抽象的
本文作者评估了相关细胞(肺细胞(A549)、巨噬细胞(THP-1)、肥大细胞(HMC-1)和内皮细胞(EAHY926)的共培养系统是否能够模拟空气动力学直径为10 μm的50%颗粒的反应10)先前报道在活的有机体内.肥大细胞的作用被认为是特别兴趣。
单培养、双培养(A549 + HMC-1 10:1比例;THP-1 + HMC-1(2:1)比例)和三培养菌(A549 + THP-1 + HMC-1(10:2:1)比例)暴露于城市PM10(24小时在0,10,30或100μg·cm−2).此外,将EAHY926细胞插入到培养物上方。释放的细胞因子用荧光激活细胞分选阵列系统进行评价。
THP-1 + HMC-1双培养组和三培养组对PM释放更多的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、白细胞介素(IL)-1β、IL-8、IL-6、肿瘤坏死因子-α和MIP-1α10比单一文化的总和。具有EAHY926的患病涉及更多G-CSF,MIP-1α,IL-8和MIP-1β,而不是EAHY926单一培养物。
造成饮料,患有EAHY926的脚步和患道,提供了与先前针对颗粒物质效应的局部和全身效应一致的结果,即。炎症,内皮功能障碍和骨髓细胞动员。肥大细胞似乎在共培养反应中起着重要作用。
学习体外和在活的有机体内已经评估了颗粒物质(PM)的促炎作用1,2,但不同类型肺细胞之间的沟通作用尚不清楚。在这方面,石井和他的同事3.,4表明支气管上皮细胞和巨噬细胞之间的相互作用导致对PM的反应增强,并且这种相互作用与细胞交联无关。
考虑到气道和肺泡的复杂结构,使用一种甚至两种细胞类型是很不现实的。上皮细胞和巨噬细胞的相互作用,即。与沉积颗粒直接接触的细胞,以及其他重要的细胞类型,如肥大细胞、树突状细胞、成纤维细胞和内皮细胞等,应该是重要的,但它们在很大程度上仍不为人知。在本研究中,作者着重研究了肥大细胞在PM应答中的作用,这些细胞可能与巨噬细胞和上皮细胞相互作用,以及这三种细胞类型与内皮细胞共培养的进一步相互作用。
肥大细胞是支气管粘膜下层、胸膜甚至肺泡间隔的重要组成部分5,6.肥大细胞尚未与PM有关。然而,已经证明组胺在PM的全身效应中发挥着重要作用7- - - - - -9还有它的易位10,考虑到组胺主要由肥大细胞分泌,肥大细胞可能是理解PM系统作用的关键。因此,当前作者评估了在墨西哥城(墨西哥)获得的PM响应的细胞因子的释放:通过肥大细胞、肺细胞、巨噬细胞和内皮细胞的单一培养;肥大细胞与肺细胞或巨噬细胞共培养(双培养);通过涉及三种细胞类型的共培养(三培养);通过这些组织培养物与内皮细胞的相互作用。假设纯细胞培养和混合细胞培养的细胞因子的释放在质量和数量上有所不同。
方法
协议设计
为了评估不同细胞类型在肺中的相互作用和贡献,一个共培养系统创建了多达四种不同的细胞类型。首先,我们研究了肺上皮细胞(A549)、巨噬细胞(THP-1)、肥大细胞(HMC-1)和内皮细胞(EAHY926)的单一培养。然后分别制备两种、三种和四种不同细胞类型的共培养物:A549与HMC-1的双培养物(比例为10:1),THP-1与HMC-1的双培养物(比例为2:1);A549、THP-1和HMC-1三种培养物(比例10:2:1);在暴露培养物12小时后,将培养物加EAHY926放入插入物中(图1⇓).不同培养物暴露于50%截止空气动力学直径为10 μm (PM)的颗粒中10)在墨西哥城收集。
PM取样和制备
点10被收集,使用大批量采样器(GMW Model 1200,VFC HVPM10; Sierra Andersen,Smyrna,Ga,USA),在Xalostoc的墨西哥城大都会区的工业区。在24小时内收集样品,气流率为1.13米3.·敏−1±10%的硝酸纤维素膜,名义孔径为3µm (11302-131;缝匠肌、哥廷根、德国)。从2004年11月到2005年4月,每周进行三次采样。
将回收的颗粒以1mg·ml的最终浓度悬浮在所需的细胞培养基中−1.为避免颗粒团簇的存在,悬浮粒子被超声振动20分钟。取等分以获得必要的最终浓度。最终暴露浓度以µg·cm表示−2为了保持颗粒质量/细胞数量/面积的比例一致11.
