文摘
夸张的中性粒细胞胞外释放陷阱(网)以及减少净间隙和无法清除凋亡细胞(efferocytosis)可能导致持续炎症急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。最近的研究在实验ARDS模型揭示了活化蛋白激酶(AMPK)之间的串扰和高机动组框1 (HMGB1),这可能导致efferocytosis的有效性,从而减少炎症和ARDS的严重性。
我们研究了中性粒细胞巨噬细胞和净间隙的控制和ARDS病人和如何检查支气管肺泡灌洗(BAL)流体控制和ARDS患者可能影响网络形成和efferocytosis。二甲双胍(AMPK活化剂)和中和抗体HMGB1改善efferocytosis和净间隙。
ARDS患者的中性粒细胞显示显著减少细胞凋亡。相反,净形成ARDS患者的显著增强。暴露的中性粒细胞ARDS BAL流体提升净产量,而落下帷幕流体控制没有影响。巨噬细胞吞没网和凋亡中性粒细胞减少ARDS患者。值得注意的是,激活AMPK在巨噬细胞或中和HMGB1 BAL液改善efferocytosis和净间隙。
总之,恢复AMPK活性与二甲双胍或特定的中和HMGB1的BAL流体代表有前途的治疗策略降低ARDS期间持续的肺部炎症。
文摘
恢复的AMPK激活和特定的抑制HMGB1可以减少肺部炎症在人类ARDShttp://ow.ly/bxCj30ktyiZ
介绍
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种急性炎症性肺损伤的特点是一个hypoxaemic呼吸衰竭后endothelial-epithelial屏障的破坏,肺泡损伤和肺水肿(1,2]。尽管重大急救护理的发展,抗生素和肺通气策略,有效治疗干预措施减少肺损伤的严重程度和ARDS患者的死亡率是不可用的3- - - - - -5]。中性粒细胞是第一行的先天免疫反应,产生抗菌肽,活性氧、细胞因子和其他炎症介质(6]。中性粒细胞也能释放嗜中性粒细胞胞外陷阱(网),一个独特的DNA机制部署到细胞外环境(7,8]。虽然这些功能是重要的目标微生物制剂,夸张的和长时间的激活中性粒细胞的发展可能导致急性肺损伤(ALI) (9- - - - - -11]。特别是,中性粒细胞的寿命延长在ARDS和很多研究都已经证明了有害的影响与延迟凋亡中性粒细胞(9,12- - - - - -14]。类似于大量炎症介质的生产,neutrophil-driven过度净形成会加重炎症,特别是在无菌炎症条件(15- - - - - -17]。因此,时间中和的凋亡细胞,特别是凋亡中性粒细胞,并清除网似乎是重要的步骤在该决议阶段和恢复从肺损伤,因为有效去除死细胞(称为efferocytosis)中扮演着关键角色在组织内稳态的维护18]。巨噬细胞吞噬功能通常与细胞死亡的吞没;然而,净间隙的机制所知甚少(19- - - - - -21]。除了DNase最近所描述的好处我实验败血症,巨噬细胞间隙的网的作用,包括在与ARDS的发展和解决相关条件,还未确定(22]。
活化蛋白激酶(AMPK)是一个serine-threonine蛋白激酶功能作为一个至关重要的传感器和调节细胞代谢能源生产和消耗23]。最近的研究表明,AMPK活化也有强大的抗炎效果。此外,AMPK活化可以刺激巨噬细胞efferocytosis,嗜中性粒细胞和巨噬细胞摄取能力的细菌(24,25]。然而,伴随着炎症条件降低AMPK活性在巨噬细胞,中性粒细胞和肺部组织。恢复AMPK活性可能是一个有趣的方法来增加efferocytosis和可能减少炎性肺损伤在人类,小鼠模型已经报道的阿里(25,26]。此外,高机动组框1 (HMGB1),可以促进炎症的alarmin,参与的发展严重ARDS和已被证明抑制efferocytosis [27- - - - - -29日]。
因此我们设计了本研究探讨中性粒细胞和巨噬细胞的调节能力在ARDS患者肺部炎症。我们的第一个目标是评估中性粒细胞的生存和生产网的能力。其次,我们研究巨噬细胞吞噬凋亡细胞和网的能力。最后,两个潜在的治疗靶点,AMPK, HMGB1调查的能力恢复efferocytosis和净间隙,从而减少持续的炎症,降低ARDS患者的肺损伤。
材料和方法
病人
这个研究在医学雷恩大学医院的重症监护室(ICU)(法国雷恩市)。研究协议是经当地伦理委员会批准(14.38号)。由于观察的性质研究,non-opposition形式提供家庭和病人。柏林标准对ARDS患者连续登记并与病人支气管镜检查与正常支气管肺泡灌洗(BAL)肺医学系(控制患者)30.]。
