文摘gydF4y2Ba
呼吸道合胞病毒是一种呼吸道疾病的主要原因。有冲突的人类上皮细胞的反应呼吸道合胞体病毒和缺乏数据对其影响纤毛功能。我们的目的是研究呼吸道合胞病毒感染的早期阶段主要人类基底和纤毛的文化。gydF4y2Ba
使用高速videomicroscopy,我们发现纤毛拍频影响呼吸道合胞病毒感染超过72 h;然而,纤毛运动障碍显著增加24 h内感染(p < 0.05)。透射电子显微镜显示,仅限于纤毛超微结构的异常细胞,包括增加的纤毛和线粒体损伤。免疫荧光共聚焦显微镜显示,呼吸道合胞体病毒从细胞表面抗原逐渐传播感染细胞的纤毛/ 3天。有趣的是,纤毛文化分泌更少比基底(祖)细胞培养病毒,产生了一种专注于招募中性粒细胞趋化因子响应。gydF4y2Ba
这项研究强调了不同的感染模型,强调了需要进一步探索纤毛细胞的作用建立呼吸道合胞病毒感染。gydF4y2Ba
纤毛运动障碍结合纤毛损失增加,上皮损伤可能会导致降低黏膜纤毛的清除在感染过程的早期。gydF4y2Ba
文摘gydF4y2Ba
增加的纤毛与纤毛运动障碍和上皮损伤会导致降低黏膜纤毛的清除gydF4y2Bahttp://ow.ly/qALuAgydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
呼吸道合胞病毒(RSV)的住院的主要原因是< 1岁儿童呼吸道疾病的世界,它感染几乎每个孩子2岁(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。最近的证据表明,病毒便发动了感染人类纤毛上皮衬里的鼻咽gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。我们曾表明,鼻刷活检与毛细支气管炎住院婴儿表现出显著的破坏的纤毛上皮RSV感染期间,复苏将许多周(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。最近人类呼吸道上皮纤毛在文化被用来探讨RSV感染的早期影响。这些研究得出了相互矛盾的结果。当一个研究报告标记细胞破坏和快速ciliostasis RSV[加法后gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),其他报告没有细胞病变效应(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),不影响纤毛拍频(CBF) [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]在许多天,暗示黏膜纤毛的纤毛组件的间隙的影响不大。然而这些研究缺乏评价纤毛功能的一个至关重要的方面,纤毛击败模式。之前我们已经表明,在某些表型原发性纤毛运动障碍,黏膜纤毛的间隙严重减少,纤毛运动障碍的方式击败,尽管CBF被维持在一个正常水平gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。此外,我们表明,冠状病毒引起的感染健康志愿者的上皮损伤和纤毛运动障碍,但并不影响CBF (gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
本研究的主要目的是评估RSV感染的早期影响的模式和频率的人类纤毛上皮细胞在文化、测试假设RSV感染会显著增加纤毛运动障碍。第二个方面的偏好的研究旨在探讨RSV感染纤毛细胞和比较两个感染RSV的效应模型:人类的基底细胞和纤毛细胞培养。为此,我们评估的模式病毒抗原在基底和纤毛细胞文化传播使用免疫荧光显微镜。我们还研究了模式的细胞因子和趋化因子的分泌的顶端表面基底和纤毛细胞培养。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
主题gydF4y2Ba
人类鼻腔上皮细胞获得健康对照组(n = 9)值(范围)21(19-49)岁没有鼻史或呼吸道疾病的人。所有的患者在药物和没有公布上呼吸道感染症状前6周。所有个人把他们的同意被包括在研究和获得的所有样品都是与个人的权限和伦理批准莱斯特大学的研究伦理委员会(英国莱斯特)。gydF4y2Ba
呼吸道上皮细胞培养gydF4y2Ba
获得的人类纤毛上皮刷下鼻鼻甲有2毫米细胞学刷(英国Southend-on-Sea Keymed)如前所述[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。纤毛上皮样本大力用移液器吸取到2毫升20 mM HEPES-buffered介质199 (pH值7.4)(Gibco生活技术,佩斯利,英国),含青霉素(100 IU·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)、链霉素(100μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和二性霉素b(2.5μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)分拆大型细胞团和一夜之间保持在4°C。