抽象的gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞是在过敏性炎症中相关的氧化剂敏感细胞。本研究旨在检查抗氧化剂的影响gydF4y2BaN -gydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BalgydF4y2Ba-半胱氨酸(NAC)对人分离的嗜酸性粒细胞组成性和细胞因子延迟凋亡的影响。gydF4y2Ba
通过磁分离系统从健康献血者的血液中纯化出人嗜酸性粒细胞。细胞荧光法检测细胞凋亡和谷胱甘肽水平,电泳迁移率-位移法检测NF -κB结合活性。gydF4y2Ba
24小时培养后人嗜酸性粒细胞的自发性凋亡率,如膜蛋白-V阳性染色评估,平均值±SEM 48.2±1.4%,n = 5.粒细胞 - 巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF; 10 NG·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)将细胞凋亡降低至19.4±1.8%,N = 5. NAC(5 mm)抑制自发细胞凋亡(33.6±2.7%,n = 5),但在GM-CSF存在下增加凋亡(30.9±1.5%,n = 5)。NAC(5 mm)还增加了肿瘤坏死因子(TNF)-α存在下凋亡率(10ng·mlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和白细胞介素-5(5 ng·mlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。NAC(5 mm)增加嗜酸性粒细胞酸糖酸含量。通过NaC抑制了GM-CSF和TNF-α诱导的嗜酸性粒细胞NF-κB结合活性的增加。gydF4y2Ba
总之,gydF4y2BaN -gydF4y2Ba乙酰半胱氨酸通过抑制结构性凋亡,但逆转炎症细胞因子在人嗜酸性粒细胞中产生的生存效应来调节嗜酸性细胞凋亡。gydF4y2Ba
人嗜酸性粒细胞的活化和长期存活是过敏性炎症的突出特征gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.活化的嗜酸性粒细胞释放多种促炎介质,包括氧化剂gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,硫醇敏感的氧化还原调节在嗜酸性粒细胞功能中似乎很重要gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba.有趣的是,氧化剂应激也涉及促进不同细胞类型的细胞凋亡gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba.因此,抗氧化药物可能调节嗜酸性细胞凋亡,并可能在变应性炎症的药理学治疗中发挥作用gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
虽然最初是作为黏液溶解剂使用,gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BalgydF4y2Ba-Cysteine(NaC)是一种硫醇化合物,其直接用作自由基清除剂和降低的谷胱甘肽(GSH)合成中的前体,从而保护细胞免受氧化剂损伤gydF4y2Ba7gydF4y2Ba.NAC已被证明对与氧化应激相关的肺部疾病有益gydF4y2Ba8gydF4y2Ba.目前作者实验室的最近研究还证明了NAC在过敏模型中发挥抗炎作用的能力gydF4y2Ba9gydF4y2Ba并抑制来自活化的人嗜酸性粒细胞的产生氧化物种gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba.本研究解决了是否可以通过临床使用的抗氧化剂如NaC调节自发和细胞因子延迟的嗜酸性粒细胞凋亡。粒细胞 - 巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF),肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-5被选为延长人嗜酸性粒细胞的炎症细胞因子gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
人嗜酸性粒细胞的分离gydF4y2Ba
从健康献血者的肝素中获得人血,并通过标准的实验室程序分离多形核白细胞gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba.然后通过使用磁性细胞分离系统(Miltenyi Biotec,Bergisch-gladbach,德国)的抗CD16涂覆的磁性微珠耗尽嗜酸性粒细胞,如前所述gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba.所有实验中嗜酸性粒细胞纯度(May-Grünwald Giemsa染色)为>95%,存活率(排除台班蓝)为>95%。该调查得到了机构伦理委员会(西班牙巴伦西亚大学诊所医院)的批准,并获得了所有捐赠者的知情同意。gydF4y2Ba
细胞毒性评估gydF4y2Ba
与细胞裂解物值相比的乳酸脱氢酶(LDH)释放的百分比作为通过使用市售的比色测定作为细胞损伤的标记物gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
嗜酸性粒细胞凋亡的细胞杂氟量分析gydF4y2Ba