支气管肺泡灌洗
落下帷幕后2天内执行起始ARDS患者的机械通气或控制参与者的门诊。BAL流体通过离心分离和细胞数量差异是决定cytospin May-Grunwald-Giemsa染色后的幻灯片。
细胞因子量化
引发白介素(IL) 6日,CCL2, CXCL10,纤溶酶原激活物抑制剂(PAI) 1 (ELISA Duoset;研发系统,阿宾顿、英国)和HMGB1 (ELISA;IBL国际GmbH,汉堡,德国),量化了BAL流体通过ELISA。
细胞隔离和文化
人类原发性支气管上皮细胞(bec)从肺部获得捐赠气管或支气管肺移植的队列(小马;试验注册在Clinicaltrials.gov标识符,NCT00980967)。一夜之间,组织被分离与胶原酶在4°C HEPES-buffered RPMI介质(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。bec在cnT17培养介质(CELLnTEC先进细胞系统AG,伯尔尼,瑞士)含有青霉素和链霉素,盘子涂有人类IV型胶原蛋白(Sigma-Aldrich)。
血样后第一个小时内从ARDS患者获得落下帷幕,或从健康的捐赠者。中性粒细胞是纯化如前所述[31日]。外周血单核细胞(PBMCs)被孤立Ficoll-Paque密度梯度(Eurobio、Courtaboeuf、法国)。PBMCs孵化的RPMI 1640含7%胎牛血清(FCS)和1% penicillin-streptomycin在37°C。洗后1 h, non-adherent细胞被完全培养基。人类monocyte-derived巨噬细胞(HMDMs)然后由文化来源于附着单核细胞与20 ng·毫升−1巨噬细胞集落刺激因子(csf);研发系统)为5天。HMDMs纯度> 80%通过流式细胞术和评估。
细胞凋亡和坏死化验
bec cnT17培养基培养24小时的50%和50% BAL液体或生理盐溶液(费森尤斯公司Kabi,塞夫尔,法国)。BEC细胞凋亡和坏死是评估通过流式细胞术使用膜联蛋白V(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国)和DAPI(4ʹ6-diamidino-2-phenylindole;美国纽约生活技术,大岛屿)。
循环中性粒细胞纯化ARDS患者或健康的捐赠者RPMI培养24小时的50% / 7% FCS和50% BAL流体或盐水。中性粒细胞凋亡和坏死是评估通过流式细胞术使用phycoerythrin-conjugated活跃caspase-3凋亡工具包(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)和异硫氰酸荧光素(FITC) anti-CD66b单克隆抗体(mAb)(美国贝克曼库尔特、迈阿密、FL)细胞凋亡。膜联蛋白V和DAPI被用来测量坏死。
净释放量化
中性粒细胞RPMI孵化30分钟在50% / 7% FCS和50% BAL流体或盐水。当表示,BAL液体中和事先与anti-HMGB1 mAb (IBL国际GmbH)或同形像控制2 h。中性粒细胞被贴上了5µmol·L−1Sytox蓝色(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) RPMI / 0.5% FCS有或没有DNase我(200 IU·毫升−1;罗氏、巴塞尔、瑞士),播种在配角96 -黑色板块(美国康宁合演公司、剑桥、MA)和刺激与否10µmol·L−1十四烷酸佛波醇酯(PMA;Sigma-Aldrich) 3 h 37°C。网的释放(称为NETosis)量化通过测量荧光与微型板块荧光读者(Varioskan ThermoFisher科学,沃尔瑟姆,妈,美国)。
网络隔离和巨噬细胞吞噬作用
中性粒细胞从ARDS患者或健康的捐赠者是孵化RPMI 25 nmol·L−1PMA 2 h在37°C。离心后,网被量化的上层清液通过测量荧光使用Sytox蓝色(5µmol·L−1)。HMDMs被允许附加在配角96 -黑色板3 h RPMI 50% / 7% FCS和50% BAL流体或生理盐水,然后Sytox blue-labelled净化网被添加。孵化2 h后37°C, HMDMs洗和净吞噬作用被荧光定量评估。净吞没比例确定的比率荧光HMDMs phagocytised网HMDMs的荧光。当表示,HMDMs孵化与anti-HMGB1中和抗体或同形像控制3 h,或与二甲双胍为2.5 h(500µmol·L−1;Sigma-Aldrich)。
