原发性呼吸道感染期间多种呼吸道病原体的检测:使用实时聚合酶链反应的鼻拭子与鼻咽吸入

在本研究中，我们介绍了在原发性呼吸道疾病期间对婴儿呼吸道病毒的多重检测，调查了鼻拭子和鼻咽抽吸物的敏感性，并评估患者特征和病毒载量是否在敏感性中起作用。有首次呼吸道感染迹象的健康婴儿被纳入研究。收集成对的鼻咽吸液和鼻拭子。对11种呼吸道病原体进行实时聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction, PCR)检测。收集了98例婴儿的成对鼻咽抽吸物和鼻拭子。鼻病毒(n= 67)和呼吸道合胞病毒(n= 39)是最常被检测到的。合并感染发生率为48% (n= 45)的婴儿。鼻拭子对呼吸道合胞病毒(51%比100%)和鼻病毒(75%比97%)的敏感性低于鼻咽吸液。鼻拭子的敏感性由循环阈值(CT)值(p< 0.001)。在症状严重的儿童(评分≥11分)中，棉签对呼吸道合胞病毒的敏感性为100%，而对鼻病毒不敏感。结论是，对于基于社区的研究和监测目的，可以使用鼻拭子，尽管其敏感性低于吸出，特别是用于检测呼吸道合胞病毒(RSV)感染的轻度病例。

呼吸道病毒是儿童患病的常见原因，特别是在儿童生命的头几年，并可能导致更严重的发病率和住院[1- - - - - -4］．不同类型的标本可用于病毒诊断。鼻咽抽吸(NPA)一直被认为是最好的取样技术，但比鼻拭子(NS)更具侵入性，对婴儿造成的痛苦明显更大[5］．许多研究比较了NPA与鼻咽拭子的敏感性[6]、鼻喉拭子[7]和NS [5，8- - - - - -10］．一般采用常规技术，如病毒培养和抗原检测方法。实时聚合酶链式反应(PCR)的使用可克服因样本类型不同而对呼吸道病毒敏感性的差异[7］．

这些采样方法与实时PCR相结合的比较数据有限。据观察，鼻喉拭子是一种侵入性较小的诊断技术，具有足够的敏感性，可用于门诊和大型社区儿童环境[7］．然而，没有对鼻病毒进行测试，尽管这种病毒通常感染婴儿[11］．本研究的目的是介绍原发性呼吸道疾病期间婴儿常见呼吸道病原体的检测，调查NS和NPA的敏感性，并评估患者特征和病毒载量在两种采样方法敏感性中的作用。

研究群体

这项研究是荷兰乌得勒支大学医学中心(UUMC)的荷兰羊膜液研究的一部分，[12］．健康婴儿在出生时就被纳入研究，他们在一岁前都有原发性呼吸道感染的风险。出生后1年停止数据收集和事件采样。从2006年4月至2008年4月，包括两个冬季，从98例婴儿中获得了NPA和NS成对标本。家长应在症状出现后24小时内通知临床工作人员。临床工作人员在36小时内访问了儿童，并通过标准化问卷记录了病史。根据Gern等人的说法，对症状进行评分。[13]，括号内为点:发热(>38°C) (1);咳嗽，轻(1)、中(2)、重(3);轻度鼻炎(1)，中度至重度鼻炎(2);声音沙哑(1);病程>4天(1);呼吸暂停(3);喘息(5);(5)的论文;tachypnoea (5);轻、中、重度感染分别为0-4分、5 - 10分和11分及以上。 Specially trained clinical staff obtained paired NS and NPA.

标本采集

NPA是通过使用婴儿粘液提取器(Vygon)获得的。两个鼻孔都吸了。此外，还收集了一个NS;使用不同的棉签从一个鼻孔和一个硬腭采集样本(婴儿粘液提取器，Vygon制药公司，Ecouen，法国)。然后将两个棉签插入一个含有2毫升病毒传输介质(Gly介质)的小瓶中。

实时聚合酶链反应

在NS和NPA上对呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、冠状病毒、流感病毒、副流感病毒(1,3型)、副流感病毒(2,4型)、博卡病毒、肺炎支原体而且衣原体肺炎．使用QIAamp DSP病毒试剂盒(QIAGEN, Valencia, CA, USA)提取核酸。每个样品在200 μl缓冲液中洗脱。cDNA由MultiScribe逆转录酶(RT)和随机六聚体(均来自Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)合成[14］．每100 μl反应混合物含有60 μl cDNA混合物和40 μl洗脱RNA。在25℃孵育10 min后，在48℃下RT 30 min，然后在95℃下RT失活5 min [14］．样品在含有20 μl (c)DNA的50 μl反应混合物和30 μl正向和反向引物和探针混合物中进行分析。所有样本在提取前均加入内控病毒(小鼠脑心肌炎病毒[RNA]和磷疱疹病毒[DNA])。使用ABI Prism 7700序列检测系统进行扩增和检测;在50℃条件下2 min获得最佳AmpErase UNG活性，在95℃条件下10 min激活AmpliTaq Gold DNA聚合酶，然后在95℃条件下15 s和60℃条件下1 min进行45个循环[15］．van de Pol等人提供用于RSV、流感病毒、副流感病毒和腺病毒实时PCR检测的引物和探针。[16]和real-time PCR检测如前所述[17- - - - - -19］．

