摘要
部分COVID-19患者进展为严重的疾病表现,伴有呼吸衰竭,需要机械通气。识别高危患者对优化护理和早期治疗干预至关重要。我们研究了SARS-CoV-2的脱落与疾病严重程度的动态关系。
我们分析了92例COVID-19患者的鼻咽部和气管脱落情况。入院时采集标准化的鼻咽拭子或痰液。如果患者采用机械通气,则额外获得气管吸出物。实时荧光定量PCR检测SARS-CoV-2 RNA,定量检测病毒脱落。
45%(41 / 92)的COVID-19患者病程严重,需要机械通气(严重组)。在第1周,从鼻咽拭子确定的初始病毒脱落在非重症和重症病例之间没有显著差异。在第2周,可以观察到严重疾病患者的病毒脱落仍然升高。c反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6 (Il-6)和降钙素原(PCT)的时间进程显示,在重症患者病毒脱落负荷延迟下降后,炎症反应更为持久。显著比例(47.8%)的患者表现出延长的病毒脱落(>17天),这与严重的病程(73.2%)相关。
我们报告,入院时严重和非严重病例的病毒脱落没有显著差异。住院第二周SARS-CoV-2脱落增加、第二周和第三周之间全身炎症反应达到高峰以及病毒脱落时间延长与更严重的病程相关。
摘要
我们报告说,在住院治疗的第二周SARS-CoV-2脱落升高,在第二和第三周之间出现全身炎症反应高峰和延长病毒脱落与更严重的病程相关。
介绍
在COVID-19中,在最初症状稳定后经常观察到肺部迅速恶化。此前曾报道SARS-CoV-2或COVID-19的临床特征[1- - - - - -3.].有几份报告描述了病毒脱落会持续很长时间[4,5].对病毒脱落的完整评估可以对潜在的免疫机制提供有价值的见解[6].通过PCR检测病毒RNA并不一定与传染性病毒有关,因为尽管存在SARS-CoV-2 RNA,但在较晚的时间点传染性显著降低[7- - - - - -10].
肺炎是COVID-19感染最重要的临床表现,是重症患者预后的主要决定因素。在个体病程和疾病严重程度上存在显著的异质性。因此,肺部病毒的清除尤为重要[10].某些患者反应过度或免疫依赖性病毒清除减少可加重肺部症状[11]病毒倾向性、病毒脱落负荷、病毒脱落持续时间和病毒组织分布的个体差异可能在其中起作用。关于病毒脱落的组织分布和时间动力学的数据很少,需要进一步的临床特征描述。最近的研究揭示了与新冠病毒-19相关的纵向炎症反应[11],将临床可行的炎症参数与病毒脱落联系起来仍然是非常有趣的。
在我们医院,对确诊为新冠病毒-19的患者反复检测呼吸道材料中SARS-CoV-2 RNA的证据,包括反复的气管内抽吸物(ETA)、痰和鼻咽拭子(NPS)。
在此,我们报告了在2020年2月29日至5月17日期间因COVID-19在我院住院的92例连续患者的临床和病毒学发现,描述了病毒脱落的动态。
方法
研究设计
本研究是对2020年2月29日至2020年5月17日在慕尼黑大学医院连续住院的所有实验室确诊的COVID-19患者的回顾性队列研究。
病人
所有疑似COVID-19的连续患者都被转诊或进入了我们大学医院的急诊病房,这是德国南部的一个主要学术中心。这些患者经SARS-CoV-2 PCR阳性回顾性确诊为COVID-19病例。仅纳入成人(年龄≥18岁)。我们采用简单的疾病严重程度分类:重症病例定义为与之前使用的一样需要机械通气的患者[12].在我们的患者中,中度疾病被定义为没有机械通气和需要充氧,而两者都没有则定义为轻度病程。非重症包括轻、中度疾病。
样品
NPS、痰或ETA(7名入院时插管的患者)在入院时常规采集,并根据当地指南进行。临床怀疑有新冠病毒19型时采集NPS样本。此外,当CT扫描显示新冠病毒19型典型浸润且NPS为阴性或用于临床监测时,采集痰样本。入院时,最多采集两个NPS样本(至少有12个 h)和一个痰样本(如有必要)。
重复采集任意一种样本(NPS、痰液和ETA)进行临床监测。当COVID-19症状消退,连续两次(至少一天的距离)出现阴性结果时,停止检测。
病毒载量分析
病毒载量表示为每毫升痰液、ETA或拭子样本运输介质中的SARS-CoV-2-RNA拷贝数。我院标准拭子含1ml Amies液体转运介质(eSwab™,COPAN Diagnostics)。
在Max von pettenkfer - institute认可的常规诊断实验室中,以下PCR检测方法用于定量核衣壳(N1)疾控中心协议的反应[13),信封扩大Charité协议[14,15),核衣壳Seegene Allplex 2019-nCoV试剂盒和Roche Cobas SARS-CoV-2试剂盒的扩增核衣壳反应.