1毫升被放置在一个胶原蛋白涂层的12-well板(Sigma-Aldrich,普尔,英国)连同1毫升基底上皮生长培养基(BEGM),含青霉素(100 IU·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)、链霉素(100μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和二性霉素b(2.5μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba),在37°C。媒介洗澡基底细胞每2 - 3天更换一次。当细胞> 90%汇合的细胞被分离使用胰蛋白酶/ EDTA (Sigma-Aldrich) 5分钟。然后细胞离心(4000×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟)和上层的移除。的颗粒在BEGM resuspended 1×10的浓度gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。400年μL细胞悬液添加到每个好24-well板(Sigma-Aldrich)或Lab-TekII有房间的盖玻片幻灯片(获取高分辨率图像)和增长直到≥80%汇合的。gydF4y2Ba
剩下的基底细胞被播种在collagen-coated,半透膜支持(Transwell-Col;12毫米直径;0.4 -μm孔隙大小;Corning-Costar,康宁公司)如前所述gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。80%的融合,顶端细胞中被删除和保存在一个气液界面(ALI)允许分化的上皮细胞亚型。分化良好型的文化研究阿里文化的起始∼4 - 6周后,除非另有说明。细胞从两个人产生基底细胞用于实验和阿里文化。gydF4y2Ba
病毒株和生长条件gydF4y2Ba
野生型RSV应变A2股准备BSC-1猴肾细胞的单层膜不需抗生素格拉斯哥的最低必要的与不必要的氨基酸中补充和2% (v / v)以5%的胎牛血清有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和37°C。股票被破坏的玻璃珠收获1分钟,上层清液离心机在1000×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟去除细胞碎片。滤液被离心提纯通过polyethersulfone膜孔隙大小1000 kDa分子量截止(Vivaspin-20;Vivascience,格洛斯特,英国),如前所述gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。病毒的分数被收集和集中在支气管上皮细胞基底介质(BEBM;Lonza、绝望、英国),包含约0.5 1×10整除gydF4y2Ba6gydF4y2Ba斑单位(PFU)·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba被储存在-80°C。gydF4y2Ba
病毒感染的主要上皮细胞培养gydF4y2Ba
冷冻整除的RSV立即解冻之前使用。基底细胞感染,400μL病毒悬架(感染复数(MOI)每细胞微升0.1∼)稀释在BEBM申请1 h在37°C。控制井仅接受BEBM。这一次后,病毒培养液移除,细胞在BEGM孵化。感染被允许继续进一步72 h。这时,上层的是收获和储存在-70°C细胞因子分析。gydF4y2Ba
阿里文化感染,阿里文化是冲洗的顶端表面与介质(BEBM)和200μL病毒培养液(MOI每细胞微升0.1∼)BEBM应用于顶端表面1 h在37°C,然后删除。控制井仅接受BEBM。所有细胞被喂食管基底与新鲜阿里介质之前感染。感染被允许持续20 - 72 h。这次的顶端表面后再冲洗介质,这是收集和储存在-70°C细胞因子分析。细胞被固定在一夜之间有4% (v / v)为疣状多聚甲醛在PBS。gydF4y2Ba
CBF和节奏模式gydF4y2Ba
确定纤毛活动的变化,呼吸道细胞文化被放置在一个孵化室在37°C和观察gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba倒置显微镜系统(尼康TU1000;尼康,英国Kingston-upon-Thames)配备一个机动阶段。文化被允许平衡前30分钟阅读。感染前,五个不同的位置坐标从每个Transwell纤毛地区使用NIS元素插入得救了AR软件(尼康)允许重复观察相同的区域。击败纤毛记录使用的老手数字高速摄像机(美国纽约湖图像系统,亨丽埃塔)250帧每秒的速度使用40×目标如前所述[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。能动的纤毛细胞的数量在每个样本区域统计(运动性指数),一半是用来确定平均CBF。个别纤毛细胞的CBF决心通过计算所需的帧数5清楚地观察到的全部扫纤毛小费。这是通过一个简单的计算转化为CBF (CBF = 250 /(5胜数帧)×5)(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。纤毛运动障碍定义为纤毛细胞显示不协调的能动的纤毛或那些打用硬,闪烁或抽搐的动作。运动障碍指数计算的百分比运动障碍的纤毛细胞相对于运动型的总数纤毛细胞。由两个观察员的视频序列进行分析(c . Smith和p . Radhakrishnan);第二个观察者(p . Radhakrishnan)被蒙蔽到治疗和时间点记录。gydF4y2Ba