采用碘化丙啶(PI)染色法检测细胞凋亡。简而言之,新鲜分离的嗜酸性粒细胞以2×10的浓度重悬gydF4y2Ba6gydF4y2Ba cells·mL−1gydF4y2Ba在gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺(32 mM),青霉素(100 U·mL)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba) /链霉素(100μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba),25毫米gydF4y2BaNgydF4y2Ba——[2-hydroxyethyl]哌嗪gydF4y2BaNgydF4y2Ba' - [2-乙磺酸]和10%胎牛血清补充RPMI。总共,在含有150μL补充RPMI的96孔板中培养50μl(〜100,000个细胞)的细胞悬浮液在不存在和存在10ng·ml的情况下gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba重组人(RH)GM-CSF并用NAC(0.5和5mm)或其载体处理。将细胞培养≤48h,然后用冰冷的70%乙醇透露渗透。此后,在用50μg·ml标记之前,将细胞在37℃下在37℃下在37℃下温育30分钟,然后用50μg·mL键入磷酸盐缓冲盐水(PBS)gydF4y2Ba−1gydF4y2BaPi在4°C下过夜。通过流式细胞术评估低倍化DNA区域内的细胞的比例(Cyan TM ADP流式细胞术分析仪; Dako Denmark A / S,Glostrup,Denmark)。在表现出凋亡形态的细胞的基础上,通过光学Panoptic DC染色(PanReac Quimica Sa,Barcelona,Barcelona,Barcelona,Barcelona,Barcelona,Barcelona,Barcelona,Barcelona,Spain)来确认细胞凋亡。gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba核和细胞质冷凝。gydF4y2Ba
在额外的实验中,在孵育24小时后进行,通过根据制造商的指示(Annexin-V-FluoS; roche应用科学,巴塞罗那,西班牙,巴塞罗那,西班牙),通过流式细胞仪进行细胞蛋白和Pi进行凋亡的评估。细胞(1×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)用CyAn TM ADP流式细胞仪(Dako Denmark a /S)分析,分化为:早期凋亡(annexin- v阳性,pi阴性);晚期凋亡和/或坏死(annexin-V-和pi阳性);或存活的非凋亡细胞(annexin-V和pi阴性)。在这些实验中,分别检测有无rhGM-CSF (10 ng·mL)时的细胞凋亡情况gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)在用NaC(5mm)处理的细胞中,其异构体gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰-gydF4y2Bad -gydF4y2Ba半胱氨酸gydF4y2Ba(D.gydF4y2Ba南汽;5毫米)或他们的车辆。在其他实验中,TNF-α (10 ng mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和IL-5 (5ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)检查有无NAC (5mm)。如前所述,GM-CSF、TNF-α和IL-5的浓度可产生显著的嗜酸性粒细胞生存效应gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba.在目前的研究中,NAC的浓度来自于那些抑制人嗜酸性粒细胞组成性凋亡的物质gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.在其他实验中,吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC;300 μM)的非巯基抗氧化剂gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba.在评估抗氧化剂对细胞因子诱导的存活的实验中,在细胞因子之前从30分钟出现抗氧化剂直至实验结束。gydF4y2Ba
测量谷胱甘肽水平gydF4y2Ba
由于汞橙染色与谷胱甘肽的生化测定密切相关,因此采用基于巯基干反应染色汞橙的流式细胞术测定非蛋白硫醇,而不是标准的生化测定gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba.细胞(3×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)在37℃下在37℃下在不存在和存在下在NAC(5mm)的情况下在补充的RPMI中温育30分钟,gydF4y2BadgydF4y2Ba-NAC(5 mm)或PDTC(300μm)。通过将管放入冰中终止实验,然后离心(300×gydF4y2BaggydF4y2Ba,5 min). Cell pellets were resuspended in ice-cold mercury orange solution and, after 5 min, stained cells were centrifuged (300×ggydF4y2Ba, 5分钟),PBS重悬,流式细胞术分析(Dako Denmark A/S)。在另外的实验中gydF4y2BaNgydF4y2Ba研究 - 研究 - 乙基马来酰亚胺(1mM,60分钟),硫醇烷基化剂进行比较gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
