摘要GydF4y2Ba
急性肺损伤的发病机制包括白细胞通过内皮细胞进入肺组织和内皮/上皮屏障的破坏导致富含蛋白质的水肿。GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba研究表明,微管网络在调节内皮细胞通透性和中性粒细胞运动中发挥作用。假设微管稳定剂紫杉醇可能减轻急性肺损伤相关的炎症和血管泄漏GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
采用气管内脂多糖(LPS)致小鼠肺损伤模型评价紫杉醇静脉注射的效果。治疗18 h后测定肺损伤和炎症指标。GydF4y2Ba
静脉注射紫杉醇可显著降低肺实质的炎症组织学变化和脂多糖诱导的炎症参数:蛋白和炎症细胞渗入支气管肺泡灌洗液,肺髓过氧化物酶活性,伊文思蓝标记白蛋白外渗到肺组织。紫杉醇单独(在没有LPS的情况下)对这些参数没有明显的影响。在lps诱导的腹膜炎模型中,除了肺蛋白外,静脉滴注紫杉醇还能减少腹水中白细胞的积聚。GydF4y2Ba
综上所述,目前的数据表明,紫杉醇稳定微管系统性地减轻脂多糖诱导的炎症和血管渗漏。GydF4y2Ba
急性肺损伤(ALI)及其更严重的形式,急性呼吸窘迫综合征(ARDS)与患者的高发病率和死亡率有关。Ali的发病机制包括导致富含蛋白质的水肿的内皮和上皮屏障的损伤,以及由炎症细胞,肺上皮细胞或成纤维细胞释放的细胞因子和趋化因子诱导的炎症。内皮屏障的弱化增强了白细胞的常旧中脱位蛋白进入肺组织,进一步有助于肺功能障碍。GydF4y2Ba
内皮细胞屏障调节依赖于完整的细胞骨架。虽然肌动蛋白微丝对于内皮屏障的重要性已经得到了很好的证实GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba另一种细胞骨架组分的参与最近仅探索了基于微管蛋白的微管网络。微管聚合抑制剂的容量增加溶质的转型渗透性GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba已经被报告了GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba.相反,紫杉醇的微管稳定衰减通过肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的内皮单层和荚膜间隙形成的溶质渗透性GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba与凝血酶GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba.此外,紫杉醇稳定内皮微管会减少白细胞通过内皮单层的转运,而微管的解体会增加白细胞的迁移GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba. 微管也可能直接参与中性粒细胞的运动,因为紫杉醇预处理显著抑制内毒素激活血清刺激的中性粒细胞趋化性GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
这些GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba数据表明,微管稳定可能降低微血管对溶质和白细胞的渗透性GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba.因此,假设微管稳定可能会降低急性受伤的肺中的血管泄漏和炎症。为了测试这一假设,研究了紫杉醇在内毒素诱导的肺损伤鼠模型中的影响。内毒素/脂多糖(LPS)是革兰阴性细菌细胞壁的关键组成,是促炎介质,并且当肿瘤内递送时,可重复地显示微血管肺损伤的关键特征,包括肺组织中白细胞积聚,肺水肿,深度肺炎和死亡率GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba.LPS处理导致肺细胞中周围微管的破坏GydF4y2Ba9GydF4y2Ba和血管内皮细胞GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba.在本研究中,微管稳定对ALI预后有有利影响,因为在内毒素诱导的ALI小鼠模型中,静脉注射紫杉醇可显著减少血管渗漏和炎症。GydF4y2Ba
材料和方法GydF4y2Ba
动物GydF4y2Ba
所有实验和动物护理程序均由芝加哥大学动物资源中心(Chicago, IL, USA)批准,并根据美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南处理动物GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba.C57BL/6 (20-25 g)小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor, ME, USA),置于有食物和水的笼子中,在温控的房间中进行12小时的暗/光循环,直到实验时间。GydF4y2Ba
动物程序GydF4y2Ba
用150mg·kg麻醉小鼠GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba氯胺酮15毫克·公斤GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba气管和右颈内静脉暴露前服用乙酰丙嗪GydF4y2Ba通过GydF4y2Ba颈部切口。LPS溶液(2.5 mg·kgGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba体重GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaLPS,血清型055:B5;气管内注入西格玛(美国密苏里州圣路易斯)或无菌生理盐水GydF4y2Ba通过GydF4y2Ba一个20量度导管。同时,通过颈内静脉,小鼠接受单次注射紫杉醇(Sigma),以达到最终计算的血浆浓度10 μM,或cremophor/乙醇/PBS对照。让动物恢复18小时。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺,在-70℃保存,以进一步评估肺损伤。GydF4y2Ba