标准曲线产生在多个稀释复制使用一个质粒含有核衣壳基因(2019- ncov -n positive econtrol, IDT)或基于数字液滴PCR结果的拷贝数临床样本[16].每一种PCR检测都得到了不同的公式,将Ct/Cp值转换为拷贝数估计值:80 * 95 ^ (40 29-Cp)疾病预防控制中心(N1) 80 * 99 ^(39岁,34-Cp)查利特(E), 80 * 2, 00 ^ (38, 63 - ct) Seegene说Allplex 2019 - ncov化验(N)和80 * 1,99 ^(39岁,34-Ct)罗氏Cobas SARS-CoV-2 (N)。这些计算不考虑单独的PCR运行之间的差异,不同的聚合酶链反应的化学物质,或不同的核酸提取方法。然而,由于这些变量适用于所有的患者组,它们不影响本研究结果的解释。
“病毒脱落”是指通过PCR在呼吸道物质中检测SARS-CoV-2 RNA。然而,我们量化的这个参数也可能包括亚病毒粒子或来自死亡细胞的RNA,并不等同于完全的病毒粒子排泄,甚至传染性。
血清炎症参数
在Cobas 8000平台(罗氏诊断公司,巴塞尔,瑞士)检测降钙素原,在Cobas e801平台(罗氏诊断公司,巴塞尔,瑞士)检测白细胞介素-6。c -反应蛋白(CRP)水平在Cobas c702平台上使用Tina-quant C-reactive protein assay(罗氏诊断公司,瑞士)测定。
统计分析
使用Student T检验或ANOVA(视情况而定)检查参数连续变量(如病毒载量)的差异。使用Mann-Whitney U检验或χ检验检查临床特征的分布2测试,适当的。曲线拟合采用4节平滑样条。cox -回归分析研究了病毒脱落持续时间与临床特征的相关性,如性别、年龄、动脉高血压、糖尿病、冠状动脉疾病和Charlson共病评分[17].无重复阴性结果的患者在阳性的最后一天进行审查。p<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 25或Graphpad Prism 8.0.1进行统计学分析。
道德声明
当地伦理委员会批准了路德维希·马克西米利安慕尼黑大学的这项研究(项目编号:no。20 - 454)。
结果
入院时,所有患者要么进行NPS取样,要么进行ETA取样,或者两者都进行。在所有92例病例中,呼吸道标本均经实时荧光定量PCR确诊为SARS-CoV-2。病人的特征见表1a和b.回顾性确认患者为2020年2月29日至5月17日收治的COVID-19确诊病例。入院时,大多数病例(85/92)是自主呼吸,病情不严重。7例患者转入我院,已接受机械通气。在85例非重症患者中,34例患者在住院期间发展为重症。在剩下的51例(非重症)患者中,有20例患者发展为中度病程。中位年龄62岁(四分位范围51-75岁)。显著比例的患者有多种共病,平均Charlson共病评分为2,5(四分位数范围为1至4),其中动脉高血压(49%)和糖尿病(17%)是最常见的共病。病人的其他特征见表S1.共检测473份呼吸道样本(245份NPS、228份气管吸出物和9份痰标本)。平均每个患者采集5.3个样本,两组检测频率相似表S2.
SARS-CoV-2病毒脱落和疾病严重程度
病毒脱落,根据疾病严重程度,如图2.严重疾病和非严重疾病的初始病毒脱落量没有差异图2一个.我们排除了首次试验时间对病毒脱落负荷的影响图2 b.对于后续的检测,我们计算了每周患者的平均病毒脱落量,以减少样本时机和样本偏差的影响。根据疾病严重程度,直接比较病毒脱落,重症患者在第2周时病毒脱落明显升高图2 c+表S2.
在非严重疾病患者的鼻咽拭子中,与第1周相比,SARS-CoV-2病毒在第2周(p=0.0098)、第3周(p=0.0003)和第4周(p=0.0004)的脱落量显著下降图2 d.在重症患者中,病毒脱落在第2周无差异(p=0.3089),但在第3周(p=0.0056)和第4周(p<0.0001)有所减少,如图中所示图2 d.
