呼吸道合胞病毒和人类支气管上皮

背景呼吸道合胞病毒（RSV）感染合适的模型还有待开发。

目的为了描述与计算机显微镜接口，其允许评估和活RSV感染呼吸道上皮的成像联原代细胞培养人呼吸道上皮细胞的体外模型。

设计一个描述性的对照研究。由弹性蛋白酶解离从手术样品获得，并重新铺板在胶原凝胶膜的人支气管细胞。经过7〜10天，细胞被带到空中接口。对细胞因子产生细胞的流体的基线采样通过酶联免疫吸附试验（白介素[IL]1β，IL-6，IL-8，和RANTES）和白三烯C4通过放射免疫治疗前被带到与RSV（N = 30）或的HEp-2（人喉癌细胞）对照组（n = 25）。采样在4，24，72完成，并且之后120小时。感染过程用显微镜（Zeiss UEM，卡尔蔡司公司，索恩伍德，NY）配备有照相机（Newvicon，达格公司，康涅狄格州斯坦福德）监控。使用计算机图像进行任一数字化（在Macintosh的Quadra 950中，苹果电脑公司，加州Cupertino）配备有一个数字化板（Perceptics公司，田纳西州诺克斯维尔）或记录在使用盒式磁带录像机（JVC，Elmwood Park的一个SVHS录像带，NJ）。

结果呼吸道合胞病毒引起的纤毛细胞产生深远的影响：纤毛停滞，结块，并从活细胞纤毛的损失和细胞的脱落。在IL-6，IL-8的释放显著差异，以及RANTES（P<0.03对于每种细胞因子）在RSV感染的支气管培养物指出了24小时，在72小时时的峰。所述IL-β和白三烯C4不是由RSV感染的细胞支气管改变。

结论这种模式密切反映人的RSV疾病并且提供一个独特的机会来研究来自不同供体的细胞interepithelial细胞间的相互作用，细胞因子的反应，并进行RSV感染活细胞的纤毛活动。

呼吸道合胞病毒（RSV）是最重要的呼吸道病毒在世界上的病原体。年度RSV流行病发生在所有地理和气候区。几乎每个孩子都会被2岁染上至少1 RSV感染。^1，2免疫是在第一或第二感染后不完整的，和重复感染是常见的。^1，2死亡率高达5％的已报告婴幼儿心脏或肺部疾病潜在的，并且能够超越严重免疫儿童和成人的90％。^2-4

尽管从动物和细胞培养研究得出了丰富的信息，既不RSV感染的治疗，也没有疫苗的研发取得了成功。^五，6感染人类细胞系的研究是代表发生在免疫功能正常的感染主机复杂的相互作用知之甚少。器官培养可能提供细胞培养研究和自然或实验的人类疾病之间的联系。然而，动物来源为呼吸组织的有用性受到限制，因为RSV感染的动物模型并不完全代表人类RSV感染，特别是毛细支气管炎。^1，2总之，动物研究^7，8建议对人类RSV复制目标可能在物种间的差异。因此，也有可能是宿主免疫反应取决于RSV损坏的图案改变。因此，人类起源的细胞是最佳的研究病理表现与人类RSV感染的发病机制。

我们已经开发了从手术样本来源的人呼吸道上皮细胞的体外模型。⁹它由解离和再生长的假呼吸包含所有存在于正常呼吸道上皮，包括产粘液细胞，纤毛和无纤毛上皮细胞和基底细胞的细胞类型的上皮。最初，细胞失去差异化特性，但他们重建随着时间的推移。虽然正常人支气管细胞可商购（Clonetics产品，圣地亚哥，加利福尼亚州），没有人细胞系可以可靠地产生活性纤毛或粘液分泌细胞。

为了验证我们的模型，我们需要履行既定RSV感染的几个标准。我们比较了病理特征和细胞因子释放的在我们的RSV感染的培养与那些从以前的人类研究的模式。^8，10我们主要集中在细胞因子白介素（IL）1β，IL-6，IL-8和RANTES因为这些是在呼吸道分泌物中发现从RSV疾病的儿童和RSV感染的单细胞系释放。^11-14因此，这些细胞因子被假定来自RSV感染的上皮始发，至少部分，而不是从RSV感染期间激活其他宿主细胞。的IL-8和RANTES特别有牵连的RSV疾病的通过招募和宿主细胞的活化的上皮表面上的发病机制。^13，15我们报告我们的RSV感染的呼吸道上皮文化形态条件和细胞因子释放的格局。

