摘要
目前尚不清楚肺移植后的睫状体功能是否正常。我们的目的是研究儿童肺移植术后气道吻合口上方和下方以及周围气道上皮的纤毛功能和超微结构。
我们利用高速数字视频成像和透射电镜超微结构研究了睫状体搏动频率(CBF)和搏动模式,10例囊性纤维化(CF)和10例非化脓性肺病(NSLD)患儿肺移植受者气道吻合口上方和下方以及外周气道的支气管上皮。
与吻合口下方的上皮相比,CF组吻合口上方的上皮显示CBF降低(中位数(四分位间距):10.5(9.0–11.4)Hz与7.4(6.4 - -9.2)赫兹;p<0.01)和运动障碍增加(中位数(IQR): 16.5 (12.9-28.2)%与42.2 (32.6–56.4)%; p<0.01)。在CF组和NSLD组中,与吻合口上方的上皮相比,吻合口下方的上皮显示出明显的超微结构异常(移植后中位持续时间为7-12个月)。
纤毛功能障碍是儿童CF肺移植受者固有气道上皮的一个特征。CF和NSLD肺移植术后数月,气道吻合口下方的上皮细胞均表现出深刻的超微结构异常。
肺移植是一种被接受的治疗选择与终末期肺病的儿童。与其他实体器官移植相比,儿童肺移植受者的总体生存率仍然较低[1].根据最近的报告[1],在肺移植后的第一年内,几乎有一半的死亡可归因于感染。感染也可能在闭塞性细支气管炎综合征(BOS)的发病机制中发挥作用,这是肺移植后5年死亡的主要原因[2- - - - - -5].
覆盖呼吸道表面的纤毛上皮形成一种免疫活性的天然屏障,以抵御吸入的病原微生物的侵袭和损伤。上皮由气道表面液体排列,其中纤毛以10-14赫兹的频率跳动,清除黏液和被困的病原体。这个过程称为粘液纤毛清除[6,是肺防御的重要因素。受损的粘液纤毛清除和呼吸道上皮损伤导致感染和炎症易感性增加。
虽然从两种动物[7,8]和人类[9,10研究表明,肺移植受者可能会受到损害,特别是在早期移植后期,这种损害的原因远未完全理解。有限的证据表明可能的上皮超微结构异常[10[气道粘液流变的改变[7,11在肺移植术后早期。虽然有少数研究检查了成人肺移植受者的睫状搏动频率(CBF),但一些作者发现移植支气管的CBF明显低于本地支气管[12不能被他人复制[9,13,14].迄今为止,没有研究对肺移植后儿童的纤毛功能进行检查,也没有先前的儿童或成人研究评估肺移植后纤毛搏动模式。除了CBF之外,纤毛搏动模式的评估最近被认为是评估纤毛功能的重要部分,因为纤毛在剧烈运动的情况下搏动频率可能保持不变[15,16].
本研究的目的是评估儿童肺移植受者气道吻合处近端呼吸上皮的纤毛功能和详细的超微结构,并将其与气道吻合处远端和周围气道的纤毛功能和超微结构进行比较。
方法
主题
超过2年(2007-2009)20岁儿童(年龄<18岁),在伟大的肺疗检查后受到肺部移植的肺部街道(英国伦敦)的肺部移植,并收集了人口统计和临床细节.所有受试者接受了pH /阻抗研究,以检查病理胃肠道反流的证据。根据欧洲呼吸学协会指南进行柔性支气管镜检查[188bet官网地址17]. 在直视下从气道吻合口上方2-3 cm和下方2-3 cm处取上皮刷,在荧光镜筛查下从周围气道取上皮刷,所有病例均确认刷位于肺的最边缘;详细方法见在线补充材料。进行支气管肺泡灌洗(BAL),并检测液体中的各种病原体,包括细菌、分枝杆菌、真菌和病毒。BAL也使用油红O染色技术进行处理,以估计富含脂质的巨噬细胞的比例,比例>10%被认为是显著的。获取经支气管肺活检样本并进行组织病理学研究以寻找排斥反应的证据。在采集支气管上皮样本时,受试者至少有6周没有并发呼吸道感染。
该研究方案由儿童健康研究所和大奥蒙德街医院研究伦理委员会批准。参加活动的儿童均获得家长的书面知情同意。
CBF和搏动模式