核因子-κB结合活性的测定gydF4y2Ba
如前所述由细胞制备核蛋白质提取物gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.按照制造商的说明加工等量蛋白质(10µg)的核提取物(DIG gel shift kit;勃林格曼海姆和恩佐诊断公司,曼海姆,德国)。电迁移率位移测定按前面概述的方法进行gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba.简言之,核提取物在3 μg聚脱氧胞苷酸和商业双链的存在下孵育gydF4y2Ba32.gydF4y2BaP-标记的寡核苷酸(Promega,Madison,Wi,USA)编码核因子(NF)-κB共有序列(5'-AgttgagGGGACTTCCCCGC-3')。通过竞争确定结合的特异性,具有200倍过量的未标记的双链寡核苷酸。对于超滤实验,将抗p65抗体(Santacruz生物技术,Santa Cruz,Ca,USA)加入到结合反应中。DNA-蛋白质复合物电泳分离并进行放射自显影。gydF4y2Ba
药物和解决方案gydF4y2Ba
NAC和PDTC是从Sigma-Aldrich获得的(西班牙马德里)获得。NAC的立体异构体,gydF4y2BadgydF4y2Ba-NAC是从Research Organics Inc.获得的(俄勒冈州克利夫兰)获得。以活性物质的摩尔浓度表示药物浓度。将NaC溶解在去离子水中并根据需要(pH7.4)在适当的缓冲培养基中稀释。在米利 - Q(Millipore Iberica,Madrid,Spain)系统上纯化的水被净化。gydF4y2Ba
结果统计分析gydF4y2Ba
数据以平均值±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ban实验。通过非线性回归分析(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)从浓度抑制曲线计算中值抑制曲线。结果由ANOVA进行结果,然后使用成对比较适当地进行Bonferroni测试或配对T检验。P <0.05时接受了意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
NAC无细胞毒性gydF4y2Ba
NAC浓度≤10 mM时,LDH释放量为2.6±0.4和2.8±0.6%,无明显的细胞毒性;每组N = 3)。gydF4y2Ba
NAC对嗜酸性粒细胞凋亡的影响gydF4y2Ba
在48-H观察期间,培养中嗜酸性粒细胞的自发存存遭受了时间依赖性衰减(图1AgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。NAC(0.5-5 mm)通过抑制通过PI染色细胞中的DNA碎片评估的组成嗜酸性粒细胞凋亡来增强嗜酸性粒细胞的存活。在GM-CSF存在下,培养的嗜酸性粒细胞的可行性显着增加;然而,NAC在这些实验条件下降低了嗜酸性粒细胞的存活率(图1BgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。通过使用快速Panoptic染色的培养的嗜酸性粒细胞(未示出)通过形态标准证实了这些凋亡率在凋亡率和GM-CSF和NAc的存在中的变化。gydF4y2Ba
在额外的实验中,使用培养后的嗜酸性粒细胞的膜蛋白-V和PI染色测量细胞凋亡24小时。NAC(5 mm)在没有GM-CSF的情况下减少凋亡(annexin-V阳性)嗜酸性粒细胞的百分比,但在GM-CSF存在下增加这些数字(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。用异构体获得类似的效果gydF4y2BadgydF4y2Ba-NAC(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。NAC的代表性实验如图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba.NAC早期(annexin-V阳性,Pi阴性细胞:从24.5±1.5〜17.2±2.6%)和晚期(annexin-V阳性,Pi阳性细胞:从23.7±0.4〜16.3±1.8%)凋亡细胞在没有GM-CSF的情况下,早期增加(annexin-V阳性,Pi阴性细胞;从12.7±1.6至20.3±1.2%)和晚期(annexin-V阳性,pi阳性细胞:来自6.8±0.6至10.6±0.9%)在GM-CSF存在下凋亡细胞(每组n = 5,P <0.05)。对于PI和Annexin-V染色的细胞获得的结果与图1所示的数据一致gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
TNF-α(10 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)在24小时的培养物中还增强了嗜酸性粒细胞的存活(膜蛋白-V阳性细胞在没有和存在TNF-α的情况下从43±4〜26±3%下降; N = 3,P <0.05)。TNF-α的这种存活效果在NAC的存在下(36±5%的TNF-α,5 mm NAC; n = 3,P <0.05)。在IL-5存在下的额外实验(5 ng·mlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在NAC和NAC的作用下,IL-5的存活作用被逆转gydF4y2BadgydF4y2Ba-NAC(图2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。非硫醇抗氧化剂PDTC (300 μ M)也可增加GM-CSF的凋亡(38±2%;n = 3, p<0.05)和IL-5(39±3%;N = 3, p<0.05)。gydF4y2Ba