异物和病理剂粘液纤毛清除功能是在气管支气管树的防御很重要。^16-18许多毒素，药物和感染性物质会影响纤毛活动体外，但对于人RSV睫状肌功能障碍的贡献的信息很少。RSV感染的胎儿气管环纤毛证明细胞损失和减少纤毛活动，但结果不定量。⁸在小腿模型，牛RSV引起的纤毛上皮的脱落并在24小时的感染内细支气管肺泡灌洗液增大的自由纤毛的浓度。¹⁷在人类RSV感染，纤毛活动和纤毛细胞的丢失可能防止脱落的细胞及分泌的气道清除，导致痰液与婴儿期的毛细支气管炎时看到结果喘息堵塞。^1，2，10这里的研究包括RSV感染对纤毛形态学特征和活动的效果。

人体组织标本通过曼哈顿眼，耳，鼻，咽喉获得医院，纽约，由人机构审查委员会批准的协议下，我们的（W.H.）之一。这些标本包括从成年人进行外科手术收获健康的支气管组织。该组织无菌取出，在无菌条件下的最小必需培养基（Gibco，格兰德岛，NY）彻底冲洗，并在4℃运到我们的实验室24小时采购的范围内。

将组织用生理盐水溶液漂洗，以除去碎屑和呼吸道上皮被通过用猪胰弹性蛋白酶（30U /毫升），胰蛋白酶（50微克/ mL）的解离和脱氧核糖核酸酶I（5微克/毫升）的溶液A（140摩尔/升的氯化钠，5摩尔/升的氯化钾，2.5摩尔/升的磷酸钠，10摩尔/ L HEPES [美国生物化学品公司，克利夫兰，俄亥俄州]，氯化钙2摩尔/升的，和1.3摩尔/ L的氯化镁，pH7.4）中在37℃水浴中20分钟。酶消化，用30％胎牛血清停止溶液A.松开的上皮细胞从通过用无菌镊子温和的机械清创下面的基质中去除到含有5毫升的Dulbecco的陪替氏培养皿的最小必需培养基/火腿F-12（Gibco公司）与添加剂（表皮生长因子，25ng / ml的胰岛素，5μg/ mL的氢化可的松，1皮摩尔/ L;转铁蛋白，5μg/ mL的;霍乱毒素，40毫微克/毫升;和牛垂体提取物，15微克/毫升）先前所描述的。⁹将细胞悬浮液在1670转（IEC模型CL临床离心机，国际装备，尼德姆，马萨诸塞）离心10分钟，然后将上清液倾析。细胞用血细胞计数器计数，并使用台盼蓝排除测定存活力。

呼吸道上皮细胞以每平方厘米200000个细胞的接种密度在Dulbecco培养到制备Ⅰ型胶原菜（Cellagen或Transwell小Costar）中的最小必需培养基/火腿F-12以1个微摩尔异丙肾上腺素的（ICN实验室，极光，俄亥俄）。每个个体的组织至少6个单独的孔提供足够的细胞。

72小时内文化的呼吸道上皮失去了它的许多差异表型特征，如跳动的纤毛。培养液每2天更换上皮表面保持淹没。7天后，将细胞被带到空中接口（即，从用1mL的媒体底部加入）;没有媒体放置在上皮表面的顶部上。该方法已成功为一致形成新的纤毛内到达空中接口的几天。⁹在这点上我们的培养物紧密配合在与空气和附连到支撑结构基底表面接触的顶面接近人类呼吸道上皮，在这种情况下的胶原蛋白。使用配备有相位对比光学倒置显微镜的细胞培养物进行监测。一旦再次出现纤毛，被用于实验的细胞。

