摘要
淋巴管平滑肌瘤病(LAM)肺炎细胞中SARS-CoV-2入口受体ACE2表达的增加与自然杀伤细胞中干扰素通路的上调以及LAM相关成纤维细胞中IL6表达的增加有关。
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呼吸衰竭是Covid-19的最严重结果之一,大部分严重病例与显着的肺功量相关[1].淋巴胆管瘤症(LAM)是由肿块硬化基因突变引起的妇女的进步囊性肺病,导致MTOR复合物1(MTORC1)信号通信网络中的异常血管活性,其在间充质源性2].LAM感染COVID-19的风险尚不清楚。
我们通过使用10×基因组学铬平台,通过单细胞RNA测序(ScRNA-SEQ)来分解五个女性的肺癌肺的肺部肺(46 659个细胞)。滤出低质量细胞,定义为少于200个不同基因的细胞或以高于10%的线粒体基因百分比,滤出。原始数据被归一化,如前所述,日志转换[3.].去除来自不同平台的数据集的批处理效应,使用Seurat对数据集进行集成[4].使用SingleR算法在LAM中识别的主要细胞类型[5](无花果。1A)包括上皮细胞(I型和II型肺细胞,纤毛细胞),免疫细胞(T细胞,B细胞,巨噬细胞,树突状细胞,天然杀伤细胞)和内皮细胞(淋巴内皮细胞和血液内皮细胞)。通过手动绘制标记基因进一步证实细胞型注释。重新聚类的肺细胞显示ACE2主要在II型肺细胞中表达,而TMPRSS2以所有上皮细胞类型表达(无花果。1A),与先前数据一致[6- - - - - -8].将LAM肺与健康肺现有的scRNA-seq数据集(GSE122960)进行比较(n=8) [9],来自于从中风,出血,脑损伤或枪声中死亡的捐助者。由于亚洲个人表达更高的报道,不包括亚洲遗传背景的一个健康对照ACE2比其他人群[10.].
II型肺细胞表达的百分比ACE2LAM组(2.6%)显著高于健康组(0.9%,p=0.03, Mann-Whitney U检验,无花果。1A).与健康的肺相比,ACE2含有I型I的表达也较高(1.5%与0.7%, p=0.14)和纤毛细胞(1.1%与0.5%, p = 0.39)。tmprrs2.lam相关II型肺细胞的表达也显著升高(56%)与45%, p = 0.048) (无花果。1A)和纤毛细胞(33%与22%, p=0.14)。重要的upregulationACE2与健康肺相比,其他肺状况的单细胞数据集中未观察到肺纤维化(GSE122960) (n=4) [9[肺癌(n = 2)[8]和传染病(n=6) [8]除了来自HIV +和结核分枝杆菌(TB)+患者的一种肺(TB)+患者[8](无花果。1A).这些观察表明肺细胞表达增加ACE2和TMPRSS2这表明mtorc1过度活跃的LAM细胞可能诱导这种效应。
我们进一步研究了ACE2 + / TMPRSS2 +LAM中的细胞被引入感染超出这些受体的表达用于病毒进入。戈登et al。在HEK293T细胞表达实验中鉴定出332种与SARS-CoV-2蛋白发生物理相互作用的人类蛋白[11.].我们计算基于Seurat的332基因的平均表达的Covid模块分数[4]在林肺骨细胞。看到了Covid模块分数的显着上调ACE2 + / TMPRSS2 +细胞相比,ACE2 + / TMPRSS2-细胞(Mann-Whitney U-Test P = 5.1E-5)和ACE2 - / TMPRSS2 -细胞(Mann-Whitney U-test p=1.1E-14) (无花果。1A).与此一致,表达这些332个单个基因中的每一个的细胞百分比最高ACE2 + / TMPRSS2 +细胞(Mann-Whitney U测试P = 2.2E-16,ACE2 + / TMPRSS2 +和ACE2 + / TMPRSS2 -)和最低的ACE2-TMPRSS2-细胞(Mann-Whitney U测试P = 2.2E-16,ACE2 + / TMPRSS2 +与ACE2- / TMPRSS2-)(由于空间有限而未显示日期)。这些分析表明了这一点ACE2LAS中的表达与蛋白质产品相互作用的基因的表达相关,并且被假设以使病毒复制能够。
识别与上调共同调控的途径ACE2在林,我们进行了途径分析,比较了表达ACE2+和ACE2- LAM数据集中的上皮细胞。缺氧和il -6诱导的急性期反应通路在LAM中均上调ACE2+肺泡。IL-6途径的母体转录因子,STAT3,在LAM中表达上调ACE2+肺肺细胞,以及四种基因直接或间接调节STAT3:FGG,处于受控,生命值, 和HMOX1(无花果。1B.),建议IL-6可能正在推动这些效果。与此一致,与衍生健康细胞的间充质细胞相比,我们发现在林相关成纤维细胞中增加了IL-6(无花果。1B.),支持IL-6驱动器的概念ACE2表达。
ACE2是人类气道上皮细胞中的干扰素刺激基因[12.].我们使用涉及IFN-alpha /β信令的基因列表通过Jak / Stat(类型I)和干扰素γ(II型)信号传导途径(来自克拉敏分析的甲岩),与林肺相比,计算健康肺部的细胞类型特异性干扰素途径活动分数[4].在LAM肺中,I型和II型干扰素通路在自然杀伤细胞(NK)中均上调,但在T细胞、B细胞或巨噬细胞(无花果。1B.).在LAM NK细胞中,IFN通路的许多关键调控因子显著上调,包括INFG和Infgr1.(无花果。1B.).此外,与健康肺相比,在脉冲相关的NK细胞中升高干扰素γ表达(无花果。1B.).这些分析提示LAM NK细胞向肿瘤微环境分泌干扰素可能与IL-6协同上调ACE2LAM上皮细胞的表达(无花果。1B.).
