摘要
越来越多的证据表明,肺微生物组在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的严重程度中起着重要作用。然而,COPD加重期间肺微生物群的动态及其在疾病病因学中的潜在作用仍然知之甚少。
我们对87名COPD患者的476份痰样本进行了纵向的16S核糖体RNA调查,四次就诊分别为稳定状态、加重期、治疗后2周和恢复6周。
我们的分析揭示了肺部微生物群的动态变化,其变化似乎与加重事件相关,并指示特定的加重表型。抗生素和类固醇治疗似乎对肺部微生物组有不同的影响。我们描述了肺微生物组的微生物相互作用网络,并建议对一些细菌操作分类单位的扰动,特别是嗜血杆菌对整个微生物群落结构有很大影响。此外,一些血清和痰生物标志物,特别是痰白细胞介素-8,似乎与微生物组的结构和多样性高度相关。
我们的研究进一步加深了对COPD患者肺部微生物群动态的理解,并强调了其作为生物标志物的潜力,并可能成为未来呼吸治疗的靶标。
摘要
肺微生物组的变化与COPD加重事件相关,并与宿主炎症反应有关http://ow.ly/Wamjx
简介
慢性阻塞性肺病(COPD)是最常见的呼吸系统疾病之一,其特点是气道炎症、小气道阻塞和肺泡破坏导致症状持续,肺功能受损[1- - - - - -3.].慢性阻塞性肺病急性加重是指症状的突然恶化,其中细菌定植是一个主要病因[4- - - - - -7].然而,在疾病恶化期间的细菌生态动态及其在疾病发病机制中的作用仍然知之甚少。
下一代DNA测序技术的进步为研究健康和疾病中的肺部微生物群提供了机会。使用非培养技术(如PCR扩增和16S核糖体(r)RNA基因测序)的研究表明,与健康受试者相比,COPD患者气道中存在明显的细菌群落,并表明肺部微生物群的变化可能与气道炎症和疾病进展的增强有关[8- - - - - -11].然而,迄今为止,大多数肺微生物组研究涉及的受试者队列相对较小,纵向采样有限,同时有临床信息。
我们假设,纳入来自更大和更有特征的患者队列的肺微生物组档案可能提高我们对COPD病因的机制理解,并提供额外的预后和治疗特征。在这里,我们对从BEAT-COPD (COPD加重期靶向抗生素和全身皮质类固醇治疗的生物标志物)收集的87例COPD患者的476份痰样本进行了基于16S rrna的纵向微生物组调查[12,13],据我们所知,这是迄今为止最大的特征明确的COPD肺部微生物组队列。我们发现肺微生物群的变化与COPD的特定临床和生化特征相关,从而进一步了解肺微生物群落、宿主炎症反应和疾病发病机制之间的关系。
方法
受试者和样本
COPD患者的痰样本在四种访问类型下纵向收集:稳定状态(定义为8周无加重),加重(根据Anthonisen标准定义[14]及/或医疗保健用途[15]),治疗后2周和康复时(加重后6周来访)。根据指南,使用口服皮质类固醇和抗生素治疗病情加重[16]或研究设计[13].在线补充材料提供了关于方法、研究对象、DNA测序、试剂对照和生物统计分析的额外信息。
微生物分析
根据制造商的方案,使用Qiagen DNA Mini试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)从痰样本中提取细菌基因组DNA,并在适当的控制试剂污染的情况下,用pcr扩增16S rRNA基因的V3-V5高变区。使用454 Genome Sequencer FLX平台(454 Life Sciences;Roche Diagnostics, Burgess Hill,英国)。测序读数使用QIIME(定量洞察微生物生态)管道版本1.7处理[17].使用严格的标准来去除低质量和嵌合的读数。其余的读数由开放参考操作分类单元(OTU)挑选(97%的鉴别截断)。序列数据保存在国家生物技术信息中心序列读取档案(SRP065072)。
统计分析
简单地说,加重表型是根据之前建立的微生物和临床标准来定义的[12].由于数据缺失,28个加重样本的表型尚未确定。对加重期表型、微生物区系和/或临床资料进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、受试者工作特征曲线重建和网络分析。在临床变量和α多样性(样本内微生物多样性)的四项测量之间构建了一般线性混合模型(GLMM): OTU丰富度、Shannon’s H、chao1和Faith’s系统发育多样性。为了确定β多样性(样品间微生物组成不相似)的临床预测因素,在门、属和OTU水平上对临床变量和分类单元的相对丰度进行了典型对应分析(CCA)。采用主成分分析(PCA)鉴定生物标志物因子。错误发现率法用于调整(形容词)多个试验的p值[18].