BALF中总蛋白质和白细胞分析的定量GydF4y2Ba
Balf被离心(15分钟,1,500×GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4℃)和使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL,USA)测量总蛋白的上清液。使用血慢计检查细胞颗粒的白细胞总数。此外,通过细胞悬浮液制备细胞螺旋液。通过使用显微镜计数300-500个细胞来进行血糖染色(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ,USA),通过计数300-500个细胞来进行中性粒细胞和巨噬细胞的差异细胞计数。GydF4y2Ba
TNF-α,白细胞介素-6和前列腺素eGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba分析GydF4y2Ba
ELISAS适用于测量小鼠TNF-α和白细胞介素(IL)-6(研发系统,Chantilly,VA,USA)和前列腺素(PG)E.GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba(美国密苏里州安阿伯市开曼化学公司)在BALF中,并根据制造商的协议执行。GydF4y2Ba
组织病理学GydF4y2Ba
用PBS灌注肺部血液,并用0.5%的低熔点琼脂糖释放出0.5%的低熔点琼脂糖,用于通过氧毒素和曙红染色组织学评价。GydF4y2Ba
肺内伊文思蓝标记白蛋白积累的测定GydF4y2Ba
如前所述,在实验结束前120分钟将Evans蓝标白蛋白(EBA)注入颈静脉,以评估血管泄漏GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba. 实验结束后,通过右心室向肺灌注PBS,称重并在液氮中快速冷冻。EBA在60°C条件下从右肺在甲酰胺中提取18小时。通过分光光度法在620℃测定上清液的光密度 纳米。根据标准曲线计算肺匀浆中渗出的EBA浓度。GydF4y2Ba
LPS诱导的腹膜炎GydF4y2Ba
腹腔注射LPS (0.2 mg·kg)诱发急性腹膜炎GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba体重(100 μL PBS)。4 h后用1ml PBS进行腹腔冲洗。采用diff - quick染色(Dade Behring, Inc., Deerfield, IL, USA)对收集的腹水进行细胞含量分析。GydF4y2Ba
统计分析GydF4y2Ba
数据显示为平均值±GydF4y2Ba扫描电镜GydF4y2Ba. 使用标准的单因素方差分析对数据进行分析,各组采用纽曼-基尔斯检验进行比较,所有病例的显著性定义为p<0.05。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
紫杉醇对脂多糖诱导的肺部炎症参数的影响GydF4y2Ba
与生理盐水对照组相比,LPS注射18小时后,肺组织的组织学检查显示炎性变化,如肺泡壁增厚,白细胞渗入肺间质和肺泡间隙(图1)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba). 单独使用紫杉醇治疗不会引起任何明显的肺组织学变化(图。 1.GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba),但脂多糖诱导的炎症组织学征象大大减弱(图1)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).定量地,通过计数BALF中的总细胞来证实这种效应(图2a)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).与LPS单独处理的小鼠相比,紫杉醇/LPS处理的小鼠BALF中细胞总数减少。显微镜检查显示,生理盐水和紫杉醇处理的小鼠BALF大多含有巨噬细胞,而LPS处理导致中性粒细胞浸润增加(图2b)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).肺髓氧化酶活性,肺部处理小鼠中肺中性粒细胞螯合剂的指数,与组织学评估一致(图2CGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).LPS挑战还增加了外周血中循环中性粒细胞的数量(图3GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).已知延长的紫杉醇治疗造成小鼠中的中性粒细胞病GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba.然而,在本实验中,紫杉醇治疗后肺部中性粒细胞浸润减少并非由于中性粒细胞减少,因为血液中中性粒细胞的总数没有受到紫杉醇的影响(图3)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
紫杉醇对内毒素所致肺血管渗漏的影响GydF4y2Ba