mTORC1在LAM中过度活跃,促进蛋白质合成和细胞生长,被认为被SARS-CoV-2用于促进复制[13.].LARP1是mtor调控的翻译抑制因子,是Gordon鉴定的332种病毒相互作用蛋白之一et al。[11.]和appelberget al。发现SARS-CoV-2和mTOR/HIF-1信号之间的串扰[14.].因此,我们研究了雷帕霉素(一种变构mTORC1抑制剂)对原代细胞中这些通路中基因表达的影响TSC2在手术时获得的突变。血管肌脂肪症是良性肿瘤,与林共享常见的基因突变,发生在林中的一半女性。用20nm雷帕霉素或DMSO处理原发性培养物24小时并进行单细胞分析。为了克服单个细胞数据中膨胀的零的挑战,我们使用了魔术[15.]在每个细胞中施加基因表达。使用上述相同的途径基因列表(来自克拉敏分析的甲岩),我们观察到雷帕霉素治疗在下调I型和II型干扰素途径(Mann-Whitney U-Test P <2.2E-16时,所述雷帕霉素治疗具有重要作用(无花果。1C),包括许多干扰素刺激基因(例如IFIT,干扰素诱导蛋白质与四肽重复家庭)(Mann-Whitney U测试P <0.001对于所有基因)(无花果。1D).IL-6诱导富集的急性期反应基因富集ACE2+细胞也通过雷帕霉素处理下调(Mann-Whitney U-Test P <0.001)(无花果。1D).与sars - cov -2相互作用的332个宿主蛋白的表达也普遍表现出雷帕霉素处理下的下调(由于篇幅有限,数据未显示)。这些分析表明,mTORC1抑制可能通过减少促进ACE2表达的IFN和IL6途径在SARS-CoV-2中受益。
总之,我们观察到II型肺细胞表达百分比增加ACE2在Lam Lungs,与II型和II型干扰素途径相关的林肺相关,并增加白细胞介素6在lam相关的成纤维细胞中表达,表明这两种机制都促进了增加ACE2表达式。类似的mtorc1依赖机制可能有助于ACE2在其他设置中的表达式。作为模型系统的使用LAM的优点是脉冲内MTORC1的一致激活。虽然其他肿瘤通常具有升高的MTORC1活性,但它很少地作为单一定义遗传特征存在,使得确定这些类型的非细胞自主机构更加困难。MTORC1如何在肿瘤细胞内发出影响ACE2相邻上皮细胞中的表达将需要使用遗传定义的样本的额外单细胞数据集,以及MTORC1特异性扰动的小鼠模型。MTORC1信号传导的改变也可以存在于诸如IPF的非恶性疾病中。我们分析了四个IPF样本的已发布的单细胞数据集,并没有发现显着增加ACE2与健康供体相比,II型肺细胞的表达
值得注意的是,通过培养来自lam相关肿瘤血管平滑肌脂肪瘤的原代细胞,我们发现,雷帕霉素治疗下调了干扰素途径,也下调了一组之前确定的sars - cov2相互作用蛋白。从临床的角度来看ACE2 / TMPRSSLAM肺上皮细胞的表达表明,患有LAM的女性可能面临更高的严重COVID-19感染风险。尽管这里研究的所有LAM标本都来自代表晚期疾病的肺移植组织,由于我们的分析将mTORC1活性与ACE2和TMPRSS2的表达联系起来,我们推测在轻度疾病中也会如此。需要进一步的研究来证实这一点。对于雷帕霉素,IL-6和干扰素信号通路的下调表明,雷帕霉素治疗可能有利于限制病毒暴露后的初始感染和COVID-19向肺炎进展,无论是一般情况还是LAM女性患者。这对于已经服用雷帕霉素治疗LAM或其他疾病的患者尤为重要。需要进行进一步的分析,包括临床试验,以评估雷帕霉素对COVID-19两方面的潜在益处。
致谢
Y.T.是LAM基金会职业发展奖的受援人员,以及国防部结核硬化复合研究计划(W81XWH1910152-TS180029)的授予。我们还感谢Rothberg家族的支持。
脚注
作者捐款:y.t., D.J.K, E.P.H:设计研究。完成所有实验,分析数据,解释数据,撰写手稿。D.J.K和E.P.H:对数据进行了审核和评估,并对稿件进行了修改。所有作者阅读并批准了手稿。
支持声明:国会指导的医学研究项目;DOI:http://dx.doi.org/10.13039/100000090;授予:W81XWH1910152 - TS180029;林基金会;DOI:http://dx.do.org/10.13039/100005963;授予:LAM0142C01-20。
利益冲突:唐博士无需披露。
利益冲突:Kwiatkowski博士没有什么可透露的。
利益冲突:亨斯克博士没有什么可披露的。
- 已收到7月11日,2020年。
- 接受2020年10月4日。
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