详细的方法在在线补充材料中给出。使用数字高速视频显微镜系统测量支气管上皮条带上的CBF并评估搏动模式,如前面描述的鼻上皮刷[18,在4-6小时内。高速视频图像以盲法分析。图像由第二名观察者(a . Rutman)重新分析,第二次被原观察者(B. Thomas)弄瞎。
实验系统允许睫状体跳动模式在三个不同的平面上进行评估:侧面轮廓,直接对着观察者跳动,以及直接从上方跳动[18].逐帧分析了拍子周期中纤毛所走的路径。这是特征,并与数字高速视频分析中看到的正常节拍模式进行了比较[18].运动障碍被定义为一种异常的搏动模式,包括:搏动幅度减少,搏动模式僵硬,不能沿纤毛轴长度弯曲,闪烁或抽搐的运动,以及静止的纤毛。运动障碍指数计算为样本中运动障碍纤毛的百分比(运动障碍读数的数量/样本×100的总读数)。静止指数计算为样本中静止纤毛的百分比(静止读数数/样本×100的总读数数)[19].利用投影到电脑屏幕上的纤毛上皮边缘的数字侧面图像,用一微米来校准和测量纤毛的长度。
透射电子显微镜法
使用透射电子显微镜研究了支气管上皮条带的详细超微结构,如前面描述的鼻上皮刷[20.].在线补编中给出了详细的方法。以盲法评估纤毛上皮的上皮和纤毛的超微结构变化。纤毛细胞、非纤毛细胞、黏液细胞和死亡细胞的数量占所有细胞的百分比。通过计算所有检查细胞中纤毛缺失、细胞突起、胞浆起泡和线粒体损伤的纤毛细胞的百分比来评估上皮的破坏和损伤。通过检查纤毛微管和动力蛋白臂缺损的纤毛超微结构来评估单个纤毛的损伤,并计算微管或动力蛋白臂缺损的纤毛的百分比。细胞内纤毛定位,定义为通过来自单个纤毛细胞的中央对纤毛微管的线角度的标准偏差,如前所述确定[21].
统计分析
样本量的计算基于CBF作为主要结果测量。年代eyboldet al。[22]研究了新鲜切除的绵羊气管表面液速,发现CBF增加16%与气管表面液速增加56%相关。因此,我们假设2hz的CBF绝对值均值差具有潜在的生物学意义。据估计,要检测两组间2hz(标准差为1hz)的平均CBF差异,置信区间为95%,幂次为80%,每组的样本量为6。采用GraphPad Prism 5进行统计学分析。非参数数据被描述为中位数(四分位范围(IQR))。组间比较最初采用弗里德曼检验,事后分析采用邓恩方法。P <0.05为差异有统计学意义。两位观察员(B. Thomas和A. Rutman)在测量CBF(类间相关性0.94)和运动障碍指数(类间相关性0.93)方面的一致性非常好。重复性(观察者内的一致性)也很好(CBF的类间相关性为0.94,运动障碍指数为0.99)。
结果
人口学和临床细节,包括pH/阻抗研究,BAL和经支气管活检的结果,给出了表1.所有经支气管活检标本均未发现急性细胞排斥反应。在研究的20名儿童中,有2名儿童被排除在纤毛功能研究和上皮超微结构分析之外,他们在BAL中有致病性微生物。对18例(囊性纤维化(CF)组和非化脓性肺疾病(NSLD)组各9例)患儿的CBF和搏动模式进行了研究,并给出了结果图1和2在线补充材料中表格S1和S2。
CF组中位(IQR) CBF明显降低(7.4 (6.4-9.2)Hz),低于(10.5 (9.0-11.4)Hz;弗里德曼(p < 0.01)图1一个).纤毛搏动模式分析显示,吻合口上方上皮内纤毛运动异常的比例(42.2(32.6-56.4)%)高于吻合口下方(16.5(12.9-28.2)%)和外周气道(13.9 (6.5-16.6)%);弗里德曼(p < 0.01)图1 b).吻合口上方上皮细胞静止指数(4.1(3-5.9)%)明显高于外周气道(0%)(Friedman p<0.001;图1 c).NSLD组中,气道吻合口上、下上皮与外周气道的CBF、运动障碍指数、静止指数无显著差异(图2).中央(吻合口上、下)和周围气道纤毛的中位IQR长度分别为5.8 (5.4 ~ 6.2)μm和6.0 (5.6 ~ 6.2)μm,差异无统计学意义(p=0.17)。