细胞培养
使用了以下人类来源的细胞系:A549(上皮II型肺细胞;美国类型文化收藏,美国弗吉尼亚州马纳萨斯)12;THP-1是一种单核细胞来源的细胞系(美国型培养收集),经1 ng·mL过夜孵育后分化为巨噬细胞样细胞−1十四烷酸佛波醇酯13;HMC-1(肥大细胞;由美国罗彻斯特州梅奥诊所J.H.巴特菲尔德提供)14;和EAHY926(内皮细胞)15.表1中描述了用于不同培养物的细胞培养基⇓.所有实验都在聚苯乙烯24孔板(Costar Europe Ltd, Badhoevedorp, Netherlands)中进行,密度为1.6×105细胞·厘米−2.EAHY926细胞生长在聚碳酸酯Transwell镶嵌物上,其名义孔径为0.4µm (Costar Europe Ltd)。24 h后改为无胎牛血清(FCS)培养基。
据目前作者所知,没有关于肺肥大细胞数量的报道,所以上皮细胞的比例为10:1 (1.6×10)5细胞·厘米−2)和肥大细胞(0.16×105细胞·厘米−2造纸,巨噬细胞的2:1比例(1.07×105细胞·厘米−2)和肥大细胞(0.53×105细胞·厘米−2) biculture。
基于他们的评价在活的有机体内石头制造的分布et al。16,当使用上皮细胞和巨噬细胞共培养时,选择5:1的比例。A549 + THP-1 + HMC-1细胞按10:2:1的比例接种,即。1.6×105,0.32×105和0.16×105细胞·厘米−2,分别(图1⇑).具有内皮细胞的患病组包括加入含有汇合的EAHY926细胞的插入物,因此在接触下午12小时后创造另一个在患道之后的隔间。EAHY926细胞永远不会与PM直接接触(图1⇑).
所有PM孵育均采用无fcs培养基。在暴露于PM前6小时,将细胞培养基改为无fcs培养基。0、10、30或100µg·cm的培养液−2的点1024 h后回收上清液,在-80℃下保存以备进一步分析。
细胞因子释放
定性分析
在初步实验中,单一培养物的上清液,休头和患道的内皮细胞暴露于0或100μg·cm−2采用半定量技术(Proteome Profiler, Human cytokine Array Kit;R&D系统公司,明尼阿波利斯,MN,美国)。使用ImageJ程序(美国国立卫生研究院,Bethesda, MD, USA)对获得的自拍片进行扫描和分析。每个点的相对密度计算相对于膜的阳性内部控制和结果表示为倍数变化以上或以下未暴露的培养。<0.5或>1.5的变化被认为是相关的。选择有相关变化的细胞因子进行进一步分析和定量。
定量分析
基于人细胞因子阵列的结果,肿瘤坏死因子(TNF)-α,白细胞介素(IL)-1β,IL-6,IL-8,巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α,MIP-1β,单核细胞趋化蛋白(MCP)-1,粒细胞核心刺激因子(G-CSF),选择使用Cytric胎圈阵列弯曲(BD Biosciences,Belgium),用FacsArray获得的定量分析进行定量分析(BD Biosciences)使用FCAP阵列软件(BD Biosciences)的50μl上清液中。
统计分析
由于不同细胞培养条件下细胞因子释放的可变性,结果以未暴露培养条件下浓度的百分比表示。为了评估共培养中细胞因子的浓度(并使这些结果更加合理),还将共培养的结果与“预期”浓度进行了比较,该“预期”浓度是通过将单个培养中分泌的数量相加并根据细胞数量进行调整而获得的。通过ANCOVA研究了三种PM浓度之间的差异。为了检验PM对共培养的影响,我们使用单培养数据(根据细胞密度进行调整)来计算每个浓度的预期相加效应。在不同浓度下可能的乘法效应通过双向方差分析研究,并在加性数据和观察数据之间进行交互检验。当p<0.05(双尾)时,认为差异显著。
结果
定性分析(细胞因子阵列)
从单个培养物中收集的上清液用protein Profiler Human Array试剂盒进行评估(表2⇓;图2⇓)结果显示,暴露于PM的A549细胞中,IL-8(0.27倍)、生长相关致癌基因(GRO)-α(0.25倍)和IL-23(0.3倍)水平显著下降,而任何细胞因子均未见相关升高。相比之下,暴露于PM的THP-1细胞MIP-1β(1.5倍),RANTES(1.5倍),可溶性细胞间粘附分子(sICAM;IL-8(0.23倍)和MIP-1α(0.5倍)降低。HMC-1细胞IL-1β分泌增加(3.5倍)和sICAM分泌增加(2.7倍),而I-309分泌减少(0.35倍),IL-32分泌减少(0.11倍)和MCP-1分泌减少(0.05倍)。
在三次培养中,G-CSF(4.4倍)、sICAM(1.5倍)、IL-1β(2.6倍)、IL-6(4.4倍)、MIP-1α(8.4倍)和MIP-1β(13.4倍)升高,RANTES(0.32倍)降低。内皮细胞根尖室上清液中G-CSF(22.5倍)和mip1 α(65倍)水平升高,而GRO-α(0.5倍)、I-309(0.07倍)、MCP-1(0.04倍)和RANTES(0.1倍)水平下降。
定量分析
THP-1细胞暴露于下午10(图3C⇑D)在TNF-α和IFN-γ的水平上表现出超过四倍,并降低MCP-1的水平。IL-8以低浓度的PM略有增加10(10µg·厘米−2),高浓度(100µg·cm−2;表3⇑).