趋化因子和细胞因子分析gydF4y2Ba
趋化因子和细胞因子测定使用96 - multispot化验(内消旋规模发现(MSD),罗克维尔市,医学博士,美国)根据制造商的指示。细胞因子测定使用人类辅助细胞(Th1 / Th2)类型标准10点板和人类趋化因子是使用高测量的乐队MS6000十板,使用部门成像仪6000 (MSD)。较低的检测极限是1 pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
免疫荧光显微镜gydF4y2Ba
细胞被固定为4% (v / v)多聚甲醛在PBS一夜之间在4°C。固定后,细胞与PBS洗了三次,接受3% (w / v)牛血清白蛋白(BSA)在PBS 10分钟来阻止非特异性相互作用,又洗了三次PBS。所有后续抗体孵化项目进行了PBS含有1% BSA(重量/体积)。试剂用于免疫荧光在这项研究是山羊anti-RSV多克隆抗体(ab20745;40μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;Abcam,英国剑桥)和鼠标anti-acetylatedα-tubulin单克隆抗体(克隆6-11B-1;1μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;σ)。主要抗体进行孵化项目2 h,三洗PBS紧随其后。检测主要抗体进行了使用以下辅助试剂2 h:荧光素isothiocyanate-conjugated兔抗体(1:200;σ)或594 -共轭AlexaFluor兔子anti-mouse抗体(摘要;表达载体,佩斯利,英国)。所有二次抗体检测,发现是负了大反对人类上皮细胞。DNA染色(0.2μg·赫斯特33258毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。在PBS三最后洗之后,插入被切断的支持和安装在盖玻片在80% (v / v)甘油,3% (w / v)gydF4y2BangydF4y2Ba-propylgallate (PBS)安装介质。低放大图像获得使用尼康TU1000倒置显微镜配备NIS元素的软件使整个井的图像的采集。高分辨率光学部分得到使用徕卡TCS SP5共焦显微镜配备了徕卡DMI 6000 b倒置显微镜(徕卡,米尔顿凯恩斯,英国)使用63×石油目标(数值孔径,1.4)。图像通过共焦显微镜被伊万里瓷器渲染软件(Bitplane AG)、苏黎世、瑞士)使用混合或最大强度投影过滤器。gydF4y2Ba
透射电子显微镜法gydF4y2Ba
在最近的一项研究中我们用透射电子显微镜(TEM)显示纤毛损失严重哮喘患者的特征(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。确定RSV感染也导致纤毛损失,我们获得了三个额外的样品从健康对照组(中位数(范围)(24-58)29岁)通过刷牙支气管中间部(通过灵活的支气管镜检查),纤毛细胞培养和感染。感染后,细胞被固定在4% (v / v)戊二醛和加工如前所述gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
统计分析了使用GraphPad棱镜5 (GraphPad、圣地亚哥、钙、美国)。CBF(赫兹)表示决心随机选择后纤毛。任何差异在纤毛活动观察控制和RSV决心用配对t。非参数数据称为中位数(四分位范围)。类内趋化因子/细胞因子释放的大小的比较进行了使用魏克森讯号等级测试。组间比较进行使用Mann-Whitney紫外线测试。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
纤毛功能RSV感染的效果gydF4y2Ba
鼻纤毛上皮细胞显示更高比例的运动障碍的纤毛RSV感染后gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。中位数(四分位范围)运动障碍指数显著增加(p < 0.05),早在24小时post-RSV感染(21(17-25)%)与控制(10 (2 - 13)%)。进一步增加(p < 0.05), 33 (25-42) % 72 h后RSV感染与控制13 (11 - 14)%。尽管纤毛节拍的变化模式,鼻纤毛上皮细胞的CBF文化是影响RSV感染超过72 - h研究期间。中位数(四分位范围)CBF RSV-infected鼻纤毛细胞72 h后是一样的(10.8(10.5 - -11.7)赫兹)的感染控制(10.3(10.1 - -12.7)赫兹)(p = 0.87)。纤毛细胞的数量与能动的纤毛,通过光学显微镜观察,也影响了RSV感染。中位数(四分位范围)运动性指数鼻纤毛上皮细胞相似72 h post-RSV感染(22(29)%)比未感染的控制(20 (18-28)%)(p = 0.88)。gydF4y2Ba
RSV抗原是缺席纤毛基因丝在早期人类纤毛上皮细胞的感染gydF4y2Ba