免疫荧光染色
净成像,纯化中性粒细胞被固定在幻灯片涂有聚-d赖氨酸(Sigma-Aldrich),孵化RPMI 50% / 7% FCS和50% BAL流体控制或ARDS患者3 h。细胞被固定为4%多聚甲醛(PFA;Antigenfix Diapath Martingo、意大利)。盖玻片是安装与Mowiol包括Sytox蓝色(5µmol·L−1)。
吞噬作用成像,HMDMs来自单核细胞室盖玻片和ng - csf(20毫升−1)5天。HMDMs然后孵化3 h和RPMI包含neutrophil-isolated网。细胞被固定为4% PFA和标签anti-neutrophil弹性蛋白酶马伯(美国Dako Carpinteria, CA)其次是Alexa萤石488 anti-mouse二级抗体(杰克逊ImmunoResearch、伊利、英国)和德州红色x Phalloidin(技术)肌动蛋白。盖玻片是安装与Mowiol包括TO-PRO-3(1µmol·L−1;生命技术)。
efferocytosis化验,HMDMs派生室盖玻片是孵化3 h BAL流体控制或ARDS患者,有或没有500µmol·L−1二甲双胍为2.5 h。表示时,平衡液预处理与anti-HMGB1中和抗体或同形像控制。通过添加10 Efferocytosis评估6carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE)标记凋亡中性粒细胞。孵化后37°C 1 h,细胞被洗PFA和固定为4%。efferocytosis指数确定在300个细胞的百分比HMDMs包含至少一个摄取凋亡中性粒细胞。
对于所有成像,幻灯片和一个SP5共焦显微镜检查(徕卡微系统公司,位于德国)。数字图像处理使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。
免疫印迹
(磷)ampk西方墨点法进行了使用鼠标anti-AMPKα或兔子anti-phospho-AMPKα抗体(细胞信号技术),其次是辣根过氧化物酶(合)共轭anti-mouse或anti-rabbit辅助免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。肌动蛋白是涂抹加载控制,使用鼠标anti-α-actin (Sigma-Aldrich)和HRP-conjugated anti-mouse继发性免疫球蛋白。墨迹是量化使用ImageJ软件。
统计分析
定量变量表示为±sd或中位数(四分位范围)时表示,定性变量数(百分比)。使用非参数连续变量比较Mann-Whitney紫外线测试或Wilcoxon测试配对,是适当的。分析与GraphPad Prism 6.2(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。
结果
净形成ARDS患者可能导致肺损伤
ARDS BAL白细胞、中性粒细胞是主要的细胞群,然而大多数BAL白细胞在控制巨噬细胞(在线辅助图S1a和b)。ARDS患者和对照组的特点提供了表1。
几个溶性因素与肺损伤的发展,包括促炎细胞因子il - 6和CXCL10, CCL2,引发趋化因子显著增加在ARDS患者(在线辅助图就是S1c)[13,32]。我们还发现PAI-1水平显著增加,涉及表达下调efferocytosis阿里在动物模型(图1一个)[33]。因为HMGB1促进实验阿里的净释放,我们还研究了这种可能性在ARDS患者(34]。我们发现,HMGB1在BAL流体ARDS患者的显著增加与控制(图1 b)。后续分析显示大量的游离DNA在ARDS患者的平衡液,表明HMGB1积累是伴随着一个增强NETosis (图1 c)。此外,BAL流体ARDS患者被发现诱发肺上皮细胞损伤,可能与网(图1 d- g)。
ARDS患者的中性粒细胞增加生存能力