统计分析

与以往的研究类似，我们采用了一个共识标准来评估每种检测方法的敏感性:NPA或NS的阳性结果被认为是病原体存在的金标准，并用于计算NPA和NS检测呼吸道病原体的敏感性。采用卡方检验并进行logistic回归分析。结果变量定义为样本为阳性。模型中使用的变量为年龄、性别、症状评分和多种病毒检测。差异有统计学意义p-value <0.05。统计分析在STATA 10.0 (StataCorp LP, College Station, TX, USA)中进行。

在94名儿童中共鉴定出163种呼吸道病原体。大多数儿童(73.5%)在取样时患病时间不超过4天。初发感染的中位年龄为104天(范围33-269)，症状的中位评分为3分，表明病情轻微(表2)1)．在所有患病5天或更长时间的儿童中，检测到一种或多种病原体。

一半的孩子感染了多种病原体

在49名儿童(50%)中检测到一种病原体:29种鼻病毒，11种RSV, 4种冠状病毒，2种hMPV, 2种2型和4型副流感病毒，1种博卡病毒。在25名儿童中检出2种病原体，其中24例(96%)为鼻病毒合并RSV。在20名儿童中，在呼吸道症状首次发作期间检测到两种以上病原体(三种病原体:n= 17;四种病原体:n= 2;五个病原体:n= 1)。病原合并感染率分别为:鼻病毒(57%)、hMPV(60%)、RSV(72%)、冠状病毒(71%)和博卡病毒(91%)。

鼻拭子对呼吸道合胞病毒和鼻病毒的敏感性低于抽吸物

发现最多的是鼻病毒(n= 67)，其次是RSV (n= 39)和冠状病毒(n= 14)2)．未检出流感病毒或副流感1型和3型病毒。NPA对病原菌的检测灵敏度为92% (CI_95％86.7-95.7)，而NS的敏感性较低，为67% (CI_95％59.1 - -74.0)。对于RSV和鼻病毒的检测，NS的敏感性低于NPA(表2)2)．

鼻拭子的敏感性取决于病毒载量

NPA和NS对鼻病毒和RSV的敏感性值进行了更详细的调查3.)．对于症状评分较低的儿童，NS的敏感性低于NPA。NS对30-40周期阈值(CT)的敏感性低于NPA。为了评估NS的敏感性是否因年龄、性别、多种病原体、症状评分和CT值而不同，采用卡方检验。NS对RSV检测的敏感性与症状评分(p= 0.001)， NS的敏感性与RSV和鼻病毒的CT值相关(p< 0.001)。

在logistic回归分析中，年龄和性别对RSV或鼻病毒的检出率无显著预测作用。症状评分预测NPA和NPA的RSV检出率(优势比[OR]: 1.21;CI_95％1.07-1.39)和NS (OR: 1.28;CI_95％1.12-1.48)，而两个样本的症状评分与鼻病毒检出率呈负相关(OR: 0.87;CI_95％0.78 - -0.98)。多种病原体的存在预测RSV (OR: 8.98;CI_95％3.03-26.7)或鼻病毒检测(or: 3.66 CI_95％1.33-10.08)。当进行同样的分析时，用反向回归进行p< 0.2，结果无变化。

这项研究表明，检测到呼吸道病原体的婴儿比例很高(96%)，合并感染很常见。在20名儿童中，在呼吸道症状首次发作期间检测到两种以上的病原体。RSV(72%)、冠状病毒(71%)和博卡病毒(91%)经常合并感染。

最近报道了儿童肺炎在幼儿中合并感染的高发率，特别是在年龄小于12个月的儿童中[20.]及因急性呼吸道感染而住院的儿童[21，22］．最常检出的病毒是呼吸道合胞病毒，其次是人类博卡病毒及鼻病毒[21，23］．一种常见的组合是呼吸道合胞病毒和博卡病毒[21］．尽管联合感染的发生率很高，从14-16%不等[21，22]至27% [20.]，我们的研究显示合并感染率更高。这种高联合感染率的一个可能的解释可能与NPA的双鼻孔取样有关。人类博卡病毒是一种新发现的病毒，在有急性呼吸道症状的患者的呼吸道分泌物中检出，占样本的2 - 19% [24］．在40%的博卡病毒阳性儿童中观察到同时感染另一种病毒[25］．博卡病毒与其他呼吸道病毒的频繁关联可能是由于博卡病毒在呼吸道中的持续存在[25］．