调查的传播病毒抗原在纤毛上皮细胞细胞被固定的20 - 72 h感染后,沾染了抗体特定纤毛(乙酰化微管蛋白)和RSV蛋白(G和F),存在于感染细胞的表面。Nonciliated细胞,包括俱乐部(克拉拉细胞)细胞和杯状细胞,保持清白的。发现大部分的细胞显示为RSV抗原阳性染色也积极为纤毛染色,显示优惠纤毛细胞的感染(观察,而不是量化)。重建共焦z-sections RSV-infected细胞显示,感染的进展,本地化的模式RSV抗原在细胞表面的纤毛细胞改变。没有观察到病毒抗原在控制井(gydF4y2Ba无花果1模拟gydF4y2Ba和m-o)。在20 h感染后,RSV抗原(G和F)的顶表面上观察纤毛细胞,但没有出现在纤毛抗原基因丝(gydF4y2Ba图1情况gydF4y2Ba)。24 - 72 h感染后,越来越多的观察RSV抗原顶端表面细胞的纤毛轴丝,这证实了co-localisation RSV抗原和乙酰化微管蛋白抗原(gydF4y2Ba图1我gydF4y2Ba)。这些照片证实了这些发现的光学部分。在20 h感染后(gydF4y2Ba图1 p-rgydF4y2Ba)没有出现在纤毛抗原基因丝而在72 h, RSV和微管蛋白抗原co-localisation扩展完整的纤毛基因丝的长度(gydF4y2Ba图1苏堤gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
超微结构损伤后RSV感染局限于纤毛细胞gydF4y2Ba
在最近的一项研究中,利用TEM显示纤毛损失严重哮喘患者的特征(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。RSV感染是否也导致纤毛损失,获得了三个额外的样品和TEM进行培养的纤毛上皮,感染RSV感染(或模拟)h。72中位数(四分位距)每个样本研究的上皮细胞数量是339 (303 - 360)。结果总结在gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba和示例电子显微图所示gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba。纤毛上皮的超微结构异常是跟踪RSV感染更多的纤毛细胞(60(48 - 70)%)表现出的纤毛与控制(40 (36-44)%)(p < 0.001)。也有显著增加(p < 0.01)与线粒体损伤纤毛细胞的百分比。这从24(年龄在18岁至25岁之间)%增加控制井40 RSV-infected井(28-45)%。没有显著增加(p = 0.36)的百分比nonciliated RSV感染后观察细胞线粒体损伤。纤毛上皮细胞的比例保持不变后RSV感染。gydF4y2Ba
人工基底细胞培养显示RSV-infected细胞的比例高于72 h后纤毛文化gydF4y2Ba
主要基底上皮细胞基底可以抵抗感染后接种或创伤pseudo-stratified纤毛细胞培养(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。然而,WgydF4y2Ba正确的gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]表明,RSV增长显著较低的滴定度纤毛腺文化比HEp-2细胞系。然而,相比他们的研究的主要细胞细胞系盛行不衰,和他们两个增长状态可能会困惑的解释数据。进一步研究这个问题,主要人类文化基底细胞被感染相同的RSV感染剂量用于初级纤毛的文化。72 h后感染,RSV-infected细胞的数量和炎性介质水平生产评估。低放大率扫描细胞感染的72 h表示,有更多RSV-positive细胞基底细胞培养相比,无纤毛细胞培养72 h后(gydF4y2Ba无花果3 a和bgydF4y2Ba)。病毒滴定这些发现(确诊的细胞培养上清液gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba),显著(p = 0.02)更高的感染RSV滴定度检测的细胞培养上清液从基底细胞培养中恢复过来(平均1.5×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba空斑形成单位·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)比来自纤毛文化(1.7×10gydF4y2Ba2gydF4y2Ba空斑形成单位·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
高分辨率共焦图像被感染的人类基底上皮细胞显示,病毒抗原是显示为块状或纤维(VFs)的顶端表面感染基底细胞24 - 72 h感染后(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba)。VFs相似的结构被表面的扫描电镜和免疫荧光RSV-infected组织培养细胞(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
基底细胞文化感染RSV增加分泌炎症介质与Th2反应有关,与单核细胞化学引诱物gydF4y2Ba