与生理盐水激发小鼠和单独紫杉醇激发小鼠相比,LPS诱导的肺微血管渗漏反映在BALF蛋白浓度增加上(图。 4aGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).紫杉醇显著降低BALF蛋白浓度(~ 40%;p<0.001)(图4aGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).LPS暴露引起肺水肿(图4b)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba),通过EBA外渗到肺实质测量(图4cGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).紫杉醇单独不改变EBA外渗的基础水平,但显著降低脂多糖诱导的微血管肺渗漏(图4b)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba和c)。GydF4y2Ba
紫杉醇对细胞因子和PGE的影响GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba生产的肺GydF4y2Ba
脂多糖的许多全身效应是由于体内产生细胞因子和趋化因子。气管内注射LPS可显著提高TNF-α水平(2003±166 pg·mL)GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)和IL-6(451.5±29.8 pg·mL .GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)在BALF中,与用盐水处理的动物的水平相比(2.8±1.1 pg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba和3.9±2.5 pg·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba分别为TNF-α和IL-6;无花果5GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba和b)。与单独使用LPS相比,同时使用LPS/紫杉醇治疗可适度但显著降低BALF中TNF-α和IL-6的水平(图 5aGydF4y2Ba⇓GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba
pGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba是一种促炎介质,尽管其在ALI中的确切机制仍有待研究。LPS处理导致PGE积累增加GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba在BALF中,紫杉醇显着减少(图5CGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).pGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba单独使用紫杉醇的动物BALF的水平低于对照值(图5c)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
紫杉醇对内毒素所致腹膜炎的影响GydF4y2Ba
脓毒症诱导的ALI/ARDS可由革兰氏阴性细菌感染引起的急性腹膜炎引起。为了评估静脉注射紫杉醇是否在LPS诱导的腹膜炎中产生潜在的有益作用,腹腔内注射LPS诱导急性腹膜炎,反映在腹腔白细胞募集增加(图6a)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba). 腹水显微镜检查显示巨噬细胞占优势(58%),尽管中性粒细胞(11%)也含有大量红细胞(图。 6bGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba),提示有相当大的血管渗漏。静脉注射紫杉醇可将LPS的作用降低到基础水平(图6a)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Bab)。与盐水控制相比,仅紫杉醇在腹水中没有改变细胞计数或组合物(图6AGydF4y2Ba⇓GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
阿里和ARDS是急性呼吸衰竭的主要原因,其与高发病率和死亡率有关。这些疾病的特征在于显着的肺炎症反应,导致肺泡和富含蛋白质肺水肿的肺泡上皮和内皮屏障的损伤。Ali / ARDS发病机制仍然仅部分地理解,其药理治疗是非特异性的。基于已发布GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba结果表明,微管动力学可能在ALI发病和恢复中发挥重要作用。GydF4y2Ba
在lps诱导的ALI小鼠实验中,微管稳定剂紫杉醇具有明显的抗炎、抗水肿作用。虽然这种作用的机制还有待探索,但目前的作者推测紫杉醇的作用可能改善内皮/上皮屏障,因为紫杉醇显著降低脂多糖诱导的BALF和间质中水和蛋白质的积累。目前的数据与最近的观察是一致的,紫杉醇防止内皮屏障的损失在离体肺GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
在微血管内皮细胞中,细胞间的连接是维持血管壁完整性的关键。LPS刺激培养的内皮细胞导致单层完整性的丧失和旁细胞间隙的形成GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba.紫杉醇对微管的稳定作用可能会干扰LPS对细胞-细胞连接的影响,因为最近的数据表明微管和粘附连接动态相互作用GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba.相反,在lps刺激的细胞中,由于细胞骨架运动蛋白产生的收缩力,内皮连接可能减弱GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba.紫杉醇对微管的稳定作用可能会影响可收缩的细胞骨架,从而保存细胞与细胞之间的连接。尽管微管和可收缩细胞骨架之间的关系尚未被充分研究,但微丝或微管结构的破坏都会导致内皮细胞收缩和屏障功能障碍GydF4y2Ba通过GydF4y2Ba肌动球蛋白细胞骨架的改变。使用诺考达唑或长春花碱的肺内皮细胞微管解聚与肌球蛋白轻链磷酸化、应力纤维形成、收缩和屏障功能障碍有关GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba.这些效果与小Rho鸟苷三磷脂酶及其效应rhO激酶的激活相关联,可以通过用紫杉醇预处理通过细胞预处理衰减,促进微管组件GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