CF组和NSLD组各1名儿童的支气管刷拭被排除在上皮超微结构分析之外,因为在支气管肺泡灌洗液中发现了一种致病性生物。CF组和NSLD组的另外两名儿童的样本不足以通过透射电镜进行评估。因此,对每组7例患儿的标本进行透射电镜观察。每个研究样本的中位(IQR)上皮细胞数为380(276-664)。结果总结在表2和3.(以及在线补充材料中的表S3和S4)和电子显微照片示例见图3和4. 在CF组和NSLD组气道吻合口下方的纤毛上皮中均观察到显著的超微结构异常。与上述上皮相比,气道吻合和周围气道吻合,CF组吻合口下方的上皮纤毛细胞比例显著减少(p<0.05),纤毛细胞丢失(p<0.05)和纤毛微管缺陷(p<0.05)比例显著增加。此外,与气道吻合口上方的上皮相比,CF组吻合口下方的上皮中钩离细胞、死亡细胞、从细胞表面挤出的细胞、细胞质起泡细胞和线粒体损伤细胞的比例显著增加(p<0.01)。此外,CF组气道吻合口下方上皮的睫状体定向障碍明显高于吻合口上方上皮(p<0.05)。
在NSLD组中,低于气道吻合的上皮表现出纤毛细胞比例的显着降低(P <0.01),并且未剥离细胞,死细胞,纤毛细胞的比例显着增加,来自纤毛的损失,细胞挤出细胞表面,细胞质细胞质,细胞质,具有线粒体损伤的细胞和纤毛与微仔病毒缺陷(P <0.01)与上皮吻合上方相比。与气道吻合上方的上高于上高于气道吻合术(P <0.05)时,在气道吻合术和外围气道的上皮下观察到显着更高的睫状体念念。低于气道吻合术的上皮也表现出粘液细胞比例的显着增加与上述吻合术和外周气道的比例(P <0.05)。
考虑到术后即刻正常的上皮细胞愈合过程可能对上皮细胞超微结构变化的影响,我们对数据进行了重新分析,排除了两例患者(每组),他们在移植后的前4个月内进行了支气管刷拭。这并没有改变气道吻合口下上皮细胞明显的上皮超微结构异常(表S3和S4在线补充材料)。再分析上皮超微结构数据,排除BAL中>10%脂质负载巨噬细胞的受试者(n=7),也没有改变气道吻合口下上皮的显著上皮超微结构异常。
讨论
本研究显示,儿童CF肺移植受者气道吻合口上方上皮存在明显的纤毛功能障碍。然而,儿童NSLD肺移植受者的天然气道纤毛功能与移植肺的相当。我们的数据表明,外周血管纤毛的长度和跳动频率与移植肺的中央气道纤毛的长度和跳动频率没有差异。我们还发现,CF和NSLD儿童肺移植受者在移植后的几个月,气道吻合口下方的上皮细胞中仍存在深刻的上皮超微结构异常。这是一个值得关注的问题,因为众所周知,呼吸道上皮损伤容易导致继发感染,这是肺移植患者的一个主要问题。
据我们所知,这是第一项评估儿童肺移植受者睫状体功能(搏动频率和搏动模式)和上皮超微结构的研究。前作者[9,12,14]研究了成人肺移植受者的CBF,除一项研究外,所有研究均报道了本地和移植支气管的CBF差异[12].受试者特征、移植指征、移植类型以及CBF样本采集和分析方法的异质性,使得与我们的研究结果难以直接比较。我们的研究是所有肺移植研究中独一无二的,因为我们在测量CBF的同时评估了心跳模式。最近出现的高分辨率数字高速视频成像技术使这成为可能[18,使我们能够通过在不同平面逐帧观察纤毛搏动周期来评估纤毛的准确搏动模式。使用这种方法,我们以前已经证明,纤毛在某些条件下可能有正常的跳动频率,尽管有明显异常的跳动模式[20.,正常的睫状突跳动频率并不一定等于正常的睫状突功能。我们发现CF移植受者的自然气道上皮中搏动频率显著降低,纤毛运动障碍增加,这与R含铅et al。[14结果显示,在他们研究的6名成年CF患者的天然气道上皮中位(IQR) CBF为10.8 (8.8-11.1)Hz。虽然慢性炎症通常存在于天然CF气道上皮,但已知会导致纤毛功能障碍和超微结构缺陷[23[天然CF上皮中的基础睫状剂功能障碍的精确机制仍然确定。与中央航空公司的纤毛相比,有一个建议,周边航空公司的纤毛是较短的[24以较慢的频率拍击[25,26].我们的数据与这一建议相悖,并与Y的研究结果一致阿格et al。[27不同水平的气管支气管树的CBF无差异。