的光谱Th1和Th2-associated给出RSV感染细胞产生的细胞因子gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba。10测量中,一个Th1细胞因子(肿瘤坏死因子(TNF) -α)和四个Th2细胞因子(白介素(IL) 5、IL - 6、IL - 10和IL-13)明显增加(p < 0.05)水平由RSV感染人类的文化基底细胞与未感染控制。TNF-α和il - 6显示最高增加RSV感染后,用大于3倍变化与控制。TNF-α水平的中位数(四分位范围)浓度增加29 (26-60)pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba到178年(70 - 310)pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba和il - 6从73增加(38 - 126)pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba到226年(141 - 712)pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。RSV-infected基底细胞也产生了显著(p < 0.05)高水平的趋化因子(碳碳主题)配体(CCL) 26日CCL2, CCL13和C-X-C主题趋化因子(CXCL) 8与健康对照组相比(gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)。特别是,单核细胞的浓度化学引诱物CCL2和CCL13高RSV感染后基底细胞培养。CCL13水平增加了八倍,平均中位数(四分位范围)的11个pg·毫升(-)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba111 (28 - 163)pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
纤毛上皮细胞感染RSV有显著提高的一个Th1细胞因子(il - 12水平gydF4y2Bap70gydF4y2Ba)和两个Th2细胞因子(IL-5和il - 6) (gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。il - 6显示最大的改变增加了超过两倍从424年(294 - 536)pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba到828年(650 - 1341)pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,这是类似于RSV感染基底细胞的文化。与RSV-infected基底细胞培养,只有一个单核细胞化学引诱物蛋白质(CCL13)增加RSV感染后纤毛的文化。有一个大比例的科学家趋化因子(CXCL8和CXCL10),诱导的中性粒细胞迁移从RSV-infected纤毛的文化。CXCL10增加的中位数(四分位范围)698 (433 - 974)pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba到4140年(823 - 19884)pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在这个模型中。有趣的是,的浓度产生的干扰素(IFN) -γ和il - 4 RSV-infected基底和纤毛细胞培养高呈正相关(RgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 0.993)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
第一次,我们已确定增加纤毛运动障碍早期人类纤毛上皮细胞的RSV感染的特性。使用高速videomicroscopy,我们已经表明,RSV感染增加的纤毛异常模式早在感染后24 h。RSV-infected上皮的电子显微图显示了从72 h感染后纤毛细胞纤毛脱落,这是符合我们之前的观察气道上皮细胞从儿科急性病毒性毛细支气管炎患儿(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。增加的纤毛运动障碍和纤毛的结合可能会大大降低黏膜纤毛的清除。gydF4y2Ba
我们的研究也证实了先前的建议,纤毛细胞RSV感染的目标(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。我们的研究从RSV-infected收集证据使用电子和共焦显微镜和未受感染的纤毛上皮。电子显微图RSV-infected上皮线粒体损伤透露,是特定于纤毛细胞。使用免疫荧光共焦显微镜,我们观察到co-localisation RSV和纤毛抗原指示病毒繁殖的偏爱纤毛,而不是nonciliated,上皮细胞。我们发现在早期感染,高水平的RSV抗原上堆积的顶端细胞表面纤毛细胞和纤毛的初始节约基因丝(gydF4y2Ba图1情况gydF4y2Ba)。24小时后感染,病毒抗原被出席职位更高的纤毛轴和接近纤毛提示(gydF4y2Ba图1我gydF4y2Ba)。这个初始缺乏纤毛的RSV抗原从远端地区可能被解释的存在选择性屏障底部的纤毛,这已被证明门蛋白质进入基因丝在ciliogenesis [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。因此,病毒抗原运输纤毛提示可能依赖于这个屏障的破坏。gydF4y2Ba