严重疾病患者的ETA在第3周(p=0.0358)和第4周(p=0.0022)较第1周显著下降图2 e.
SARS-CoV-2病毒脱落和全身炎症
为了进一步描述对病毒脱落和疾病严重程度的纵向炎症反应,我们描述了白介素-6、降钙素原和CRP的时间进程。我们计算了白细胞介素-6、降钙素原和CRP的每周平均值,以防止取样偏倚。接受托西珠单抗的患者被排除在CRP和Il-6分析之外(n=4)。统计分析显示,除降钙素原外,重度组白细胞介素-6、CRP在早期时间点显著升高,在后期时间点(3-4周)显著降低。最初的病毒脱落量与PCT峰值、Il-6峰值或CRP峰值无相关性图3b.曲线拟合显示,白细胞介素-6和降钙素原在2 - 3周达到峰值,而CRP在1 - 2周达到峰值,在2 - 3周下降图3.严重疾病患者在入院时直接降钙素原水平(入院后<48小时测量的PCT)显著升高图S2a,根据合并感染或继发感染进一步分层(表S4)及图S2b附在补充资料中。
SARS-CoV-2病毒脱落持续时间
病毒脱落时间可判断是否需要机械通气图S2约登指数为0.467;截距为17是最优的。在报告的92例患者中,34%的患者观察到延长的病毒脱落(>17天)。病毒脱落的持续时间随疾病严重程度的不同而有显著差异表1;这在图4.
为了纠正其他变量的影响,通过单因素和多因素cox -回归分析研究了延长的病毒脱落。为了验证“病毒脱落持续时间”的定义,还进行了cox -回归分析,将“病毒脱落持续时间”定义为从症状出现到首次检测结果为阴性的时间。结果的意义和解释在两种定义之间基本上没有变化(见补充图S1).多变量分析证实长时间的病毒脱落与严重疾病有关。此外,未发现病毒脱落与免疫抑制之间的相关性表2.
讨论
我们的研究显示,在COVID-19重症患者的前两周,病毒脱落量仍然升高,而在NPS的非重症患者组,病毒脱落量较早下降。此外,我们发现持续性病毒脱落与疾病严重程度有关。在一组欧洲患者中,SARS-CoV-2的时间进程和病毒脱落尚未进行调查。病毒脱落动力学的特征是高度感兴趣的,因为它可能指示潜在的免疫过程。
以往对SARS-CoV-2在呼吸道样本中的病毒脱落的调查显示,在更深的呼吸道样本中有更高的病毒脱落[10,18].黄等。调查了不同呼吸道样本类型(支气管和鼻咽)中SARS-CoV-2病毒的脱落情况,发现病程严重的患者在深呼吸道样本中病毒脱落增加[19].这些发现与我们的研究一致,在我们的研究中,ETA和NPS测试显示,当两种样本类型直接比较时,具有很高的可变性。因此,在随后的测试中,他们被分别分析图1.这种变异可能是由SARS-CoV-2病毒的趋向性差异所解释的,但NPS对鼻咽标本的技术限制可能会增加这一差异[20.].
一些研究SARS-CoV-2病毒脱落和疾病严重程度的研究将支气管和鼻咽道样本作为呼吸道样本[8,21,22]。如前所述,单独分析下呼吸道样本和上呼吸道样本可能会防止取样偏差。单独分析时,我们发现重症患者组第2周的SARS-CoV-2鼻咽病毒脱落率仍然较高,而非重症患者组在第2周下降。比较abs时入院时病毒完全脱落,我们没有发现根据疾病严重程度的显著差异。严重组在第2周持续升高表明缺乏病毒清除,这是肺部恶化的原因。初始病毒载量根据疾病严重程度没有差异,这可能进一步提示重复感染ACE-II受体结合饱和引起的离子上限[23].最近发表的关于郑和的研究等.显示重症患者呼吸道样本中SARS-CoV-2病毒的脱落量高于轻症患者[21].在本研究中,呼吸道样本没有区分痰液和唾液,这可能解释了观察到的病毒脱落差异,因为在重症组中纳入更多的痰液样本也可能导致病毒脱落水平升高。
在分析全身炎症标志物时,我们观察到,在CRP最初升高和降低(第2周)后的第2 - 3周,Il-6和降钙素原出现了持续的全身炎症反应。这些结果支持先前发表的描述严重疾病患者免疫反应的数据[11,24,25].有趣的是,少量但相关比例的COVID-19患者出现了高炎症性重症病程,而重症患者和非重症患者的初始病毒载量没有差异,但重症患者在第2周时仍保持较高水平。这些发现与报道的RECOVERY试验的疗效一致,该试验显示类固醇治疗的免疫抑制导致28天死亡率显著降低[26].我们可以用其他不平衡的高炎症综合征来做类比,如。,只有一小部分患者在感染EBV后出现噬血细胞性淋巴组织细胞增多症[27].托西珠单抗IL-6受体阻滞剂在中度病情的COVID-19患者中缺乏疗效,表明参与这一炎症过程的其他潜在途径[28].