结果
肺微生物组概况
87名受试者在稳定状态、加重、治疗后2周和恢复6周时连续采集痰样本(图1).在病情加重时,受试者根据指南使用抗生素、口服皮质类固醇或两者联合治疗[16]或研究设计[13].所有急性发作时的样本都是在治疗开始前获得的。表1而且2显示受试者的临床特征。如前所述(以下描述为I组受试者),在一定比例的受试者(n=54)的稳定和恶化样本中收集痰和血清介质数据[12].经过解复用和质控过滤,得到4 500 748条DNA测序reads。基于千斤顶主坐标分析(PCoA)重采样分析,每个样品的稀疏深度为1666个reads(在线补充图S1)。在476个样本中鉴定出1193个OTUs。
根据总体门组成,样本分为三个组:变形菌门、厚壁菌门或拟杆菌门亚组(在线补充图S2)。~ 98.4%的序列属于厚壁菌门(51.4%)、变形菌门(35.9%)、放线菌门(6.5%)、拟杆菌门(4.6%)等4个门之一。在已鉴定的366个属中,数量最多的属为链球菌(41.1%),嗜血杆菌(18.9%),莫拉克斯氏菌属(5.6%)和假单胞菌(4.4%),这些微生物都是肺部菌群的典型成员[24].的属链球菌(患病率95.0%),嗜血杆菌(94.7%),罗思氏菌属(94.1%),韦永氏球菌属(93.2%)和普氏菌(90.3%)在所有访视个案中极为普遍(表3).在同一次访问中,微生物群落的受试者间差异显著更大(加权UniFrac±sd0.387±0.186),与每个受试者的时间变化(加权UniFrac±sd0.272±0.181,使用t检验,p=2.2e−16),这表明在我们的队列中,肺部微生物组随着时间的推移相对稳定[8].
在病情加重期间,微生物群发生了变化
先前的报道强调了细菌在慢性阻塞性肺病加重中的重要性[19,20.].我们的结果表明,与稳定样品相比,急性加重期α多样性(样品内的微生物多样性)总体降低,少量且不显著的微生物组成转向变形菌门相对丰度的增加(配对t检验,增量p=0.42)和厚壁菌门的减少(配对t检验,增量p=0.73) (图2一个).莫拉克斯氏菌属在加重期间变化最大,相对丰度平均增加5%(配对t检验,adj. p=0.22;图2一个b).其次是链球菌(3.8%, p=0.58,配对t检验)嗜血杆菌(3.0%,配对t检验,p=0.57)。虽然这些变化在配对稳定和加重样本的比较中没有统计学意义,但在莫拉克斯氏菌属比较加重时观察到与所有非加重的样本(形容词=0.022使用t检验)。
进一步的分类分析显示,95.6%的莫拉克斯氏菌属DNA序列读取对应于一个OTU(861881),它与呼吸道病原体相同的16S rRNA片段具有100%的序列一致性莫拉克斯氏菌属复活[21].OTU 861881的相对丰度与菌量呈显著正相关复活的通过定量PCR检测(在线补充图S3)。丰富的莫拉克斯氏菌属与两种宿主因子相关性最显著,即痰中性粒细胞百分比(adj. p=0.002, r=0.18)和痰巨噬细胞百分比(adj. p=0.005, r=−0.19)。