此外，我们还用实时PCR方法检测了NPA和NS的敏感性。NPA的敏感性为92%，而NS的敏感性为67%。特别是在检测鼻病毒和RSV时，NS的敏感性(分别为75%和51%)低于NPA(分别为97%和100%)。对于症状评分高的儿童，NS对RSV的敏感性为100%。对于RSV和鼻病毒，由CT值显示的病毒载量是NS敏感性的主要决定因素，并呈剂量依赖性。症状评分预测NPA和NS的RSV检出率，而在两个样本中观察到症状评分和鼻病毒检出率呈反比关系。

在以社区为基础的研究或流行病学研究中，棉签的使用被认为是一种合适的替代品。棉签的主要优点是采集比抽吸更不痛苦，更方便，因为不需要额外的设备[5］．这些因素可能超过一些敏感性的降低。分子方法在检测呼吸道病毒方面的优势已被报道[26，27]和Lambert等人报道，使用这些方法似乎克服了之前观察到的低创标本与传统实验室方法结合时灵敏度下降的问题[7］．随着最近开发的蜂群棉签，灵敏度进一步提高，蜂群棉签对儿科患者具有快速和创伤较小的优势[28］．然而，蜂群棉签在门诊呼吸道感染中的敏感性可能低于住院患者。考虑到不同类型的棉签和患者人群，还需要进一步的研究，并应该测试广泛的呼吸道病原体。

我们的研究结果表明NS的敏感性较低，特别是对RSV。在其他使用常规非扩增方法的研究中也报道了类似的结果[8，9］．Lambert等人没有测试鼻病毒，这是我们的研究和其他地方最常检测到的病毒[11，29］．在我们的研究中没有发现流感。这不能用抽样偏差来解释，因为大多数棉签都是在冬季采集的，而在冬季，RSV和流感的发病率都达到了高峰。一个可能的原因可能与患者群体和人口规模较小有关。另一项研究显示了类似的结果，鼻病毒和呼吸道合胞病毒是最常被检测到的[29］．

这项研究有许多局限性。首先，一个限制是采样时间。其中5例在发病后10天进行了采样。由于RSV的病毒脱落在第0天至第6天之间最高，因此采样最好在这段时间进行[30.］．然而，高比例的阳性样本表明这种效应并不是本研究的主要缺陷。其次，在本研究中，没有评估样本采集的疼痛和不适，但其他研究对此提供了参考[5］．最后，尚不清楚标本的获取顺序是否可能导致NS的检出率较低。可能是通过吸双鼻孔吸入NPA，减少了含有病毒或病毒核酸的分泌物。这与NS很少检出轻微病例的发现相一致，因为NS的敏感性随着症状评分越低和CT值越高而下降。由于样本收集的顺序和性质与Lambert等人的研究略有不同，NS的敏感性可能被低估，在解释NS敏感性时需要谨慎。

RSV和鼻病毒常见于婴儿原发性呼吸道感染，约半数儿童发生合并感染。NPA对RSV和鼻病毒的检测灵敏度高于NS。虽然方法的灵敏度很重要，但也必须考虑到不同采样方法的优点。NS的最大优点是这种方法可以在门诊进行，不需要特殊的设备，比NPA成本更低，给患者带来的痛苦更少。虽然对RSV的敏感性有所降低，特别是在症状轻微的婴儿中，但NS便于在社区研究中对患者进行抽样，并可用于监测目的。

NS:

鼻拭子

NPA:

鼻咽抽吸

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

hMPV:

人类metapneumovirus

RSV:

呼吸道合胞病毒

这项工作得到了荷兰哮喘基金会(荷兰哮喘基金会)的资助。3.2.07.001)、WKZ研究基金(批准号;2004年2月)和欧洲儿科传染病学会(ESPID)的奖学金。

乌得勒支大学医学中心(UUMC)医学伦理委员会批准了研究方案，并获得了参与儿童父母的书面知情同意。

利益冲突

作者声明他们发表这篇论文没有利益冲突。

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从属关系

1. NIVEL:荷兰卫生服务研究所，乌得勒支，荷兰

   t·j·梅尔霍夫和f·舍勒维斯

2. 荷兰乌得勒支乌得勒支大学医学中心儿科

   M. L.侯本，J. L. L.金彭，R. W.侯弗兰德，L. J.邦特

3. 荷兰乌得勒支乌得勒支大学医学中心病毒系

   F. E. J.科恩加茨

4. 荷兰阿姆斯特丹自由大学医学中心全科/EMGO研究所

   f . Schellevis

相应的作者

对应到L. J.邦特．

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