对肺移植后上皮细胞超微结构的有限的动物和人类研究结果还不确定[10,28].在这项研究中,我们系统地量化了天然气道和移植肺的呼吸上皮的超微结构异常。我们在移植后几个月观察到的上皮完整性的严重丧失和气道吻合口下方上皮的显著超微结构异常,可能是多因素的因果关系。器官摘取、异体移植保存、再灌注和急性细胞排斥反应等过程中的损伤均可引起上皮损伤。虽然没有详细研究,但由于移植造成的断流和淋巴中断、可能损害伤口愈合的糖皮质激素等药物,以及由于胃食管反流而吸入呼吸道[29都与上皮损伤有关。与吻合口下方的气道相比,周围气道上皮完整性的相对保存表明,局部机制如血管断流和/或淋巴中断可能有影响,尽管这仍有待确定。
我们在气道吻合口下观察到的明显的上皮超微结构异常很可能对功能产生重要影响。首先,这可能导致粘液和周液的定量和定性改变,这可能导致粘液纤毛清除受损,尽管CBF正常。特别有趣的是,我们在移植肺的上皮中观察到纤毛定向障碍的增加。类似程度的定向障碍以前被描述为原发性睫状体运动障碍的一种变体[21].其次,也许更重要的是,这些上皮异常可能会增加病原菌对同种异体移植物定植的风险。事实上,细菌假单胞菌已被证明优先粘附于受损、中断和再生的气道上皮区域[30.[两个CF中的同种异体移植治疗2,31,32]及非cf [31,32肺移植受者。越来越多的证据表明,用微生物等异体移植物定殖的潜在作用假单胞菌[2,31,32] 和曲霉属真菌[5在BOS的发展中。
我们研究的主要限制是其横截面设计;因此,需要进一步研究睫状函数和上皮超微结构中的主题重复性和纵向变化。我们的数据产生了未来研究需要解决的几个重要问题。解开天然CF气道上皮中睫状体功能障碍的原因,下皮超微结构异常,低于气道吻合术及其对粘液,百合液流体和粘液间隙的潜在影响,对未来研究构成重大挑战。动物模型中的建议,使肺移植过程中的血频刺激组织可能会降低粘液流变和气道上皮的异常[7],值得关注,未来的研究可能会评估不同手术技术对同种异体移植物上皮超微结构的影响,旨在尽量减少去神经、去血管和淋巴阻塞的影响。尽管之前的研究[11,28]表明上皮超微结构的异常后移植可能早在3 - 4个月移植后,恢复我们的数据不符合这些观察,只有长期前瞻性研究将决定时间的同种异体移植物上皮超微结构变化后移植。这些信息可指导治疗决定,如预防性抗菌素的使用时间。尽管我们的研究有局限性,我们对纤毛功能和上皮细胞形态的测量是高度可重复的,气道吻合口下方上皮细胞超微结构异常的程度是惊人的,很可能是临床上重要的。
综上所述,我们的研究为儿童CF肺移植受者的天然气道纤毛功能障碍以及CF和NSLD儿童肺移植受者气道吻合口下方明显的上皮损伤提供了证据。异体移植上皮受损的潜在主要后果是增加了异体移植气道微生物定植的风险,这可能在BOS的发展中发挥作用。
致谢
我们感谢参与这项研究的孩子和他们的家庭;向英国伦敦大奥蒙德街儿童医院(Great Ormond Street Hospital for Children)的移植科专科护士提供帮助,了解患者的临床特征;G.M. Doherty(大奥蒙德街儿童医院)帮助招募病人;J. Bankart提供统计分析方面的咨询,M . G. Williams和N . Baker提供实验室的技术援助(英国莱斯特所有莱斯特大学)。
脚注
这篇文章有补充材料可从www.www.qdcxjkg.com
利益陈述书
没有人申报。
- 收到了2011年10月8日。
- 接受2012年1月21日。
- ©2012人队