单独具有内皮细胞和内皮细胞的肺部
内皮细胞上清液与暴露于PM的三种培养物共培养10IL-6、MIP-1β、IL-8和MCP-1显著升高(高达7.5倍),但RANTES下降(图5c)⇑和d;表3⇑).内皮细胞仅接触到下午的介质10在基石室中,TNF-α(高达12倍)和G-CSF水平的增加,并且所有其他细胞因子介质没有显着变化(图5E⇑和f;表3⇑).
观察到的相对将细胞因子浓度
PM暴露后THP-1 + HMC-1双培养、三培养及内皮细胞三培养中TNF-α、G-CSF和IL-8浓度的变化10如图6所示⇓,与基于单个培养的预期浓度进行比较,并对细胞数进行校正。
讨论
迄今为止,使用巨噬细胞加上皮细胞的条件培养基和共培养物对PM诱导效应的评估是有用的4,17,18但是,在本研究中,又增加了两个参与者:肥大细胞和内皮细胞。使用与PM局部和系统效应相关的多种细胞类型表明,在共培养中,可以放大/减轻单细胞培养中细胞因子分泌的调节。暴露于PM后细胞因子的分泌模式似乎与在活的有机体内与PM相关的影响。这是目前最重要和最新颖的观察体外肥大细胞和巨噬细胞之间的相互作用导致了对PM的放大反应。这些放大可能模拟真正发生在肺,特别是来自过敏对象的肺。细胞因子的增加在THP-1 + HMC-1双培养和三培养中最为显著。
细胞因子水平
虽然细胞因子可以分享多种功能,但是为了简单起见,目前研究中测量的介质分为细胞因子(TNF-α,IL-6,IL-1β,IFN-γ和G-CSF)和趋化因子(IL-8,MCP-1,MIP-1β,MIP-1α和RANTES)19.
PM暴露后,在THP-1 + HMC-1双培养中观察到细胞因子分泌的巨大变化(TNF-α使>增加100倍,G-CSF增加10倍,IL-8增加超过5倍)。在THP-1 + HMC-1双培养和内皮细胞双培养中均观察到较强的反应,但不如THP-1 + HMC-1双培养。这种差异可能是由于:1)培养时HMC-1和THP-1细胞的数量比双培养时少3.5倍;和/或2)A549细胞中存在可以捕获部分分泌的细胞因子的受体。单培养和暴露于PM的A549 + HMC-1双培养释放的细胞因子量显著降低。
值得注意的是,内皮细胞培养的基底外侧腔室中的PM诱导根尖腔室中TNF-α和RANTES检测的大量增加,但对任何其他细胞因子介质没有显著影响。相比之下,当内皮细胞被引入到已经暴露于PM 12小时的培养液上方时,在根尖室中观察到大多数细胞因子水平的大幅增加,但这一次没有TNF-α或RANTES水平的增加。这表明不同细胞之间的相互作用改变了分泌谱。这可能是由于不同细胞之间的相互作用,如前面所示20.,或存在捕获一些细胞因子的受体的存在,避免在培养上清液中进一步检测21.
