠免疫球蛋白GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和大鼠IgGGydF4y2Ba2AGydF4y2Ba;在尘埃孵育前1 h加入PharMingen)。然后用灰尘、PHA或RPMI培养细胞。分别用IL-12受体阻断单抗和不用IL-12受体阻断单抗研究T细胞和NK细胞产生的细胞因子以及T细胞CD69的表达。GydF4y2Ba
单克隆抗体和流式细胞仪分析GydF4y2Ba
采用亚组特异性荧光共轭单抗对细胞进行了表征。t细胞鉴定采用CD3、CD4、CD8-peridinin叶绿素蛋白(PerCP)偶联单抗(Becton Dickinson), NK细胞鉴定采用CD56+CD16+ - phycoythrin (PE)偶联单抗(Becton Dickinson)。通过正向和侧散射参数以及CD14-PerCP (Becton Dickinson)染色鉴定单核细胞。使用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗CD3单抗和pe偶联的抗CD69单抗(Becton Dickinson),通过CD3和早期激活标志物CD69双染色检测t细胞的激活情况。GydF4y2Ba
IFN-γ,IL-4和TNF-α特异性mAb从Becton Dickinson公司获得,并且IL-12特异性mAb从PharMingen公司获得。所有细胞内细胞因子特异性单克隆抗体是FITC结合。将细胞通过流式细胞术使用荧光激活细胞分选仪刀魂(Becton Dickinson公司)进行分析。GydF4y2Ba
不同亚群(CD3+、CD4+、CD8+ t细胞、NK细胞和单核细胞)中阳性细胞均有表达。GydF4y2Ba
统计数据GydF4y2Ba
结果表示为中位数(第25〜75百分位数)。比较用方差分析(ANOVA)来进行。的<0.05所有的p值被认为是统计学显著。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
与灰尘孵育1小时可诱导单核细胞产生大量TNF-α,GydF4y2Ba即。GydF4y2BaCD14+ peripheral blood cells (n=6), compared to nonstimulated control cells (p<0.001, fig. 1a⇓GydF4y2Ba).同样,与阴性对照相比,灰尘诱导单核细胞产生了显著的IL-12 (p<0.001,图1b)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
粉尘孵育1 h后,淋巴细胞未见细胞内细胞因子产生。经过时间动力学中试实验,孵育22 h,其中含短食素A孵育10 h。与阴性对照相比,在22小时的培养后,粉尘诱导NK细胞中IFN-γ水平显著升高(p=0.001,图2a)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).同样,与阴性对照相比,NK细胞产生更多的TNF-α (p<0.05,图2b)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).PHA(阳性对照)也能诱导NK细胞中高水平的IFN-γ和TNF-α (p<0.001,图2a和b)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
CD3+ t细胞、CD4+ t细胞和CD8+ t细胞在粉尘刺激后只产生低水平的IFN-γ、TNF-α和IL-4(表1)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba),尽管CD4 +和CD8 + T细胞的IFN-γ的产生增加显着(P <0.05和P = 0.05)。GydF4y2Ba
在有IL-12受体阻断抗体的情况下,NK细胞对粉尘诱导的IFN-γ的产生减少了6.3-1.8% (n=6, p=0.017),而在有对照抗体的情况下,IFN-γ的NK细胞产生没有差异(图3)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).CD69 expression on T-cells was reduced from 19.1% (17.1–28.2) to 12.2% (11.5–20.2) when whole blood was stimulated by dust in the presence of IL-12 receptor blocking antibodies (fig. 4⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
在本研究中,我们发现外周血全血单核细胞与猪舍灰尘孵育1小时后可刺激产生TNF-α和IL-12。在此早期,与尘埃孵育后,淋巴细胞未见细胞内细胞因子的产生。然而,正如Lertmemongkolchai的调查结果所示GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba8GydF4y2Bat淋巴细胞和NK细胞与灰尘共同孵育22小时后,均产生IFN-γ和低水平的TNF-α和IL-4。此外,阻断IL-12受体可以抑制粉尘诱导的NK细胞IFN-γ的产生以及t细胞的活化。GydF4y2Ba
全血粉尘刺激的时间动力学研究发现,1 h的培养足以诱导单核细胞产生TNF-α和IL-12。一个以前的报告GydF4y2Ba9GydF4y2Ba也表现出了快速IL-12产生由单核细胞用克氏锥虫刺激后。The present authors previously found 24 h of incubation to be optimal with regard to T-cell activation by swine dust. In the present study, the incubation was reduced to 22 h, with only 10 h brefeldin A, due to the toxicity of this substance.
目前的作者之前曾报道过,灰尘不能激活吞噬细胞耗尽的外周血中的t细胞GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba.然而,从尘埃培养的全血中分离出来的血浆,GydF4y2Ba即。GydF4y2Ba条件血浆,并在夜间添加到外周血单个核细胞中,能够高度诱导t细胞(CD3+)上的CD69表达。这种条件血浆含有高水平的IL-12和IFN-γ,可能是由吞噬细胞在刺激下释放的。因此,IL-12可能是有机粉尘激活淋巴细胞所需的成分之一。这一发现支持了这一观点,即IL-12是脂多糖(LPS)诱导NK细胞活化所必需的,而在用LPS刺激的单核细胞耗尽细胞培养中没有发现IL-12GydF4y2Ba10GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
In the present study, whole blood was preincubated for 1 h with IL-12 receptor blocking Mabs. Used in combination, these two Mabs have an inhibitory effect on the IL-12-mediated functions7GydF4y2Ba.当用IL-12受体阻塞抗体预孵育血液时,发现NK细胞的IFN-γ的产生显着降低。由于低细胞IFN-γ水平,难以评估对T细胞IFN-γ产生的任何影响。然而,与IL-12受体阻断抗体的预孵育血液显然降低了T细胞的活化,从降低的CD69表达判断。GydF4y2Ba
单核细胞识别猪粉尘抗原的一种机制可能是GydF4y2Ba通过GydF4y2BaLPS的CD14受体GydF4y2Ba11GydF4y2Ba,而已知灰尘中含有少量LPSGydF4y2Ba12GydF4y2Ba.有趣的是,人类T淋巴细胞的活化由LPS已经显示依赖于单核细胞,和IL-12是重要的共刺激因素之一GydF4y2Ba13GydF4y2Ba.在本研究中,单核细胞在与猪粉尘孵育后迅速产生TNF-α和IL-12,但当用LPS刺激时,未发现不同的IL-12产生(数据未显示)。因此,与LPS的其他组分对单核细胞的有机粉尘刺激也很重要。GydF4y2Ba
总之,已经表明有机粉尘可以刺激CD14 +细胞中的白细胞介素-12产生,以及在T-和天然杀伤细胞中产生的干扰素-γ产生。在灰尘和白细胞介素-12阻断抗体存在下,在天然杀伤细胞中降低干扰素-γ产生,如T细胞上的CD69表达。为了澄清机制GydF4y2Ba在GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba人类T细胞和自然杀伤细胞的激活还需要进一步的研究,包括健康志愿者接触猪粉尘前后支气管肺泡灌洗液细胞和外周血细胞的细胞因子分析。GydF4y2Ba
- 收到了GydF4y2Ba2002年3月12日。GydF4y2Ba
- 接受GydF4y2Ba2002年4月23日。GydF4y2Ba
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