RSV的长应变的实验室储备液接种到永生化人呼吸道细胞（HEP-2），并且当合胞体形成明显突出（48-72小时）收获细胞。细胞冻融最大化病毒的收益率，而病毒通过离心在蔗糖梯度纯化。¹⁹未感染的组织培养物在相同的方式对其进行处理，并通过离心进行纯化，以产生足够的对照抗原，的HEp-2裂解物。用于所有纯化病毒实验的45％的密度带。等份在-70℃冷冻直到使用，使每一组计划实验的有相当于病毒和可用的控制。对于所有描述的实验中，将含有5×10单批纯化RSV的⁶用噬菌斑形成每毫升单位。

当细胞准备用于实验中，纯化RSV或的HEp-2裂解物加入100μL加入到培养物中的表面上。病毒（或的HEp-2裂解物）吸附2小时，然后取出，使培养物的表面保持在空中接口。将该接种含有5×10^五噬斑形成单位计算为产生的1的感染复数，假设在培养的所有单元以及将由RSV被靶向。

细胞培养物的上皮表面的轻柔洗涤物在接种后24小时，48小时和72小时，用1mL的磷酸缓冲盐溶液进行。然后将这些样品接种到MRC-5细胞（BioWittaker，Walkersville的，MD），并通过标准方法病毒学处理。呼吸道合胞病毒是通过使用荧光染色的有特异的单克隆抗体RSV在感染组织培养证实，如前所述。²⁰没有RSV从控制培养物中回收。

含有细胞胶原插入物取出并安装在一个恒温室用于放置盖玻片。细胞培养基（达尔伯克氏最小必需培养基/火腿F-12），用经缓冲以氨基酸而非碳酸氢盐以减少光学干涉Lebovitz L-15（L-15，Gibco）的培养基替换。呼吸道合胞病毒和HEP-2裂解物控制在L-15除了组织培养之前进行稀释。后2小时的吸附周期后，病毒或对照培养基完全用新的L-15代替。视频图像记录在整个感染周期与使用摄像头（Newvicon，达哥公司，康涅狄格州斯坦福市）。的感染过程中观察到的形态改变图像使用一个计算机数字化（在Macintosh的Quadra 950中，苹果电脑公司，加州Cupertino）配备有数字化板（Perceptics公司，田纳西州诺克斯维尔）。纤毛摆动频率（CBF）的记录，采用盒式磁带录像机（JVC，埃尔姆伍德帕克，NJ）SVHS录像带。

被寻找的单层纤毛细胞和它们的节拍频率测量如先前所描述²¹使用显微镜（Zeiss通用，卡尔蔡司公司，索恩伍德，NY）配有诺马尔斯基微分干涉对比光学器件。简要地说，一个频闪光源被连接到与该视频记录器和计算机接口的显微镜，以允许CBF的同时测量，同时连续实时纤毛活动被摄制。跳动纤毛被定位成使得它们心血搏是垂直于光源。闪光灯光的频率是变化的，直到CBF匹配，所述选通的和纤毛出现冻结其运动。当节拍频率低于4赫兹，使用秒表。CBF的测量在基线时的2小时的病毒吸附期间加入病毒或对照培养基之前采取在所有治疗组，并在15分钟的间隔。在每个时间点至少20个测量采取纤毛的整个单层。装置和SDS计算各测量。

的RSV感染过程中产生细胞因子/趋化因子谱评价是通过酶联免疫吸附测定方法来完成。酶联免疫吸附测定试剂盒商购（试剂盒，IL-1β，IL-6从Genzyme公司，剑桥，马萨诸塞州，和试剂盒对IL-8，来自R＆d系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州RANTES）。在实验的开始，除去所有的媒体，以表示用于该井的基线样品并用等体积的培养基的替换。样品然后取在2，4，8，RSV或控制接种后24,72和120小时。所有样品一式两份进行，以尽量减少移液误差，并且对每个样品的吸光度之前浓度的计算进行平均。

白三烯C4是在细胞上清液在基线加入RSV或的HEp-2控制的通过放射免疫测定（NEN，杜邦，特拉华州威尔明顿）后测量和在2和4小时。从0.25测定测量LTC4纳克至16毫微克/毫升。基本上没有与除LTC4的初级代谢产物白三烯等的交叉反应性，白三烯D4（11％）。

数据的所有的统计比较采用一个STATVIEW 4.5（算盘概念公司，加利福尼亚州伯克利）包能够计算参数和非参数测试的Macintosh计算机制成。用方差分析来比较细胞因子在一段时间治疗组之间的中CBFs产生和变化，与被认为有统计学意义P<0.05。