的总体增长莫拉克斯氏菌属在整个数据集的急性发作期间,来自同一受试者的配对样本的比较显示出一些异质性莫拉克斯氏菌属变化(图2 c).的相对丰度增加莫拉克斯氏菌属在87名受试者中,有36人观察到由于可能获得新的莫拉克斯氏菌属在23个受试者中,在稳定的样本中无法检测到OTU,并且是一种预先存在的显著结果莫拉克斯氏菌属在另外13个研究对象中,物种平均增加了268倍(从2.3- 1412倍不等)。
微生物组区分细菌性和嗜酸性粒细胞加重
根据先前发表的生物学标准,加重表型被定义为细菌(n=33例加重样本)、嗜酸性粒细胞(n=19例)、病毒(n=15例)、细菌/嗜酸性粒细胞组合(n=3例)、细菌/病毒组合(n=12例)或少炎性(n=27例)[12].在不同表型的受试者发作期间,在门和属水平上观察到不同的微生物组分布(图3一).细菌性和嗜酸性粒细胞性加重之间的差异最为明显,两者在组成上的差异比其他亚组之间的差异更大。特别是,细菌亚组的α多样性(t检验p=0.04)和厚壁菌门(t检验p=6.3e−5)显著降低,变形菌门(t检验p=2e−4)显著增加。图3一).在属水平上,这对应于的显著减少链球菌(p=0.002,使用t检验)和增加嗜血杆菌(p=0.008, t检验)。此外,在恶化期间,嗜酸性粒细胞亚组中变形菌门:厚壁菌门比例显著降低,与所有其他亚组形成鲜明对比(在线补充图S4)。此外,细菌和嗜酸性粒细胞亚组的个体加重样本在两种PCoA中都相对不同(图3 b)和算术平均聚类分析的非加权对组法(图3 c).然而,PLS-DA在结合临床和微生物组数据预测细菌和嗜酸性粒细胞加重事件方面仅显示出适度的改善与单独的临床数据(图和在线补充表S1)。
网络分析揭示了潜在的微生物群相互作用
为了深入了解肺微生物组中细菌OTU之间的相互作用,我们使用CoNet(共现网络干扰;http://psbweb05.psb.ugent.be/conet/index.php) [22].对微生物网络的检查显示,它主要由几个与多个其他节点高度连接的“枢纽”OTUs (图5一个在线补充表S2)。例如,网络中连接程度最高的OTU是OTU 240755 (嗜血杆菌spp.),与其他33个OTUs有共同排他关系。随后是OTU 861881 (莫拉克斯氏菌属), otu956702 (嗜血杆菌spp.)和OTU 4445466 (链球菌Spp .),所有这些细菌都与微生物群的其他成员有大量的负面联系。结果表明,OTU 240755、OTU 861881和OTU 956702的丰度增加均与微生物α多样性的显著降低相关(Shannon’s H与OTU 240755 adm . p=1.6e−21,r=−0.43;OTU 861881 adm . p=8.8e−8,r=−0.24;和OTU 956702 adm . p=1.1e−9,r=−0.28)。除了共排除之外,还观察到细菌物种之间的共存模式,例如五个OTUs在紧密连接的子图中表现出强烈的相互合作关系(图5一个).
