文摘
氧化/抗氧化失衡与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制。
当前研究了抗氧化剂和氧化剂酶的表达,血红素氧合酶(HO)和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)分别在严重COPD患者肺功能和控制吸烟者没有障碍。免疫反应性,HO-1 HO-2,伊诺和氮oxide-derived氧化剂表示为硝基酪氨酸(N-Tyr)在肺外围量化。
HO-1 +肺泡巨噬细胞减少严重的慢性阻塞性肺病控制吸烟者相比,而没有区别在伊诺+巨噬细胞。相比之下,严重的患者显著高于间接宾语+肺泡壁细胞的数量。这些间接宾语+细胞被确定为2型pneumocytes及其数量HO-1 +巨噬细胞呈负相关。之间没有明显的差异N-Tyr疣状两组。然而,蛋白质硝化反应的速度lungtissue伊诺表达式直接相关,降低valuesofforced一秒钟用力呼气容积/用力肺活量。HO-2由2型pneumocytes持续表达,这些细胞被增加在严重的慢性阻塞性肺病。
总之,结果表明,酶参与氧化stressresponse可能有不同的角色失衡betweenhaemoxygenase-1和诱导的肺防御和一氧化氮合酶可能与发展有关的慢性阻塞性肺疾病患者的严重障碍。
支持的意大利大学和研究、帕多瓦大学的ARCA。
氧化/抗氧化失衡已经涉及thepathogenesis慢性阻塞性肺疾病(COPD)1。外源性氧化剂中包含吸烟,慢性阻塞性肺病的主要风险因素,产生病理ofCOPD炎症细胞的特征2。氧化应激引发级联信号机制,激活转录因子的基因导致upregulation编码促炎和抗炎细胞因子和酶1。本研究着重于两种酶,血红素氧合酶(HO)和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)。HO的三个亚型诱导HO-1,本构HO-2 HO-3,催化血红素的降解胆绿素,然后减少胆红素,产生自由铁和一氧化碳(CO)3- - - - - -4。何鸿燊一直建议具有重要的抗氧化能力和意义在保护与氧化剂接触肺细胞。HO-1被证明是由各种各样的有害刺激,包括活性氧(ROS)3。在早先的研究中,目前作者显示thatchronic吸烟者表现出增强的表达HO-1 inalveolar空间和HO-2肺的肺泡壁5。
一氧化氮(NO)合酶可能参与COPD的发病和进展,因为没有直接的毒性作用,还与过氧化物反应,生成有毒的过氧亚硝基的细胞6。一些研究发现iNOSwas更表现在间质性肺病7。这种酶的作用在COPD的发病和进展是有争议的8,9。此外,大多数研究在诱导痰检查伊诺及其产品,虽然相信外围航空公司的主要网站在慢性阻塞性肺病ofairflow限制。调查机制参与了COPD的恶化可能usefulin识别子组的受试者倾向torapid肺功能下降和靶向治疗干预。
当前的研究分析了酶的表达withantioxidant属性,HO-1和HO-2和氧化剂属性,进气阀打开,在外围的COPD患者肺和肺功能严重障碍与可比吸烟史学科相比,但没有肺功能的损害。的参与NO-derived氧化剂被免疫染色评估ofnitrotyrosine蛋白加合物。何鸿燊的免疫反应性,伊诺和硝基酪氨酸wasquantified肺泡巨噬细胞和肺泡壁,和结果与肺功能的索引。
方法
主题
两组受试者接受孤独的周围癌或肺切除的肺容积减少手术(LVRS)肺气肿是检查:11个科目的吸烟史> 20 pack-yrs和严重固定气道阻塞(严重的慢性阻塞性肺病)和13个对象的吸烟史> 20 pack-yrs和正常肺功能,即。一秒钟用力呼气容积(FEV1)/肺活量(VC)超过预期值- 1.64剩余sd(控制吸烟者)10。定义为一个FEV严重气道梗阻1/ VC低于预测的价值减去1.64剩余sd, FEV1< 50% pred11。9 11的组织样本的严重慢性阻塞性肺病组患者接受LVRS,而其余样品wereobtained手术的癌症。
所有科目增加FEV展出1吸入后200μg舒喘灵< 15%的基线值。受试者没有发作,已经无acuteupper呼吸道感染,没有接受糖皮质激素或抗生素在月前手术。他们为常见的过敏原提取物-皮肤测试,没有哮喘或过敏性鼻炎的历史。学习符合《赫尔辛基宣言》,并告知每个主题得到书面同意。
肺功能测试