细胞互动
与单细胞培养相比,多细胞培养有了改进,而且更接近于单细胞培养在活的有机体内情况,但仍然仅限于调查的细胞。巨噬细胞在健康个体中呈现,与结构细胞(上皮细胞)组合是PM的主要目标。因此,该系统模拟了与PM中的第一个互动在活的有机体内的情况。肥大细胞的存在增加了细胞因子的产生,这一发现与流行病学的发现相吻合,即空气污染加重了哮喘的表现22.肥大细胞的组胺分泌被认为是低的,因为在类似的实验条件下,之前已经观察到PM仅在离子载体存在的情况下诱导HMC-1细胞分泌组胺23.然而,除了组胺外,还可能释放其他介质,如酶。
体外观察结果是一致的在活的有机体内影响
在PM诱导的肺部和全身效应中,各种细胞因子的表达增加已被描述。例如,TNF-α、IL-6和IL-8与暴露于PM后的肺部炎症过程相关24,25.在系统效应方面:粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和G-CSF与骨髓细胞的动员有关4;IL-1β、IL-6、TNF-α与血凝块的形成有关26- - - - - -28;TNF-α、IL-6、IL-8在内皮功能障碍中起作用29,30..在本研究中使用的系统中,TNF-α、G-CSF和IL-8是这些细胞介质的很好的例子。
TNF-α导致黏附分子的表达,参与招募炎症细胞29,30..与基于单一培养物的预期浓度相比,在暴露于PM的批量贩林中测量高浓度的TNF-α(图6A⇑).当上皮细胞存在时,没有观察到这种高浓度;相反,发现显著下降。在培养体和内皮细胞顶端TNF-α的减少可能反映了TNF-α与丰富的A549细胞的结合。
G-CSF的分泌,一种与骨髓中白细胞的动员有关的分子31,展示了患有EAHY926细胞的漫步性比EAHY926细胞更大的分泌八倍。在图6D-F中⇑结果表明,THP-1 + HMC-1 biculture没有分泌比预期更高浓度的g - csf的单一文化,但tricultures g - csf的浓度和tricultures EAHY926明显大于预期,尤其是在顶端的一面triculture EAHY926。G-CSF浓度的增加遵循线性浓度-反应模式。目前作者假设,在根尖侧观察到的G-CSF浓度是由内皮细胞释放的,而不是由于分子从基底外侧腔室转位。这加强了现有系统模仿在活的有机体内触发G-CSF分泌与PM暴露相关的系统效应的信号。
IL-8是一种重要的促炎细胞因子,与中性粒细胞的募集有关。到目前为止,有争议的结果已经发表,一些研究报道了PM暴露后IL-8分泌增加32,33而其他人则报告了相同细胞因子的减少20.,34.一项关于长期暴露在墨西哥城城市污染环境中的儿童呼吸损害的研究表明,与生活在较干净环境中的儿童相比,血清IL-8水平有所下降35.IL-8的下调与不同的因素有关,例如相对较晚的抽样36IL-4和IL-10的存在37, TNF-α或CD14的可溶性受体38,39.在目前的研究中,减少被观察到在引发A549细胞所分泌的biculture A549 + HMC-1,但在观察引发分泌大量增加HMC-1 + THP-1 biculture, triculture和triculture EAHY926浓度的10和30µg·厘米−2点10,在100µg·cm时呈下降趋势−2.以往关于IL-8的研究存在争议,可能与暴露剂量、暴露时间、暴露细胞类型以及不同细胞类型之间的相互作用有关。细胞因子与PM结合的可能性不能被排除,正如之前已经证明的那样40.
在活的有机体内和体外研究表明PM能够诱导内皮功能障碍表型29,41,42和pro-thrombotic效果8,43.PM进入血流的易位被认为是这些作用的可能机制44,树突细胞可能在PM的易位中发挥作用45.然而,考虑到PM易位可能是一种相对有限的现象,与具有粒子初级接触的细胞内皮细胞的通信可能在PM的全身效应中发挥更大的作用。在本研究中,提供了先前暴露于PM的漫步系统的内皮细胞活化的间接证据。
现有的人类证据表明,内皮功能障碍和心血管效应与PM暴露有关46,47.在动物中,PM暴露与血栓形成、内皮功能障碍和PM易位有关10,28,42.在目前的研究中提出的系统是一个模型,除了可以使用动物模型,包括敲除和敲入动物,和人类研究43.由于它相对简单(与在活的有机体内),它开辟了详细探索与PM的局部和全身效果有关的机制的机会。一种可能性是使用单克隆抗体,抗细胞因子或细胞因子受体的抑制剂来阻断信号,因此,了解细胞因子分泌和细胞相互作用是如何调节的48.
结论
总之,这是一部小说体外系统被开发出来,它模拟了肺内的细胞通信,从而使人们更好地了解暴露于颗粒物或任何其他污染物(如内毒素或过渡金属)后与反应相关的不同细胞机制。双培养、内皮细胞培养和内皮细胞培养提供了与局部和全身效应一致的结果,如炎症、内皮功能障碍和骨髓细胞动员,这已被描述为颗粒物质。这种新型系统为使用细胞因子和转导信号的特定抑制剂打开了可能性,从而使人们更好地理解与环境污染物影响相关的机制。
支持声明
E. Alfaro-Moreno得到了欧洲呼吸学会(第80号奖学金)的支持,188bet官网地址目前得到了比利时科学政策的支持。T.S. Nawrot、B.M. Vanaudenaerde和J.A. Vanoirbeek是弗拉芒科学基金的研究员。该项目得到了比利时州立大学间吸引极点计划的资助,比利时科学政策P6/35。
感兴趣的语句
没有宣布。
致谢
HMC-1细胞由J.H. Butterfield (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA)提供。作者要感谢A. Nemmar(阿曼苏丹卡布斯大学,马斯喀特,阿曼苏丹国)对本手稿的宝贵评论。
- 收到了2008年3月21日。
- 接受2008年7月7日。
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