痰趋化因子(C-X-C motif)配体8/白细胞介素8作为群落结构和多样性的指标
我们应用了扩展的网络分析,包括细菌OTUs和临床变量,以研究人类宿主与肺部微生物组的潜在相互作用。排除强相关的临床变量后,共选取66个临床变量。一些痰介质,包括痰白细胞介素(IL)-8/趋化因子(C-X-C motif)配体(CXCL)8,基质金属蛋白酶(MMP)-7和MMP-8在网络中呈高度连接的节点(图5 b和在线补充表S3)。其中痰液CXCL8/IL-8菌群连通性最高,与15个OTUs呈显著负相关。
痰液中CXCL8/IL-8与菌群α多样性呈显著负相关(GLMM法p<0.05;表4在线补充图S5)。这一发现得到了PCA分析的支持,其中α多样性与生物标志物细菌8(或主成分8)呈负相关,CXCL8/IL-8是其中最高的负载变量之一(r=0.302;在线补充表S4和S5)。生物标志物因子8的其他主要变量是抗炎标志物血清IL-10 (r= - 0.440)和肿瘤坏死因子(r=0.336)。总的来说,网络分析表明,特定微生物群和与炎症相关的人类生物标志物之间存在显著的相互作用。
我们还进行了CCA,以测试临床变量与不同分类水平上微生物组成变化的关联。为了考虑每个受试者的多重测量,我们将分析限制在从I组受试者收集的初始样本上。在OTU水平上,血清MMP-7和痰中性粒细胞百分比均与微生物组成显著相关(CCA组p<0.05;表4).痰液CXCL8/IL-8、痰中性粒细胞百分比和血清集落刺激因子-2在门水平上与变异显著相关,痰液CXCL8/IL-8、痰中性粒细胞百分比和血清MMP-7在属水平上显著相关(使用CCA时p<0.05;表4).
讨论
COPD的发生和严重程度是通过宿主免疫系统、环境因素和呼吸道病原体之间复杂的相互作用介导的。我们的研究进一步深入了解了肺微生物组在COPD中的作用,包括一个大的患者队列和多次临床访问的重复纵向采样。一项关键发现是肺微生物组的变化与COPD的多种特征之间的关联,包括特异性加重表型、治疗方案和关键痰液和血清介质的水平。
与以往的研究一致,COPD加重事件似乎与微生物多样性降低和变形菌门比例增加有关[8,23].此外,还有一个显著的增殖莫拉克斯氏菌属在加重期间的亚组受试者中(87名受试者中有36名)。复活的是一种重要的呼吸道病原体,在COPD加重期间通过刺激几种中性粒细胞相关成分来增强气道炎症[21].的丰度之间始终存在显著的正相关莫拉克斯氏菌属以及痰中中性粒细胞的百分比。尽管COPD具有异质性,但我们的研究结果表明,COPD患者的特定亚组在病情加重期间特别容易受到微生物组变化的影响。
在细菌性和嗜酸性粒细胞性加重的受试者中,在加重期间存在不同的微生物群,它们在微生物组谱上的差异比病毒加重时的差异更大。这与细菌和嗜酸性粒细胞加重反映其免疫发病机制的根本差异的观点是一致的,而病毒加重往往与细菌感染和嗜酸性粒细胞增加有关[12,24].嗜酸性粒细胞性炎症的存在或不存在可能是潜在相关微生物组分层的潜在生物标志物。
我们的研究表明,目前的标准护理治疗可能会改变肺部微生物群。特别是,在仅接受类固醇治疗的受试者中,观察到微生物多样性减少,变形菌门:厚壁菌门比例增加,而在接受抗生素治疗的受试者中,趋势相反。在一项针对12名COPD受试者的小型研究中,也观察到了这些治疗后肺部微生物组的类似变化[8].为支持有关类固醇疗效有限而副作用较大的报告[25,26]我们的研究结果表明,类固醇单独可能会影响肺微生物组,并强调了患者分层方法的重要性,如血液嗜酸性粒细胞引导的强的松龙治疗[13],朝着更精确的药物管理策略发展。