术前肺功能测试是获得一个星期内,包括肺量测定法、动脉血气分析,有限扩散能力12。扩散能力不是以两个病人严重的慢性阻塞性肺病groupand五控制吸烟者。
免疫组织化学
组织块被从胸膜下薄壁组织,避免区域涉及到肿瘤,固定和嵌入在石蜡所描述的地方13。HO-1 immunohistochemisty使用鼠标和HO-2蛋白质进行检测单克隆抗体HO-1 (anti-HO-1;转导实验室,美国肯塔基州的列克星敦)和山羊多克隆抗体对HO-2 (C-20, sc - 7697;圣克鲁斯生物技术公司,SantaCruz, CA,美国),碱性phosphatase-anti-alkalinephosphatase (APAAP)方法(Dako有限公司、威、英国)或链霉亲和素生物素化的碱性磷酸酶复杂(StreptABComplex /美联社;分别Dako有限公司)。单克隆抗体对伊诺(sc7271;圣克鲁斯生物技术有限公司)是处理设想+ TM (K4000 Dako有限公司)方法和二氨基benzydine (DAB)染色。负控制非特异性结合孵化与二次抗体只处理和显示没有信号。3-Nitrotyrosine疣状(N-Tyr)执行使用兔多克隆抗体(抗3-Nitrotyrosine;美国纽约北部的生物技术,普莱西德湖),其次是过氧化物酶共轭猪抗体(P399; Dako Ltd) and DAB. Positive controls were processed incubating slides with 1 mM NaNO2和1毫米2O2在100毫米醋酸缓冲主要抗体。负控制wereprocessed孵化主要抗体与1毫米硝基酪氨酸之前使用。
疣状在支气管上皮细胞检查,肺血管,肺泡壁和肺泡巨噬细胞使用光学显微镜(蔡司、从、德国)40×以盲目的方式放大。HO-1 HO-2,伊诺和N-Tyr染色量化在肺泡巨噬细胞、肺泡壁incells所描述的其他地方5。简单地说,至少有20肺实质的大功率领域被随机选择的每个部分和至少100肺泡巨噬细胞内进行评估。肺泡壁内积极染色细胞的数量是计算使用光学显微镜(徕卡DMLB;徕卡,剑桥,英国),连接到一个录像机连接到计算机图像系统。
为了确定执行双重免疫染色的细胞染色积极HO-1, HO-2和进气阀打开。CD68(巨噬细胞)和表面活性剂蛋白(SP) - b(2型pneumocytes)阳性细胞进行了研究。幻灯片与抗体anti-CD68双染色(山羊多克隆sc - 7083,圣克鲁斯生物技术、海德堡德国ormouse单克隆M814 Dako有限公司)或anti-SP-B(兔多克隆抗体的礼物a . Baritussio帕多瓦大学、意大利)14和anti-HO-1 anti-HO-2或anti-iNOS5。执行双重染色,获得的控制幻灯片的一个主要的抗体没有补充道。
结果
表1⇑显示了学科研究的特点。两组受试者类似的关于年龄和吸烟史。严重的慢性阻塞性肺病ofarterial氧张力表现出较低的值(p < 0.001),公司扩散能力(p < 0.001)和扩散系数(p < 0.01)。根据全球计划为慢性阻塞性肺疾病(黄金)分类16集团的严重慢性阻塞性肺病sixpatients IIB阶段和五个病人在第三阶段。
肺泡巨噬细胞的数量严重的慢性阻塞性肺病(154中位数(四分位范围143 - 174))没有显著不同于控制吸烟者(157 (142 - 204))。大多数的细胞在肺泡空间算作肺泡巨噬细胞是CD68-positive (70.2% (55.4 - -83.8))。HO-1免疫染色观察细胞中主要的肺泡空间,而这是-在支气管上皮和血管(图。1⇓)。大多数HO-1-positive肺泡细胞空间CD68-positive (82.6% (72.4 - -88.9))。HO-1-positive肺泡巨噬细胞的百分比显著低于受试者患有严重慢性阻塞性肺病(26.0%(12.3 - -32.6))与控制吸烟者(44.1% (34.7 - -57.5);p < 0.01;表2⇓,图2⇓)。间接宾语+(图2的百分比⇓巨噬细胞)和N-Tyr +两组没有差异(表2)⇓)。