在10呼吸道合胞病毒治疗^-5噬斑形成单位（感染复数，1）导致细胞形态学特征的迅速变化。最早的视力改变病毒吸附期间发生。纤毛活动和RSV感染文化发展的形状异常，但没有与喉癌Hep-2裂解物或L-15仅培养基处理的对照培养。不同细胞膜开始模糊，以及形成在所述细胞表面上的泡被释放到介质（图1）。RSV感染后24小时内，多核细胞（合胞体）的形成是明确的，与相邻的细胞膜融合。额外的改变包括梭形或大于单元的一半舍入细胞和更剥离。与的HEp-2裂解物接种的对照细胞中观察到这些变化中没有一个。

纤毛活动在RSV处理的细胞放缓，加病毒后早30分钟，许多纤毛成为俱乐部的形状。通过接种后2小时，RSV处理的细胞没有动纤毛。通过感染后24小时，RSV感染的组织表现出纤毛损失一些细胞，只留下后面的基体层。其他细胞具有纤毛，但他们成为融合。还有其他细胞具有形态正常的纤毛。然而，没有任何纤毛的是能动的。最后，按照RSV感染3〜5天，有纤毛的完全丧失。正常形态的损失特点使剩余的细胞类型困难的分化，但显然是与目前纤毛没有细胞。

细胞因子IL-1β的定量，IL-6，IL-8，和RANTES（平均值±社会企业以每毫升皮克）由受感染的和控制支气管上皮释放被描绘图2。细胞因子的数据从从8个个人提供至少4口RSV治疗井和每个个体3个对照孔的培养细胞编译。

白细胞介素1b中以低但恒定的速率（5-10微克/毫升）通过感染和HEP-2控制支气管细胞培养物（释放图2）。有2组间差异无统计学差异显著（P= 0.60）。

平均IL-6释放在人支气管细胞培养物中对治疗的反应与RSV或的HEp-2裂解物中被描绘图2。的IL-6释放从259皮克/毫升RSV在治疗之前的平均基线升高至最高1400皮克/毫升的在72小时。IL-6的释放是在24小时统计学显著（P= 0.04），并在72小时（P= 0.02用自己的基准生产比较RSV感染细胞时）。通过重复测量方差分析，RSV处理的细胞释放更多的IL-6比对照细胞（P= 0.03）。所述的HEp-2的对照孔有IL-6（325皮克/毫升）的略高平均基线释放但这不是统计学差异与从之前RSV治疗RSV处理的孔的IL-6的释放相比。在4小时时和HEP-2裂解物处理后24小时，IL-6释放增加，但不显著（P= 0.11）。通过72小时后，IL-6的释放基本上是在对照孔中的基线值。

平均IL-8浓度RSV处理的和的HEp-2裂解物处理的细胞中被示出图2。平均基线IL-8生产的高，近30000皮克/毫升两组。呼吸道合胞病毒和HEP-2裂解物处理引起的IL-8释放在4小时时轻微但不显著平均增加其在24小时回到基线。通过72小时IL-8的平均浓度为近2倍与的HEp-2裂解物处理过的细胞相比，在RSV处理的细胞高（P= 0.03，相对于对照细胞，并P= 0.025 VS RSV基线释放）。然而，由谁贡献细胞的所有个人数据相结合，一些有趣的差异，因为IL-8，以RSV感染测试的细胞因子有如释重负之最变化图案丢失。一个个体产生实验前IL-8 10倍大于其他7人。尽管这样高的水平基线IL-8产生的，这些细胞仍释放显著更大IL-8响应于10^五在72小时时噬斑形成纯化RSV的单位（P= 0.01）。另一个个体没有响应于RSV感染释放尽可能多的IL-8，但释放是较早，在第一个24小时后，迅速降低（P= 0.004）。从剩余的5个个体的细胞有中度基线IL-8水平与响应于RSV感染高于基线产量增加的释放。