有趣的是,我们发现RSV感染减少CBF和能动的纤毛细胞的数量减少光学显微镜下观察。这些发现与其他的研究相一致,使用光学显微镜检测细胞病理学的主要方法(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。据我们所知,只有一项研究中,观察到的总细胞病变效应RSV感染人类纤毛细胞培养(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。研究报告显著减少CBF接触RSV之后,几乎立即完全ciliostasis早在感染后6 h (gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。在我们的经验中迅速出现ciliostasis经常归因于毒素的存在或承运人的nonphysiological性质液体;解决方案与低pH值会导致快速ciliostasis [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。另一项研究报道,增加未洗的ultraviolet-irradiated RSV增加毒性的海拉细胞,表明他们的病毒制备可能包含有毒污染物(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。然而,有可能是其他因素比病毒的存在导致了快速ciliostasis研究TgydF4y2BaristramgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
感染模型代表了人类呼吸道上皮分化和异构独立于系统的信号分子和免疫细胞。我们的数据表明,在RSV感染的早期阶段,炎症细胞在气道与RSV感染的病人并不负责病毒诱导细胞病理学。gydF4y2Ba
第二个方面的研究旨在探讨RSV感染主要基底细胞的影响。我们观察到感染基底细胞培养使用高分辨率共焦成像和发现他们显示病毒抗原在顶端表面团或细丝。研究表明使用光和电子显微镜以前丝状预测RSV-infected细胞表面的(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),这些被认为是主要负责病毒的传播到邻近细胞(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。我们也观察到,基底细胞培养生产更大比例的RSV-infected细胞(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba72 h后),我们发现病毒滴定度更高的顶端上层清液与纤毛阿里的文化。此外,RSV感染的病毒传播的模式不同纤毛文化仍然焦纤毛区,而几乎所有细胞基底细胞单层感染。这很有趣,因为先前的报道表明,基底细胞不RSV的目标gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),与其他报告RSV复制高滴定度在上皮细胞系(HEp-2) [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在我们的研究中,我们与RSV感染的主要基础和纤毛的文化,在某些情况下使用细胞来自同一个人(n = 2)。这个新方法允许病毒复制的能力在这两个系统比以前更准确地评估。这些数据表明RSV很容易感染和复制在基底细胞和表明,基底细胞存在于pseudo-stratified文化也许不太宽容RSV感染比单层培养。原因可能是由于在两极分化细胞培养受体的位置,这可能会限制病毒进入顶端表面之前已经建议(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。或者,可能会有不同的成长阶段,基底细胞单层与那些已经达到终端分化。ZgydF4y2Ba挂gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)显示,细胞分化成纤毛表型他们变得更容易感染RSV病毒感染细胞的比例较高。然而,在研究ZgydF4y2Ba挂gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba后15天),阿里文化,增加达到高原,没有进一步增加在病毒复制报告gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。这可能是由于细胞进入一个不同的发展阶段。WgydF4y2BaugydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)最近报道,主要基底上皮细胞增加RSV生产如果逮捕在第一阶段的差距(G1)细胞周期,细胞中蛋白质翻译是最大的。据我们所知,没有研究报道基底细胞终末分化细胞的增长阶段的文化,我们的数据表明,这是值得研究的。gydF4y2Ba