紫杉醇除了增强内皮屏障外,还可能影响ALI发病机制的其他成分。肺毛细血管内中性粒细胞的招募和激活是败血症相关肺损伤的主要原因GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba.因为紫杉醇抑制多形核中性粒细胞运动GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,静脉内紫杉醇可能会降低中性粒细胞迁移到炎症部位的能力。本数据表明,LPS攻击小鼠的肺部和腹水中的嗜中性粒细胞的数量显着降低。GydF4y2Ba
TNF-α和其他来自LPS刺激细胞的细胞因子介导了LPS的毒性作用GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba.结果表明,紫杉醇可轻微减少细胞因子在肺中的积累。然而,在lps处理的动物BALF中,它们的水平仍远高于对照组。因此,细胞因子的减少不太可能是紫杉醇作用的主要机制。GydF4y2Ba
出版GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba数据表明,紫杉醇可以诱导离体小鼠巨噬细胞的炎症信号,增加其TNF-α和IL-1的释放GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba.然而,炎症信号的诱导需要紫杉醇浓度(约30 μM)高于微管稳定(10 μM),而微管稳定(10 μM)在本研究中使用。此外,紫杉醇仍可抑制包括上皮细胞和内皮细胞在内的其他肺细胞类型的细胞因子的产生和分泌,从而导致肺细胞因子积累的净减少。重要的是,对乳腺癌患者的研究表明紫杉醇(紫杉醇和多西他赛)可降低血清细胞因子IL-1和TNF-α的水平,升高干扰素-γ、IL-2和IL-6的水平GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
pGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba是一种有效的免疫抑制类二十碳烯酸,其在脓毒症患者血浆中的水平显著升高GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba和动物GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba,以血浆PGE为主GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba在肺中产生GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba. 虽然PGE的作用GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba在阿里仍有待研究中,小鼠和大鼠的肺炎伴有增加的PGE水平GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba平淡GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba.在本系统中,紫杉醇显着减弱了PGEGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba在LPS处理的小鼠的BALF中积累。这与紫杉烷减少了PGE的血浆水平的观察结果一致GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba在人类GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
微管参与关键信号转导通路已被公认GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba,具有微管的聚合动态是其生物功能的核心GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba.微管蛋白结合药物,如秋水仙碱和紫杉醇,强烈调节微管动力学。虽然秋水仙碱抑制微管聚合,紫杉醇刺激它并稳定微管,完全消除细胞内微管蛋白的可溶性池。因此,这两种药物都能抑制细胞周期。此前已经证实,微管解聚剂秋水仙碱具有显著的抗炎作用。其作用方式包括调节趋化因子和前列腺素的产生,抑制中性粒细胞和内皮细胞粘附分子GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba.目前的数据首次表明,紫杉醇稳定微管可产生抗炎作用,这表明不仅微管的结构完整性,而且微管的动态在炎症信号中也很重要。GydF4y2Ba
- 收到了GydF4y2Ba2006年11月27日。GydF4y2Ba
- 认可的GydF4y2Ba2007年5月9日。GydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司GydF4y2Ba
参考文献GydF4y2Ba
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