疣状HO-2在场的肺泡巨噬细胞、肺泡壁,在平滑肌细胞动脉外膜的肺动脉,和支气管壁的一些细胞。百分比的HO-2肺泡巨噬细胞组织化学染色在两组相似(慢性阻塞性肺病75.4% (54.2 - -88.1)与控制了67.9% (35.9 - -75.6))。ofHO-2-positive肺泡壁细胞数量显著增加(p < 0.01),细胞在严重的慢性阻塞性肺病(18.0毫米−1(12.7 - -22.8))相比,控制吸烟者·mm(11.3细胞−1(10.6 - -12.2))(表3⇓,图3⇓)。双免疫染色表明,HO-2-positive在肺泡壁细胞2型pneumocytes (92.3% (88.6 - -93.9))。相反,97%(93 - 98%)2型pneumocytes HO-2-positive。
伊诺染色存在于肺泡壁和肺泡巨噬细胞,平滑肌、肺动脉和支气管壁动脉外膜。iNOS-positive肺泡壁细胞的数量显著增加细胞在严重的慢性阻塞性肺病(13.9毫米−1(11.4 - -19.2))对控制细胞吸烟者(4.2毫米−1(2.3 - -5.9);p < 0.001;表3⇑,图3⇑)。由双免疫染色,大多数iNOS-positive细胞显示SP-B免疫反应性(85.7%(63.9 - -87.8)),表明2型pneumocytes他们。N-Tyr染色的程度严重的慢性阻塞性肺病肺泡壁往往大于控制吸烟者,但差异无统计学意义(p = 0.07,表3所示⇑)。考虑到两组在一起,有一个积极的,线性相关性免疫反应性伊诺和N-Tyr肺泡壁(ρ= 0.54,p < 0.05)。类似的关系观察伊诺+巨噬细胞和N-Tyr +巨噬细胞(ρ= 0.41,p = 0.06)。间接宾语+肺泡壁细胞呈负相关toHO-1-positive巨噬细胞(ρ=−0.44,p < 0.05)。
疣状与FEV在肺泡壁N-Tyr负相关1/用力肺活量(FVC)(ρ=−0.62,p = 0.05)控制吸烟者和组中表现出相同的趋势严重的慢性阻塞性肺病(ρ=−0.60,p = 0.07)。未发现重大关系之间HO-1疣状,HO-2,进气阀打开,肺功能参数或吸烟史的两组患者。
讨论
目前的研究发现,在严重的慢性阻塞性肺病areduced表达HO-1在肺泡巨噬细胞,而2型的数字表达iNOSand pneumocytes HO-2增加。肺组织中的蛋白质硝化速率与伊诺的表达直接相关,FEV的降低值1/ FVC比率。
氧化应激和宿主防御机制的失衡与COPD的发病机制1。氧化剂,吸入或由炎症细胞,引起肺部炎症反应通过信号机制。Redox-sensitive转录因子,如核factor-κB和激活蛋白1,已被证明托比激活在上皮细胞和炎症细胞在氧化应激,导致upregulation反和炎性基因,包括编码HO-1和进气阀打开1。的功能意义ofinduction HO-1伊诺不是很好理解,作为他们的活动可能导致保护或伤害取决于实验设置17,18。
过度生产的通过伊诺可导致肺组织负面影响通过与超氧化物阴离子和氧气反应,导致活性氮物种的发展19。通过其产品有限公司、铁和胆红素HO认为cytoprotection对抗氧化损伤作用3。两HO HO-1和HO-2微分角色和只能部分互相取代20.。在先前的研究中,目前的作者发现一个不同的本地化的两个亚型在健康受试者和吸烟者的肺,在巨噬细胞和HO-2 HO-1主肺实质,特别是2型pneumocytes5。类似HO-1分布和HO-2 insevere检测慢性阻塞性肺病患者,说明炎症过程的发展和改造不改变这些酶的本地化。
表达HO-1是最突出的结节病和间质性肺炎患者的肺泡巨噬细胞,而HO-1免疫反应性并不是检测或细支气管上皮很低,肺泡上皮和内皮21。这是在协议与HO-1本地化外围肺在当下研究的样本和对比发现HO-1-positive支气管上皮细胞在哮喘的大航空公司22。综上所述,这些观测结果表明,在支气管上皮细胞表达HO-1依赖的支气管树了。
当前作者先前表明,HO-1和HO-2表达增加吸烟者与不吸烟者相比,但没有健康的吸烟者和吸烟者之间的差异被发现轻微的慢性阻塞性肺病5。通过研究更严重的慢性阻塞性肺病患者,包括那些拥有高度ofparenchymal破坏,当前作者观察到减少HO-1表达式在肺泡巨噬细胞和2型pneumocytes HO-2 +数量的增加。最近,HO-1基因启动子多态性可能减少ROS HO-1的可诱导性23不同,从而导致对香烟烟雾的影响。当前的发现证实HO-1减少和慢性阻塞性肺病严重程度之间的关系。而吸烟者表现出HO-1水平较高,对于不吸烟者,从而表明积极防御机制对烟伤害,严重慢性阻塞性肺病患者可能有防御氧化应激障碍,尽管他们的吸烟史不不同于控制吸烟者。改变的表达HO也可能是疾病的一个后果。由于HO-2是组成酶表达的结果是由2型pneumocytes独家肺泡壁,其增长可能反映了肺的这些细胞数量的增加。事实上,吸烟引起的肺癌细胞增殖可能,尽管破坏过程中,肺泡壁增厚可能检测到严重的慢性阻塞性肺病24,25。本构的作用形式的HO在肺仍未确定。根据目前的作者的结果,HO-2可以防止过度蛋白质硝化伊诺青睐的产品。