不同的另一种解释病毒感染产生的滴定度基底和纤毛细胞培养是分泌因素的存在,可以保护RSV的纤毛上皮。众所周知,纤毛上皮分泌大量的抗病毒和抗菌药物,包括defensins和抗菌肽。在我们的研究中,抗病毒细胞因子的水平interferon-γ高出三倍的纤毛细胞与基底细胞系统,这可能会降低病毒产量通过激活宿主转录因子(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。然而,有局限性直接比较这两个文化系统。例如,每口井的细胞的数量较低的基底细胞单层与pseudo-stratified纤毛文化相比,阿里中包含所需生长因子ciliogenesis缺席在基底细胞培养基中,分泌和基底细胞文化淹没,所以在媒体增长因素直接稀释。减少这些限制,我们看着每一个模型产生的炎症介质的模式,而不是直接比较每个中介的浓度。我们发现基底细胞文化感染RSV产生抗炎细胞因子的水平明显高于与Th2反应(il - 10和IL-13)和il - 6与未感染细胞的控制。eotaxin-3水平上升,这是一个嗜酸性粒细胞化学引诱物和Th2细胞化学引诱物也符合Th2细胞基底细胞反应的选择性偏差,IL-5 RSV感染后显著增加,可能支持淋巴细胞和嗜酸性粒细胞增殖。有趣的是,单核细胞化学引诱物蛋白(MCP)与RSV 1和MCP4也增加。相比之下,纤毛细胞培养对RSV的反应并不明显偏向Th1——或者Th2-associated回应,而是产生一个强烈的信号的招募中性粒细胞(反映在高水平的CXCL8)。这是中性粒细胞与观测一致的主要细胞类型从支气管肺泡灌洗与RSV婴儿毛细支气管炎(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。此外,中性粒细胞被认为增加RSV-induced上皮损伤(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),这些细胞并没有在我们的系统可以解释缺乏细胞病理学观察。纤毛细胞培养也显示生产IFN-γ-induced蛋白升高CXCL10 RSV感染后,与先前的研究一致的(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。有趣的是,我们并没有发现显著增加IFN-γRSV感染后的水平。这是符合最近的一项研究表明III型干扰素是主要的干扰素生产RSV-infected鼻上皮细胞(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
限制我们的研究是我们只评估了来自阿里文化的顶端细胞因子的分泌。研究表明,细胞因子的分泌RSV感染后主要在基底外侧方向,基底、显著提高水平的il - 6 (gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba],CXCL8 [gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba],CXCL10 [gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)和咆哮(激活规范,正常t细胞表达和分泌)(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba已报告。也有报道IL-1α顶端分泌的增加(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba],CXCL8 [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba],CXCL10 [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba],CCL2 [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba和咆哮gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]RSV感染后分化主要人类呼吸道上皮细胞培养在阿里。这些研究测量了在不同的跨度为细胞因子的生产,从24 h - 72 h post-RSV感染。我们的结果覆盖更广泛范围的细胞因子和趋化因子,因此,给出一个更详细的视图在72 h post-RSV气道感染的环境比之前报道。额外的炎症介质已被证明有一个重要的角色在RSV的发病机制bronchiolotis [gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),该模型将允许进行进一步的调查。gydF4y2Ba
总之,本研究显示上皮纤毛细胞损害文化感染RSV是轻微和限制主要纤毛细胞。我们已经表明,这些细胞招募中性粒细胞产生一个强烈的信号,这是符合临床图片出现在儿童RSV细支气管炎。我们确认RSV感染的偏爱纤毛上皮细胞纤毛的可见病毒表面抗原基因丝。我们还表明,RSV感染呼吸道上皮细胞纤毛导致纤毛运动障碍发生在其他明显的细胞病理学,尽管纤毛仍保持正常的纤毛拍频。纤毛运动障碍结合纤毛损失增加,上皮损伤可能会导致降低黏膜纤毛的清除在感染过程的早期。这些发现强调纤毛细胞的作用建立RSV感染和重要的差异,可能看到的,根据感染的模型。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
利益冲突:没有宣布。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2012年12月20日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2013年2月14日。gydF4y2Ba
- ©2014人队gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba
- ↵gydF4y2Ba