Il-6和CRP的不协调运动提示先天因素主导早期免疫反应。最近的研究表明,Il-6并非只与CRP对应(CRP通常由肝细胞在对Il-6作出反应时产生),尽管Il-6的某个(低)阈值是CRP产生所必需的[29- - - - - -31].两项更大的研究表明,血清IL-6在预测COVID-19临床结局(如呼吸衰竭和死亡)方面优于CRP、铁蛋白、肝酶和其他简单的临床实验室标志物,最佳临界值分别为80和86 pg/L [32,33].
降钙素原值为0.2-0.5 ng·mL−1被认为对下呼吸道症状和肺浸润患者的细菌性肺炎敏感且特异[34,35].有趣的是,我们观察到在有或没有合并感染或重复感染的组中PCT水平升高,这可能表明存在亚临床细菌合并感染(图S2b).需要强调的是,抗菌治疗可能先于痰/ETA培养时机,因此可能低估痰阳性患者的比例。有必要进一步研究COVID-19患者中细菌合并感染、亚临床合并感染和定植的重要性[36- - - - - -38].
到目前为止,已经在几个选定的患者群体中调查了SARS-CoV-2病毒脱落的持续时间。在对191例中国COVID-19住院患者的早期综合临床特征的研究中,病毒长期脱落明显。然而,关于绝对拷贝数或采样地点(痰、NPS或ENTA)的数据无法获得[4]另一项研究调查了病毒脱落和传播性,并根据患者亚组对病毒脱落的时间模式进行了分层[7].在任何被调查的亚组中都没有显示病毒脱落持续时间的增加。然而,在本分析中,只有少数非重症和重症亚组的患者被纳入,这些亚组的定义尚不明确。我们的研究表明,在我们的住院患者(n=44;44.8%的患者在发病后至少17天出现病毒脱落),重症患者出现频率较高表2.
呼吸道标本中SARS-CoV-2病毒脱落持续升高,提示重症患者免疫清除降低。然而,在年轻和很少共病的个体中,病毒清除迅速,但在少数症状少的患者中观察到延长的病毒脱落[11].导致这种现象的重要潜在因素可能是宿主因素或免疫反应的差异。有趣的是,男性与病毒在体内的长期脱落有关表2.男性患者的病毒清除延迟可以用免疫学和流行病学的性别差异来解释[39,40].
此外,病毒RNA的存在超过50% 症状出现后数天可能提示病毒持续复制,从而引起慢性局部炎症反应。这些发现可以解释新冠病毒-19患者通常难以长期康复,同时伴随着持续的局部免疫反应,对呼吸系统和其他器官产生有害影响[41,42].在SARS中,观察到类似的病毒脱落模式[43].与SARS一样,尽管血清转化,但SARS- cov -2病毒脱落的缓慢减少表明,COVID-19中正在进行细胞清除,抗体介导的清除无效[10,43].进一步研究免疫学因素对COVID-19病程和结局的影响。
本研究的局限性
我们的研究有几个局限性。首先,这是一项样本量适中的回顾性单中心队列研究。这可能导致在亚组分析中混杂因素的分布不平衡。由于非重症患者住院时间较短,检测的患者数量随后减少,而其他患者在我们分析时仍在进行通气;当比较病毒脱落时,收集的样本可能不太具有代表性。PCR检测的病毒脱落量主要依赖于样本采集和分析前因素,影响检测到的病毒脱落量。宿主因素如随着坏死/凋亡细胞的增加而增加的支气管易感性也可能影响病毒的脱落量。
结论
我们的研究结果显示,在最初几周的严重病程中,病毒脱落量仍然升高,并可能持续更长的时间。持久和不平衡的炎症反应可能最终导致疾病的严重程度。进一步的研究应该调查与这些现象相关的个体宿主因素,以阐明潜在的机制。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.qdcxjkg.com
- 收到了2020年7月10日。
- 接受2020年12月13日。
- ©2021年作者。
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