这是第一个研究伊诺周围肺组织对慢性阻塞性肺病。伊诺的表达在人类肺癌之前已经记录在正常气道上皮,哮喘、间质性肺炎和肺肉芽肿性疾病7,26- - - - - -28。当前研究的结果对伊诺免疫反应性与先前的报道是一致的显示肺细胞酶的分布较广,包括上皮、血管和炎症细胞29日,30.。通过检查肺泡巨噬细胞,目前的研究证实了此前的发现相似的表达式伊诺的痰与COPD受试者的巨噬细胞和健康的话题8,9。然而,在肺的实质室,目前的研究发现高伊诺表达式2型pneumocytes严重的慢性阻塞性肺病。这上解决人类肺伊诺同意观察老鼠31日。大鼠2型pneumocytes表示伊诺和发布类似水平的肺泡巨噬细胞,巨噬细胞虽然通常被认为是主机的主要细胞中介辩护。当前的结果与假设一致的是,2型pneumocytes发挥作用作为第一道防线,与上皮细胞和巨噬细胞,肺损伤32,其功能可能是肺气肿肺组织被破坏的关键33。
多余的不,由进气阀打开,在超氧化物阴离子的存在促进硝化酪氨酸残基的蛋白质。酪氨酸硝化都严重依赖于经营者集中的和分子环境19. data伊诺产品的作用,不,是相当矛盾的文献中。高,低或类似水平的呼出没有被证明在COPD受试者相比,控制和或正面或负面的相关性与FEV呼出没有1已报告8,34,35。Nitrotyrosine-positive细胞更频繁的在慢性阻塞性肺病患者的痰液方面的健康控制8。目前作者能够证实后者发现肺泡壁,但不是在肺泡巨噬细胞在严重的慢性阻塞性肺病。此外,目前作者的数据表明,硝化反应的蛋白质在肺组织可能对肺功能有不利影响。两者之间的实质性差异的研究很难比较结果。事实上,严重性ofCOPD研究Ichinose温和et al。8研究了不同和呼吸道的隔间。此外,免疫组织化学技术是不适合foraccurate硝化蛋白质的定量评价。
肺的逆HO-1和间接宾语之间的关系可能会解释为监管两酶之间的相互作用。HO能够表达下调伊诺由血红素降解酶的一个组成部分,通过有限的抑制作用36。减少HO-1可能增加血红素合成和优化活动伊诺和增强氧化剂副产物的形成,也就是说,没有来自伊诺激活。相反,一个稳定的效果没有在HO-1信使核糖核酸离体的37,将上调HO-1。除了不,可能存在缺氧和肿瘤坏死factor-αinCOPD HO-1抗病诱导剂。然而,目前的结果表明,严重的患者无法应对这些刺激通过增加HO-1的表情。
潜在的偏见在这项研究中进行手术切除标本是所有控制吸烟者的肺cancerwhereas 11的严重慢性阻塞性肺病没有癌症本身的存在可能会影响研究结果。没有研究HO-1表达式和肺癌,虽然upregulation伊诺在原发性肺癌患者38。如果是这种情况,iniNOS表达的差异会更大的两个bettermatched组的患者。另一个潜在的偏见,在LVRS,外科医生选择最严重的肺的一部分,这可能夸大病理结果对疾病的功能分类。未发现明显差异的组织用于组织学分析(长度为肺泡壁和肺泡巨噬细胞的数量)和项免疫反应性两个严重的慢性阻塞性肺病患者肺癌异体和其余九LVRS。然而,需要为肺泡壁完整可靠的细胞计数可能会阻止部分组织的评价LVRS不适合分析。
总之,目前的研究表明,两种酶诱导的氧化应激反应在慢性阻塞性肺疾病定位在不同的细胞类型的肺外围。为血红素免疫反应性oxygenase-1主要发现在肺泡巨噬细胞,而免疫反应性的诱导一氧化氮合酶2型pneumocytes本地化。结果表明,这些酶可能有不同的作用失衡的肺防御和血红素oxygenase-1和诱导一氧化氮合酶可能与severeimpairment的发展慢性阻塞性肺疾病患者。
确认
作者感谢a . Baritussio抗体表面活性剂protein-B的礼物,和g . Fulgeri秘书协助。
- 收到了2002年的10月25日。
- 接受2003年2月28日。
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