RSV或的HEp-2裂解物治疗期间RANTES释放中被示出图2。呼吸道合胞病毒 - 处理的细胞释放的显著RANTES早RSV感染培养的人支气管细胞后4小时（P= 0.01）。在24小时，RANTES的平均释放仍显著不同从基线和从对照细胞（P= 0.03）。平均峰值780 RANTES皮克释放/ mL的第3天在仅RSV感染的细胞达到（P= 0.03;图3）。当暴露于的HEp-2裂解物对照细胞没有在24小时时释放RANTES超过112皮克/毫升，并在24小时后回落到0。

LTC4的量在细胞上清液在基线测量，在加入RSV的后2和4小时，或在用放射免疫法的Hep-2控制。我们无法在这些早期的时间点来检测LTC4无论是在RSV感染或控制文化纤毛停滞时发生的RSV感染的细胞。

之前在2小时的病毒吸附期间加入RSV或对照培养基和每15分钟的（纤毛运动频率监测图3）。在加入活RSV 30分钟，CBF变化指出。60分钟后，用discoordinated活性在仅RSV治疗组注意到下降拍频。所有的纤毛停止2小时RSV治疗组跳动。用的HEp-2裂解物或L-15的对照培养物单独继续拍整个观察期间的正常频率范围内。

最意想不到的发现是CBF的临时恢复到正常水平时新鲜的L-15在2小时内用于病毒吸附的结束时加入到RSV感染的细胞。新鲜培养基到的HEp-2裂解物或L-15介质对照培养物的添加剂对CBF没有影响。评价RSV感染的培养物在24小时后接种揭示了CBF的测量没有活动纤毛，而在所有未感染细胞培养纤毛进行的正常跳动。

据我们所知，这是在文献中描述的RSV感染的类型的第一款车型。我们使用人体呼吸起源的混合细胞培养，从过去的人类呼吸组织外植体不同，在几个重要方面。他们不是孤立的，从呼吸道，因此从呼吸道黏膜的正常环境中取出刷细胞。这样的细胞具有有限的活力和不能够再生或长期实验。在我们的模型中，呼吸道组织被解离为单细胞清除所有污染的结缔组织和不在原籍上皮组织的其他组成部分，⁹不同于旧的器官培养模型或呼吸道上皮外植体。^7，8，15我们的纤毛上皮文化的模型可以感染RSV和可证明人类RSV感染的细胞病变效应特征。¹⁰我们RSV感染的细胞产生类似于那些在自然RSV感染的细胞因子看到²²并在标准组织培养模式。^11-13这些结果证实了我们的假设，我们的RSV感染的镜子自然和人类实验RSV感染的模型。我们必须通过固定技术拍摄一段时间的感染过程和记录的病理特征，在纤毛功能特别变化发展，没有活细胞的破坏的独特机会。

气道上皮细胞的合成能力，对损伤或感染分泌炎症介质的肺宿主防御机制的主要发起人。在鼻咽分泌物中IL-1β水平升高，增加信使RNA转录特异于鼻活检组织IL-1β的儿童被发现患有急性上呼吸道病毒感染。²²我们也期望找到产生IL-1β在我们的RSV感染的细胞被改变。我们的支气管组织培养物产生的IL-1β的可测量的量，但响应于RSV感染没有增加。也许，这通常产生IL-1β细胞RSV感染期间被损坏，并且不能合成增加和IL-1β的释放。在鼻biospy组织中的IL-1β信使RNA转录可以反映早期上皮修复由于细胞外基质的调制和不象本身感染的结果。白细胞介素1β已牵涉于角质细胞生长因子中的成纤维细胞的上调，因此可能参与修复过程以及炎症。²³虽然我们的模型能够从焦点化学损伤自我修复，持续的病毒的损害可能会妨碍我们的小上皮文化的修复。另一种可能的解释可能在于与上皮细胞本身。虽然鼻上皮可响应于RSV感染（或维修）产生IL-1β，下呼吸道上皮可能没有。Fieldler等¹²发现无论是A549，BEAS 2B，也不H441细胞表现出响应于RSV感染IL-1β的释放增加;这与我们在支气管上皮文化的发现。