NAC增强嗜酸性粒细胞谷胱甘肽gydF4y2Ba
NAC (5mm)增加了嗜酸性粒细胞中谷胱甘肽的含量,通过流式细胞仪测量(图4)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2BadgydF4y2Ba-NAC,NAC的代谢无活性立体异构体,增加嗜酸性粒细胞谷胱甘肽与与NAC相似的程度,而PDTC未在嗜酸性粒细胞中增加葡萄酮含量(图4gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
NAC抑制NF-κB活性gydF4y2Ba
将人嗜酸性粒细胞暴露于GM-CSF(10ng·mlgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)或TNF-α (10 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)导致NF-κB结合活性增加,而在nac处理的嗜酸性粒细胞中NF-κB结合活性显著降低(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
细胞凋亡涉及炎症的分辨率,以及许多gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba研究表明,发炎遗址存在的炎症介质阵列增强了人粒细胞的存活率gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba.诱导细胞凋亡的许多药剂是细胞氧化代谢的氧化剂或刺激剂,而许多凋亡抑制剂显示出抗氧化性能gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba.硫醇抗氧化剂如NAC已被证实能抑制细胞凋亡gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba在不同的细胞类型中gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba.特别是,据报道,NAC(1-10mm)抑制自发性细胞凋亡以及人嗜酸氢粒细胞中的嗜钠和砷酸钠gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.这些发现在本研究中得到证实,NAC (0.5 - 5mm)抑制了培养≤48 h的嗜酸性粒细胞的自发凋亡。gydF4y2Ba
有趣的是,当NAC加入到与GM-CSF孵育的嗜酸性粒细胞中以延长其寿命时,发现NAC (0.5-5 mM)的效果相反,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba增强的细胞凋亡。由于NAC(≤10mm)没有损伤嗜酸性粒细胞,细胞毒性没有参与这种促凋亡效果。据报道,延伸嗜酸性粒细胞存活的另一个炎症细胞因子是TNF-α,部分地部分地通过GM-CSF的释放介导其效果gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba和IL-5通过不同的信号通路gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba.关于GM-CSF,目前的作者发现TNF-α和IL-5的生存效应在NAC存在时被逆转为促凋亡效应。gydF4y2Ba
因此,NAC似乎通过抑制组成型和诱导的细胞凋亡来调节人嗜酸性粒细胞中的凋亡,但增强嗜酸性粒细胞的凋亡,所述嗜酸性粒细胞凋亡,所述嗜酸性粒细胞凋亡,所述嗜酸性粒细胞对不同炎症细胞因子的存活作用,如GM-CSF,TNF-α和IL-5。由NAc增加凋亡的可能的解释可以是与其自氧化相关的增加的氧化应激,如人中性粒细胞高浓度的NAC(25mM)gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba.然而,在当前研究中发现嗜酸性粒细胞谷胱甘肽含量的增加在用NaC(5mm)孵育嗜酸性粒细胞之后;因此,氧化剂负担的增加不是对细胞因子处理的嗜酸性粒细胞观察到NAC的促凋亡作用的可能解释。在额外的实验中,NAC的代谢无活性立体异构体,gydF4y2BadgydF4y2Ba-NAC被发现产生与NAC相似的效果,包括增加嗜酸性谷胱甘肽。虽然出乎意料,但这一结果与类似的发现是一致的gydF4y2BadgydF4y2Ba-NAC培养神经元gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba和血管平滑肌gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba细胞,并且可能是由于细胞外胱氨酸对半胱氨酸的减少,然后将其有效地转移到细胞中gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba.PDTC,一种非硫醇抗氧化剂gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba展示不增加嗜酸性粒细胞谷胱甘肽,也导致对细胞因子暴露的嗜酸性粒细胞的促凋亡作用,类似于NaC引起的那些。这些发现表明,直接抗氧化剂,根本清除效应,而不是抗氧化糖硫酰乙醚含量的增加主要是由NAC产生的效果负责。gydF4y2Ba