在我们的网络分析中,几种细菌OTU,特别是OTU 240755属于嗜血杆菌,被确定为微生物“枢纽”,与其他OTUs有不成比例的大量负面联系。这种相关性在所有样本中都是高度稳健的,表明这可能代表了COPD肺部微生物组的一般模式。因此,这些细菌OTUs的过度生长可能导致呼吸道生态失调,这被认为是肺部疾病恶化的潜在原因[27].最近的研究强调了生态相互作用在多种人体栖息地的重要性。一个正在出现的范式是“关键物种”假说,即相对较少的细菌物种丰度的微小变化也可能对整个微生物群落结构产生深远影响,从而改变人类疾病状态[22,28,29].基于我们的网络分析,我们推测嗜血杆菌细菌,可能还有其他变形菌门,可能会将正常的肺部微生物生态系统改造成一种失调状态,从而引发宿主的促炎反应。我们的研究结果表明,肺部微生物组中的“关键物种”假说值得进一步研究,因为它可能为新的治疗策略提供概念基础,这些策略针对一些关键的细菌靶点来对抗COPD中的微生物群落失衡。
痰液中CXCL8/IL-8与肺部微生物群落多样性及其整体群落结构显著相关,因此CXCL8/IL-8可作为监测肺部整体微生物群落的合适生物标志物。痰液CXCL8/IL-8长期以来被认为在COPD中发挥突出作用[30.,31].它主要通过招募中性粒细胞和上调气道粘蛋白基因来诱导气道炎症,导致粘液产生[32].痰中CXCL8/IL-8水平升高与COPD严重程度升高相关[30.,33,34].该属的致病成员嗜血杆菌而且莫拉克斯氏菌属能够通过使宿主暴露于脂多糖和其他病原体相关分子模式而直接诱导炎症[35].有趣的是,我们的网络分析显示,肺微生物组中的多个成员与痰CXCL8/IL-8呈负相关,几个OTUs由嗜血杆菌,莫拉克斯氏菌属而且链球菌物种。潜在地,这些病原体也可能通过肺微生物群的失调间接触发CXCL8/IL-8的过度产生。因此,我们推测肺微生物组可以作为另一道防线,形成呼吸道病原体诱导的肺部炎症反应[27].
对我们的研究有几个注意事项。首先,尽管队列规模很大,但我们的调查只关注COPD加重患者,没有健康或非加重者对照。来自这些人群的数据可以为确定正常肺部微生物群以及导致COPD发病的微生物组成变化提供信息。其次,除了细菌,病毒和真菌在COPD中的重要性才刚刚开始被认识和研究[36- - - - - -38].细菌、病毒和真菌微生物群的系统生物学观点整合了额外的宿主反应因子,如宿主转录组和代谢组谱,将促进我们对宿主-微生物群相互作用及其在疾病病因学中的意义的理解。最后,我们的结果需要在更大的、不同的患者群体中得到复制,包括那些具有不同种族和生物地理背景的患者。
总之,我们表明肺部微生物组的变化与COPD加重事件相关,并可能与介导某些受试者的宿主炎症反应有关。此外,这项工作进一步加深了我们对COPD肺部微生物组的理解,并为新的生物标志物和呼吸治疗开辟了潜在的途径。
确认
我们感谢Deepali Jhamb和Michal Magid-Slav(计算生物学,GSK R&D, King of Prussia, PA, USA)对本研究的统计分析提出的建议。
脚注
编辑评论见呼吸呼吸J2016;47: 1034-1036 [doi:10.1183/13993003.00270 -2016].
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支持声明:该研究由莱斯特大学医院国家卫生服务(NHS)信托基金赞助。研究队列BEAT-COPD (COPD加重期靶向抗生素和全身皮质类固醇治疗的生物标志物)由医学研究委员会(英国)和阿斯利康联合资助,微生物组分析由葛兰素史克(GSK)资助。C.E. Brightling和M. Bafadhel由国家卫生研究所(NIHR)资助,并得到莱斯特NIHR呼吸生物医学研究组的额外支持。王正哲是葛兰素史克早期人才博士后奖学金项目的资助人。本文仅代表作者个人观点,并不代表NHS、NIHR或卫生部的观点。
临床试验:本研究注册在www.isrctn.com,标识号为92422949。
利益冲突:可以在本文的在线版本中找到信息披露www.qdcxjkg.com
- 收到了2015年8月24日
- 接受2015年12月6日。
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