在炎症条件下,像在ARDS,中性粒细胞获得长期生存能力。确定中性粒细胞可行性,凋亡指数测量24小时后中性粒细胞文化。凋亡中性粒细胞的数量显著降低ARDS患者的循环中性粒细胞相比健康的捐赠者。这个结果证实了可行性ARDS患者的中性粒细胞增加(图3一)。在随后的实验中,我们检查了BAL液体在中性粒细胞生存能力的影响。所示图3 cBAL流体ARDS患者不同,从控制病人,增加健康的捐赠者循环中性粒细胞的可行性。后凋亡比例进一步减少暴露ARDS ARDS BAL流体循环中性粒细胞(图3 d)。然而,以确保矿山的具体组成(s)流体从ARDS患者中性粒细胞增加生存能力,我们还探讨了坏死率,发现一个趋势减少中性粒细胞坏死当暴露于BAL流体从ARDS患者(图3 e)。
HMDMs ARDS患者有吞噬能力减弱网和凋亡中性粒细胞
巨噬细胞的能力抵消凋亡中性粒细胞中起着重要的作用终止和解决炎症条件。最近的研究也表明,巨噬细胞参与清除网(20.,35]。所示图4一- d,显著减少净吸收和凋亡中性粒细胞的HMDMs efferocytosis ARDS患者与健康的捐赠者。此外,类似的吞噬能力降低曝光后观察HMDMs从健康的捐赠者BAL流体从ARDS患者(图4 e)。进一步减少吞噬指数发现与ARDS BAL治疗ARDS HMDMs液(图4 f)。相比之下,BAL流体控制患者efferocytosis(没有影响图4 d与4 e和f)。这个发现也表明,减少efferocytosis是由可溶性组件在ARDS患者的肺液。
AMPK的影响和HMGB1 efferocytosis和净间隙
确定因素影响NETosis (s), efferocytosis和净吞没,我们首先检查HMGB1的影响(图5一个)。我们没有观察到任何重大HMGB1-neutralising抗体对网络形成的影响(图5 b)。相反,我们发现一个anti-HMGB1抗体增加凋亡中性粒细胞的间隙ARDS HMDMs (图5 c)。然而,它没有影响净吸收(图5 d)。HMGB1的能力影响efferocytosis符合先前的研究在小鼠模型中炎症器官损伤,特别是连接HMGB1释放到细胞外环境和减少凋亡细胞的清除(27- - - - - -29日]。
除了负面影响由细胞外HMGB1介导炎症条件与代谢相关的免疫和实质细胞重编程与巨噬细胞(AMPK活性下降有关36]。值得注意的是,AMPK活化剂,包括二甲双胍,已被证明会促使efferocytosis阿里也减少的严重程度(24- - - - - -26]。因此,我们研究了AMPK活化是否也能恢复HMDMs从ARDS患者的吞噬能力。所示图5 fAMPK活化,即。Thr172-AMPK磷酸化,显著减少HMDMs BAL治疗ARDS患者的体液。此外,我们发现,文化与二甲双胍ARDS HMDMs恢复AMPK活化(图5克)。这个激活的吸收显著增加凋亡中性粒细胞和网(图5 h和我)。
讨论
我们的研究揭示了主要的发现可以提高或维持在ARDS肺部炎症。首先,尽管中性粒细胞寿命显著增加,intra-alveolar中性粒细胞释放网通过通路称为NETosis非常重要,BAL ARDS患者的液体可以增加网的释放,这可能引起肺损伤。其次,在ARDS情况下,巨噬细胞的吞噬能力网和凋亡细胞明显减少。我们还发现,阻断HMGB1和激活AMPK可以增强网和凋亡细胞的清除。
临床和组织学研究表明,ARDS的严重程度和结果有关的炎症过程反映在支气管肺泡液体(13]。大量的临床和动物实验带来了证据表明,中性粒细胞有直接影响ARDS的发病和持久性。例如,年代斯坦伯格星期三等。(12)发现肺泡巨噬细胞能提高ARDS幸存者nonsurvivors相比,和得出结论,持续肺泡炎症与高死亡率相关。因素之一,可以维持炎症条件下,增加NETosis和减少巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力和网似乎是至关重要的。
我们发现中性粒细胞可以生产大量的网,自发或暴露在ARDS BAL液体。网是由decondensed染色质纤维涂有抗菌蛋白。NETosis可能需要膜破裂和嗜中性粒细胞的损失函数(所谓的“自杀NETosis”)17]。然而,Yipp和K乌兰巴托(37)已经证明,在感染的早期阶段,NETosis参与中性粒细胞,没有经历裂解和留存的能力来执行招聘、趋化性和吞噬作用(所谓的“重要NETosis”)。在我们的研究中,并可能在ARDS设置,NETosis不会导致细胞死亡,因为我们发现中性粒细胞寿命增加。尽管网的主要作用是避免细菌扩散,网被发现在ARDS玩有害对肺损伤的影响,一些研究指出,净在细菌性肺炎只有恶化形成肺损伤,没有任何杀菌活动(17,38]。