GM-CSF,TNF-α和IL-5是激活转录因子NF-κB的炎性细胞因子,并且可能有助于在人嗜酸性粒细胞中产生其他炎症细胞因子gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba.因此,NF-κB活化是延长嗜酸性粒细胞存活的关键步骤,可能是通过控制诱导存活蛋白合成的基因的转录活性gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba.NAC抑制NF-κB活化的能力已经证明在不同的细胞中gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba并且,该观察结果已经扩展到本研究中的人分离嗜酸性粒细胞。因此,通过抑制细胞因子产生的NF-κB的激活,可以阻断生存因子的产生,从而可以抑制促凋亡效应的产生。非抗氧化剂PDTC,其阻断细胞因子诱导的NF-κB活化gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba,也显示对嗜酸性粒细胞产生促凋亡作用,类似于NAC。这些发现与Bay 11-7082(抑制蛋白IκB的磷酸化抑制剂)孵卵的观察结果一致,也可以消除人类嗜酸性粒细胞中来自外源性GM-CSF和TNF-α的促生存作用gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba.通过细胞渗透形式的NF-κB (IκB)α抑制剂抑制NF-κB,在TNF-α缺乏或存在的情况下,也可诱导人嗜酸性粒细胞凋亡gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba.有趣的是,胶质毒素抑制人嗜酸性粒细胞NF-κB后,也报道了结构性凋亡的增加gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba和合成的肽gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba.然而,在未与炎性细胞因子孵育的培养的嗜酸性粒细胞中观察到除了Nac的已知抗凋亡作用以外的增加的凋亡。此外,虽然嗜酸性粒细胞生存需要组成型活性NF-κB的存在gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba, NF-κB激活的其他抑制剂,如PDTC(如目前报道的)或Bay 11-7082gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba,也未影响人嗜酸性粒细胞的组构性凋亡,提示在组构性机制上存在差异gydF4y2Ba相对gydF4y2Ba细胞因子介导的NF-κB活化。gydF4y2Ba
本研究没有探讨这些细胞因子的信号通路的其他下游步骤的NAC干扰,但在其他细胞中,NAc已被证明通过以下方式诱导细胞凋亡:增加促凋亡gydF4y2Ba伯灵顿gydF4y2Ba基因表达gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba;抑制抗凋亡蛋白的NF-κB依赖性表达gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba;或阻断c-jun n端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的激活gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
氧化应激似乎与过敏性炎性疾病如哮喘相关gydF4y2Ba40gydF4y2Ba.据报道,NAC在过敏性哮喘的动物模型中是有益的gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba并且还降低嗜酸性粒细胞氧化生成和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的释放gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba.因此,硫醇抗氧化治疗策略可能会缓解过敏性炎症,尽管NAC的低口服生物利用度和NAC的效力是目前缺乏受控临床试验的明显限制和令人信服的证据。gydF4y2Ba
总之,gydF4y2BaN -gydF4y2Ba乙酰-gydF4y2BalgydF4y2Ba-半胱氨酸具有调节作用gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba对人外周血嗜酸性粒细胞凋亡的影响。需要进一步研究来确定这种调节作用,特别是对暴露于炎症细胞因子的嗜酸性粒细胞的促凋亡作用,是否可能在慢性过敏性炎症的治疗中具有治疗价值。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者想要感谢C. Peiró(大学医学院药理学系,马德里,西班牙)在电迁移率位移分析实验上的帮助。也感谢P. Santamaría和D. Martí(西班牙巴伦西亚大学医学院药理学系)的技术援助。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2006年6月5日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba5月4日,2007年。gydF4y2Ba
- ©ers Journals LtdgydF4y2Ba
参考gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba