文摘
结节病是一个复杂的系统性炎性疾病原因不明的受多种基因和环境因素的影响。
进一步确定为结节病易感性位点,进行全基因组关联研究(GWAS) 381例和392年控制个人基于Affymetrix 100 k GeneChip数据。排名前25位的单核苷酸多态性(snp)被选为验证在一个独立研究小组(1582名患者与1783控制)。
变体rs10484410染色体上6 p12.1显著相关,Bonferroni-corrected假定值为2.90×10−2在验证样本的名义假定值2.64×10−4在GWAS。广泛的好小说的轨迹缩小信号映射到一个地区组成的基因BAG2,C6orf65,KIAA1586,ZNF451和RAB23。验证的sarcoidosis-associated产生的SNP rs1040461进一步独立病例对照样品和定量mRNA表达研究指出RAB23基因是最可能的风险因素。RAB23提出了参与抗菌防御过程和声波刺猬信号通路的调控。
确定协会的6 p12.1轨迹与结节病牵连到这个轨迹作为进一步易感性因素和RAB23作为一个潜在的信号组件,可能会打开新的视角在结节病的病理生理学。
结节病(孟德尔遗传在人(MIM) 181000)是一种多系统疾病的高风险成为慢性的特点是noncaseating epitheloid细胞肉芽肿,可以在几乎任何器官系统清单,最常见的肺。它被认为是一种疾病的年轻人,之间的年发病率< 1和每100000人64例,根据种族和地理区域(1]。结节病的原因仍然未知,但被认为是由一个复杂未知环境的结合2,3和遗传因素4]。证据提供了一个强大的遗传因素通过双和家庭研究,显示结节病的和合率更高的同卵与异卵双胞胎相比(0.148与0.012)和66%的遗传5]。结节病的遗传基础是由已知的遗传风险因素进一步支持位于人类白细胞抗原(HLA)地区(综述(6]),发现第一个证实易感性基因butyrophilin-like 2(BTNL2;MIM 606000) 6号染色体上7,8]。除了这些疾病位点,众多关联研究的潜在候选人地区提出额外的易感基因,比如趋化因子受体趋化因子受体2(CCR2;MIM 601267)和趋化因子受体5(CCR5;MIM 601373),的肿瘤坏死factor-α(TNFA;MIM 191160),和其他几个HLA位点(审查[4,6])。然而,这些结果相互矛盾或等待复制。最近,我们发现了annexinA11(ANXA11;MIM 602572)在结节病进一步疾病相关基因的全基因组关联研究(GWAS)使用Affymetrix 5.0芯片(美国Affymetrix,圣克拉拉,CA) (9]。此外,我们发现了一个共同的易感性位点结节病和克罗恩病(MIM266600)染色体10 p12.2基于联合分析的Affymetrix 100 k GWAS扫描两种疾病(10]。
100 k和5.0芯片份额只有很小比例的单核苷酸多态性(snp)(< 15%的100 k数组snp也存在5.0)。因此,我们分析了100 k结节病的数据集,这是以前只有部分综合分析克罗恩氏病(汇集数据)(10),识别易感性位点5.0芯片不可能被发现的由于不同标记的报道。
方法
病人招聘和表现型
德国结节病病人的面板(GWAS)、B(验证)和C(细映射)招募了如前所述[7,9,11(有关详细信息,请参阅附录S2在网上补充材料)。参与患者的诊断的基础上,建立了国际共识声明结节病(12)和组织学示范non-necrotising肉芽肿的器官,最常见的肺。只有古典洛夫格伦综合征患者招募没有组织的支持。根据疾病的临床表现,患者分为有慢性或急性结节病如前所述13]。病人(n = 210)不能分类明确有关疾病的过程中被排除在subphenotype-specific分析进行了精细定位的阶段。德国控制个人的面板,B和C都从PopGen获得生物(加拿大蒙特利尔,QC) [14]。面板D(复制)由结节病病人从不同的欧洲地区招募在欧洲网络Genotype-Phenotype关系结节病(GenPhenReSa)(详情请确认部分和附录S1在线补充材料)和德国控制(n = 2564)招募了详细报道之前(15]。
SNP基因分型和选择信息,统计分析,分析组织表达通过rt - PCR,支气管肺泡灌洗细胞样本,和mRNA隔离和实时PCR可以在附件中找到S3-S10在线补充材料。
结果
GWAS分析
后保守和建立质量过滤器应用到数据集(见方法部分),773年德国样本(381例和392控制)和97088个snp是包含在该协会的分析检查阶段。在名义上的显著性水平为0.05,实验了63%前的电力检测变异的优势比(或)≥1.5时假设20%的变异等位基因频率在对照组(见图S3在线补充材料)。估计人口分层很小,λ的基因组通货膨胀因素GC= 1.076(1.0指示没有通胀)。随后协会结果修正根据这个卡方检验统计量的通货膨胀;结果quantile-quantile图所示图1。
验证铅变体
25个snp的筛选阶段,通过上述标准(见方法部分)基因分型的独立验证小组B(1783年德国控制和1582年德国结节病病人)。协会为这些snp分析结果所示表1和完整的分析结果包括基因型数量表中列出S1在线补充材料。只有一个标记,rs10484410染色体上6 p12.1通过Bonferroni调整为多个测试(纠正p = 25×1.17×10−3= 2.90×10−2)和与结节病显著相关(参见全基因组染色体的情节;图S4在线补充材料)。罕见的G等位基因的等位基因或rs10484410为1.26 (95% CI 1.10 - -1.44)。只有5.8%的控制个人风险等位基因的纯合子rs10484410 G,而7.1%的结节病病例纯合子。
扫描没有确认我们之前报道的结节病协会BTNL2(7),ANXA11(9在筛选)。这两个位点在独立的欧洲人(复制ANXA11(19),BTNL2(20.])和美国人(BTNL2(8),可以视为真正的联系。然而,没有一个SNPANXA11或在BTNL2人类基因存在于Affymetrix GeneChip®100 k组的映射,它显示了< 15%标记重叠与500 k数组集合。相反,在先前发表的GWAS使用Affymetrix 5.0芯片(9),导致SNP rs10484410本身并不包括在内,但rs1044670 (snp_a - 1824553;p = 9×10−3)被发现在精细定位阶段密切相关。然而,苏格兰民族党排名在前面的GWAS只有很低(排名6229)。验证阶段的结果验证了使用基因分型结果TaqMan作为一个独立的技术(基因型一致> 99.8%)。
好映射rs10484410 (6 p12.1)
除了铅SNP rs10484410 44人类基因组单体型图标记SNP (tagSNPs)被选为细∼800 kb的映射6 p12.1地区(见方法部分)在面板进行c . 41的44个snp通过上述质量标准(见方法部分)。九个标记了一个假定值< 0.05的分析;详细的结果,包括基因型数量整体结节病面板,如表所示S2在网上补充材料。多个测试结果没有纠正,因为面板C分析的目的是确定协会的可能的源信号,成立于面板b差异不一致在协会的意义信号标记测试可以观察慢性和急性表现型之间(见表S2和S3在线补充材料)。
rs10484410之间的连锁不平衡(LD)和9个额外的单核苷酸多态性显著协会从面板C (r这种差别很大2= 0.41 - -0.99;见表S2在线补充材料)。的10个标记,SNP rs1411578显示最强协会(p = 6.64×10−4)。标记rs1411578 (G > C)位于外显子7 (UTR))(3′端非翻译区Ras-related蛋白质Rab23 (RAB23;MIM 606144)。小G等位基因频率为17%在受影响的个人和对照组的14%和3.5%的患者和2%的控制人纯合子。图2概述协会的信号,保护状态,在基因和LD结构6 p12.1轨迹。
扩展好映射
自从第一个指出精细定位阶段的结果RAB23细致入微的位点增加复合利率头寸57190 kb和57271 kb基于人类基因组单体型图数据(图2 b),我们旨在确保协会信号是有限的RAB23基因组区域,不延长上游或下游。我们因此样本面板组C为另一个46人类基因组单体型图CEU-based tagSNPs覆盖了∼105 kb SNP rs10484410铅和周围的地区RAB23基因组区域(表S3在线补充材料)。
看着总映射区域(∼900 kb),相关的最重要的SNP rs7756421,位于3′UTR锌指蛋白451(ZNF451)基因。高LD的标记是一个地区的一部分(r2≥0.8),其中包括八个其他相关变量映射到(p≤0.001)RAB23(rs1411578 rs11398 rs1547226 rs3800018),ZNF451(rs6459178 rs17619360和rs10484410)和nongenic区域(rs12190575) (图3)。产生的SNP (nsSNP) (rs1040461)RAB23基因显示一个重要协会(名义假定值(p笔名)= 7.83×10−3与结节病)不属于这组高度相关的标记。
我们使用一览表就是给予一定标准的信息逆向选择模型ikaike(21在逻辑回归分析来确定所有这些九重大信号可以认为,通过LD,到一个或多个潜在诱发变异。模型选择观察协会证实,所有高度相关的信号单核苷酸多态性有一个单一的起源。如果显著相关nsSNP rs1040461也包括在内,它仍然选择后的模型,从而可能代表一个独立的协会的信号。
复制rs10484410, rs7756421 rs1040461
GWAS SNP rs10484410,苏格兰民族党fine-mapped地区最强协会(rs7756421)和nsSNP rs1040461RAB23在面板D基因的基因复制。我们从小组,分配每个欧洲其他地方的数据集描述最接近群(22),随后包括subpopulation-specific平均值的前六个主成分(pc)的全基因组数据参考面板调整人口分层。没有调整采样位置,标记rs10484410 rs7756421显示重要的协会与结节病等位基因水平(p笔名= 3.30×10−3和p笔名= 5.10×10−3分别),而rs1040461没有标志。然而,在前六个人电脑纳入模型,rs1040461显示名义p的意义笔名= 1.05×10−2多个测试校正后,仍然显著,而其他两个标记成为无意义的(prs10484410= 1.40×10−1和prs7756421= 1.80×10−1;表2)。只有德国病例分析和控制取得了类似的结果rs1040461 (p = 1.20×10−3没有调整采样位置和p = 1.05×10−2与调整),但是其他两个标记的轻微下降意义(prs10484410= 6.90×10−2和prs7756421= 8.50×10−2没有调整,prs10484410= 1.40×10−1和prs7756421= 1.80×10−1调整)。
候选基因的表达分析
缩小协会信号通过合理的生物学推理,这五个基因的转录水平(袋家族分子伴侣调节器2 (BAG2;MIM 603882),本domain-containing蛋白6(C6orf65;BEND6),uncharacterised蛋白质KIAA1586,ZNF451和RAB23)位于fine-mapped地区首次评估rt - pcr在一组不同的人体组织。所示图4,只有RAB23和ZNF451显示肺癌的高表达,而BAG2和KIAA1586表达在这个组织相当低。C6orf65信使rna只能发现在大脑组织和其他一些组织在极低的水平。有趣的是,高表达RAB23在小肠和结肠粘膜也变得明显。
接下来,我们分析候选基因的表达水平在细胞来自支气管肺泡灌洗(BAL)使用定量实时PCR和cDNA结节病病人和控制每组(n = 5)。所示图5,四个五个候选基因表达BAL细胞C6orf65(BEND6信使rna检测不到。最有趣的是,统计分析显示RAB23显示病人和控制之间的相对表达水平的显著差异(p = 2.94×10−3基于Mann-Whitney U- - - - - -非参数检验数据)。与控制相比,BAL细胞结节病病人表现出增加了三倍RAB23信使rna水平,进一步强调的潜在参与这个基因在结节病的发病机制。
为进一步表达分析看到表达式(eQTL)数量性状的结果在网上补充材料(图S5A-S7C)。
讨论
我们发现小说结节病易感性位点的染色体6 p12.1港口的五个候选基因C6orf65(BEND6),KIAA1586 BAG2 ZNF415和RAB23。这个结果是通过全基因组扫描病例对照关联分析数据与> 97000 SNP标记和广泛验证区域的映射。结节病轨迹扫描没有证实ANXA11最近被发现使用Affymetrix 5.0芯片。没有一个SNPANXA11人类基因存在于Affymetrix GeneChip®100 k组映射显示< 15%标记重叠5.0。相反,5.0芯片覆盖新发现的风险位点的染色体6 p12.1有16个单核苷酸多态性,包括SNP rs1044670高度相关。尽管这是一个真正的信号,苏格兰民族党排在任何可行的截止之前复制的GWAS(排名6229),因此,没有验证。
罕见的等位基因或等位基因的发现GWAS铅SNP rs10484410是温和的(1.26)。我们必须指出,结节病的患病率较低一般人群强烈限制可用样本的数量。反过来,招募足够的样本实现全基因组遗传因素的意义传达moderate-to-small风险或等位基因频率较低可能是不可行的。在这方面,我们的研究设计(GWAS存活率存在一步,导致小校正因子为多个测试验证阶段)启用的检测结节病的风险因素。
好小说的映射轨迹显示结节病与多个snp的紧密联系在一个小地区的高LD蔓延C6orf65(BEND6),在ZNF451,RAB23。在这些snp是四个假定的功能变体:rs1044670 (c。* 1109 g > A),位于3′UTRC6orf65(BEND6);rs1411578 (c。* 416 g > c)和3′UTR rs1040461外显子7 (c.619G >)RAB23;和rs7756421 (c。* 742 > G)的3′UTRZNF451基因。逻辑回归分析表明,该协会信号可能主要是由一个以上的变体RAB23,包括rs1040461错义突变。这个SNP改变了蛋白质序列的氨基酸替换小甘氨酸,极性氨基酸丝氨酸(G207年/秒207年)non-domain-containing区域的基因。复制在进一步面板显示rs1040461标志,但不是rs7756421或GWAS SNP rs10484410,似乎与结节病在一些欧洲人口调整采样位置。这一发现强烈支持的假设rs1040461作为一个真正的结节病风险变异。
组织mRNA表达谱分析表明高水平的RAB23和ZNF451健康的肺。此外,RAB23是唯一的候选人之间的基因显示相对高度显著差异表达结节病病人和控制,表明潜在的参与RAB23在疾病发病机理。的病理生理相关性研究结果表明变异的eQTL分析,确定了后续流程(如。应对外部刺激,细胞防御反应和代谢过程)的遗传变异。尽管这些发现并不证明的观察超表达RAB23结果变化rs1040461或相关地区的另一个潜在的致病变种,他们为未来的研究提供有价值的起点阐明的角色RAB23和它的变体的aetiopathogenesis结节病。
的RAB23基因属于160年的Rab家庭小鸟苷三磷酸酶调节细胞内贩卖膜相关蛋白(23,24]。基于微阵列表达数据(UCSC的GNF表达式Atlas 2数据和Affymetrix所有外显子芯片;看到URL 8在线补充材料),RAB23是更多的支气管上皮和甲状腺细胞中高度表达,除了子宫和小脑组织。这似乎是符合我们表达导致肺组织(见前)。
的潜在参与这个轨迹在结节病发病机理仍有待,可以拆散,到目前为止,只有提出工作假说。结节病是一个系统性免疫紊乱,T-cell-mediated炎症引起肉芽肿的形成,类似于迟发过敏性反应。延迟过敏反应可能是由于细胞内抗原的化学或微生物的来源。许多报道描述微生物细胞壁的存在代理组织结节病的患者和一些临床研究表明微生物在结节病的发生25,26]。自RAB23发挥作用的抗菌活性内生自噬机械(27),是生理上的障碍可能会导致受损的肺上皮细胞自噬后间隙接触细菌病原体。的高表达RAB23不仅在肺也在小肠和结肠粘膜可能指向一个更广泛的潜在作用RAB23抗菌防御机制的上皮屏障器官。
然而,RAB23蛋白质也被牵连在促进膜泡运输,控制内吞作用的发展为溶酶体(27,28),特别是在与声波刺猬(嘘)在神经系统中信号传导29日,30.]。有趣的是,嘘途径也可能在慢性肺纤维化中发挥作用和免疫系统通信(31日),从而提供另类观点的参与RAB23在结节病。嘘的组件级联已确定在成年人的免疫系统,参与CD4 + t细胞活化,纤维化肺疾病方面的研究展示了人类和小鼠肺局限于地区的嘘活动性疾病(审查[32])。假设嘘信号可能导致上皮修复并可能充当中介在相声受损上皮细胞和免疫/炎症系统。在结节病,激活肺辅助1型细胞炎症过程是必不可少的,可以找到特定的CD4 + t细胞亚群在极大地提高了水平BAL流体的结节病活动性疾病患者。它是可能的RAB23有助于嘘通路内的疾病通过功能障碍导致的over-activation CD4 + t细胞或不适当的维修过程在受损的肺肺结节病。
尽管有证据表明变化RAB23授予对结节病的易感性,也有可能致病变种位于ZNF451,C6orf65(BEND6)或另一个,还没有定义,遗传因素。ZNF451,也被称为过山车,KIAA0576和KIAA1702在脊椎动物,是守恒的,是广泛表达,建议作为类固醇受体共激活剂;它也可以参与转录调控33]。假定的基因C6orf65(BEND6)是一个复杂的轨迹似乎产生一些蛋白质没有序列重叠和未知的函数。
最后,这是第一次报告的结节病和之间的联系6 p12.1由几个基因位点,可能的候选者RAB23。这个观察的重要性应该评估通过进一步描述的生物作用RAB23在结节病。
确认
GenPhenReSa财团的成员是a。冈瑟(肺中心,吉森大学吉森,和肺诊所Waldhof-Elgershausen, Greifenstein,德国),a Dubaniewicz(部门Pneumonology,格但斯克的医科大学,格但斯克,波兰),美国帕布斯特(医疗诊所II,肺病学部门,波恩大学、波恩、德国),d . Bumbacea(马吕斯青年肺学研究所,布加勒斯特,罗马尼亚),a . Prasse和a . Grubanovic(肺病学部门,大学医学中心,Albrecht路德维希大学、弗莱堡,德国),p . Rottoli和大肠Bargagli(呼吸道疾病,临床医学免疫学,锡耶纳大学锡耶纳,意大利),p .医学教授(肺学部门,学术医疗中心,阿姆斯特丹,荷兰),诉Poletti (Ospedale GB Morgagni, Dipartimento di Malattie戴尔'Apparato Respiratorio e del Torace UO Endoscopia Toracica, Forli,意大利),m . Luisetti(我们Malattie Apparato Respiratorio, IRCCS亲自到圣Matteo-Pavia帕维亚大学帕维亚,意大利),和诉Vucinic j . Videnovic-Ivanov(贝尔格莱德,塞尔维亚的贝尔格莱德医学院)。
作者要感谢所有的病人,家属和医生合作。德意志的支持Sarkoidose-Vereinigung eV (Meerbusch、德国)的PopGen生物(加拿大蒙特利尔,QC)和贡献位肺脏。最后,我们感谢工作人员临床分子生物学研究所(德国基尔)技术援助。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
实验研究所的临床分子生物学,Christian-Albrechts-University,德国基尔。支持这项研究是由德国联邦教育和研究部门(BMBF)在国家基因组研究网络(NGFN)(批准号01 gs0426和01 gs0809)和德国研究基金会(DFG)通过卓越的集群“炎症在接口”以及通过项目脱硫μ692/8-1μ692/7-1。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2011年1月5日。
- 接受2011年4月2日。
- ©2011人队