此外,Narasaraju等。(15]表明,小鼠的挑战与流感,蚊帐了阿里的煽动肺泡毛细血管损伤。因此,NETosis和清除网应该充分监管在活的有机体内和缺陷机制负责净间隙可能导致持续炎症和组织损伤的恶化15,39]。描述了两种机制的净间隙:DNase I-dependent消化和巨噬细胞吞噬作用的17]。后者已经消失在我们的研究中发现。我们还表明,efferocytosis降低ARDS。间隙的细胞发生凋亡保护周围组织接触炎性坏死细胞释放细胞内的内容。虽然有令人信服的动物数据显示中性粒细胞分泌抗炎肽而死亡,未能有效清除凋亡细胞(尤其是凋亡中性粒细胞)会使炎症,使肺持续炎症条件可能会增加中性粒细胞涌入NETosis和加重肺损伤(40,41]。因此,巨噬细胞炎症的关键位置分辨率和起始的组织修复。恢复巨噬细胞的吞噬能力网和凋亡细胞可能感兴趣的减少肺损伤和肺纤维化等后遗症。
我们发现BAL流体从ARDS患者可以诱导efferocytosis健康和减少ARDS巨噬细胞,建立治疗干预的可能性可以提高efferocytosis和网的吞没。沿着这些线路,AMPK途径似乎是一个潜在的治疗目标。我们在研究中发现,巨噬细胞的激活AMPK在炎症条件降低,这可能与缺陷关联efferocytosis活动(24]。值得注意的是,AMPK活化增强吞噬的能力似乎与细胞骨架组织相关互动(24]。最后,我们发现抑制HMGB1可能增加efferocytosis,正如已经报道肺损伤的动物模型。HMGB1,最初被描述为一个核非组蛋白的dna结合蛋白质,随后被证明是一个alarmin参与炎症反应中发挥重要作用在招募中性粒细胞,肺损伤和抑制细菌清除肺31日,34,42]。值得注意的是,人们发现二甲双胍绑定和抑制HMGB1的行动,表明二甲双胍的影响可能是类似于HMGB1的抑制(43]。高水平的HMGB1 BAL流体从ARDS患者可以减少efferocytosis,表明抑制HMGB1,以及激活AMPK,感兴趣的可以恢复efferocytosis,减少肺损伤,最终改善ICU出院后肺功能。
结论
总之,我们的结果表明,efferocytosis和净吞没,这可能导致肺部炎症的持久性,期间减少ARDS。恢复AMPK活化与二甲双胍和特定的抑制HMGB1似乎有前途的目标减少肺部炎症和限制肺泡损伤和发展为ARDS患者的肺纤维化。
补充材料
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图S1。特征的支气管肺泡灌洗(BAL)急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和控制(Ctrl)患者。得了。落下帷幕的液体从ARDS患者的特点是细胞和体液炎症反应。a . May-Grunwald-Giemsa-stained cytospin幻灯片代表BAL的控制和ARDS患者。箭头1:巨噬细胞;箭头2:嗜中性粒细胞。b细胞绝对计数和差异BAL流体控制(n = 16)或ARDS (n = 11)。分析BAL液体显示5.74×105细胞·毫升1(差1.24 - -23.06×105细胞·毫升1)BAL ARDS患者的液体与3.15×105细胞·毫升1(差0.68 - -6.09×105细胞·毫升1)BAL流体控制的病人。il - 6 c .量化,引发CCL2, CXCL10 (n = 19)的ELISA BAL流体控制或ARDS患者。erj - 02590 - 2017 - _figure_s1
确认
免疫荧光法研究了雷恩显微镜成像中心(MRic-ALMF;的SFR嗯CNRS 3480 - 018 Biosit INSERM,雷恩,法国)。健康供者单核细胞提供了DTC中心(中投Biotherapie 0503、南特、法国)。作者感谢Mohinder Pal(英国苏塞克斯大学基因组中心,布莱顿)的仔细阅读手稿。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
利益冲突:没有宣布。
支持声明:这项工作是支持由CORECT 2015(拉西de la矫揉造作的倩碧et Translationnelle),法国雷恩楚。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2017年12月13日。
- 接受2018年6月11日。
- 版权©2018人队