局部产生的细胞因子，包括IL-6和IL-8，具有与上呼吸道的病毒感染的儿童的鼻灌洗液被检测到。²²白细胞介素6也可以增加从B细胞抗体的合成和从T细胞增强细胞毒性淋巴细胞的分化。²⁴分别为白细胞介素8和RANTES具有多种功能，但最相关的RSV的研究是他们的趋化活动的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。^24，25由于细胞毒性淋巴细胞参与RSV消灭，²⁶通过感染上皮局部产生IL-6的可刺激之前从系统循环招募“次要”炎性细胞的到达粘膜淋巴细胞。A549细胞上调IL-8的产生和释放，响应于单独或与两者的外周血淋巴细胞和嗜中性粒细胞的共培养期间释放的可溶性因子结合RSV感染。^11-13RANTES是RSV感染标准组织培养的过程中也被上调¹³和在鼻上皮的原代培养物。¹⁵我们的RSV感染的细胞中产生的升高水平的IL-6，IL-8，并仅与复制病毒RANTES。有可测量的IL-8的受试者之间从同一供体细胞内的相当大的变化，但一致的结果。一个个体产生10倍的IL-8在基线与来自其他对象的基线生产相比;IL-8释放这些细胞仍响应于RSV感染显著增加。因此，通过改构的IL-8释放的响应的个体差异对RSV（和可能的其他因素也一样）可以解释度在人类的RSV疾病遇到严重程度。

纤毛活动是纤毛运输系统的关键手臂，但一直没有人RSV感染过程中充分探讨。亨德森和他的同事⁸观察改变纤毛的纤毛活动和损失他们的人胎气管环，但没有定量他们的发现。呼吸道合胞病毒产生纤毛停滞在我们的研究中感染周期的早期，前以及病毒复制发生。参与纤毛停滞机制知之甚少，但可通过改变离子病毒附着和复制，对睫状装置，或通过生产一种有毒物质，如LTC4的损伤直接损伤，由被感染的细胞或相邻小区中被介导。久松等¹⁸表明，LTC4在鼻上皮细胞以时间和剂量依赖的方式抑制纤毛活动。通过10诱导的CBF的变化^-6到10^-9LTC4的摩尔不是从基线活性显著不同，直到暴露后至少4小时;完整的纤毛停滞了更长的时间。纤毛停滞在我们的模型中迅速诱导，暗示，要么比10高浓度^-6LTC4的摩尔由被感染的细胞释放出来，或在离子浓度的改变都参与。我们无法在发生纤毛停滞时检测在我们的RSV感染的或对照培养任何LTC4，表明LTC4的水平，如果存在的话，比检测通过该测定的极限（<0.25毫微克/毫升）下。在RSV感染的细胞显然不是死的，但新鲜的媒体们能够暂时恢复纤毛活动。在RSV感染的井，所有的纤毛细胞参与。然而，纤毛停滞可能不会在体内很普遍，因为这是不可能的人会吸入或复制足够的RSV感染每一个靶细胞中的呼吸道。在体内，在纤毛运输局部中断可能会导致杂乱无章的粘液和细胞碎片的去除，从而促使空气滞留的临床特征和喘息看出期间毛细支气管炎婴儿期的。我们所要追求的纤毛停滞的这些猜测在未来的研究。

我们的分化模型，纤毛人呼吸道上皮提供在由细胞类型的体外模型的唯一存在于正常人呼吸道：基底，分泌，和纤毛。呼吸道合胞病毒感染在我们的模型紧密地与人类的疾病和提供了一个机会来研究interepithelial细胞的相互作用和活细胞的纤毛活动。我们可以评估细胞因子产生响应RSV感染来自不同供体的细胞，而不是从细胞系，从只有单一的供体细胞中获得。最后，我们的研究提供了积极评价RSV感染，包括纤毛功能障碍，这一点在临床细支气管炎的发病机制的一个重要特征过程中出现的功能和形态的变化具有明显的优势。

接受1998年出版4月14日。

这项工作是由来自妇女和布法罗，纽约州布法罗（崔斯特瑞姆博士）儿童医院的儿童健康研究基金会的资助。

在儿科研究学会，华盛顿特区，1997年5月7日提出的部分。

我们感谢莱昂大厅和伊扎特Assian，MS，为他们提供专家技术援助和Deborah Reszak她的秘书服务。

通讯作者：黛布拉崔斯特瑞姆，MD，传染病，儿童医院，219布莱恩特街，布法罗，纽约14222（电子邮件的分工：dtristra@acsu.buffalo.edu）。