摘要gydF4y2Ba
囊性纤维化(CF)肺病从婴儿期到成年期逐渐恶化。疾病驱动的早期CF气道液体代谢物的变化可能确定治疗靶点以抑制进展。gydF4y2Ba
年龄12 ~ 38个月的CF患者(n=24;24例中有3例后来被标记为CF筛查阳性,诊断不确定)接受胸部计算机断层扫描,采用帕斯-鹿特丹CF标注网格形态分析(PRAGMA-CF)方法进行评分,以量化总肺部疾病(PRAGMA-%Dis)和支气管扩张(PRAGMA-%Bx)等组成部分。采用高分辨率精确质量代谢组学方法测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中的小分子含量。髓过氧化物酶(MPO)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和活性测定法测定。gydF4y2Ba
PRAGMA-%Dis的增加由支气管扩张引起,并与气道中性粒细胞相关。PRAGMA-%与104个代谢组学特征无相关性(p<0.05, q<0.25)。最重要的注释特征是蛋氨酸亚砜(MetO),一种蛋氨酸被mpo衍生氧化剂氧化的产物。我们确认了MetO在BALF中的同一性,并使用参考校准来确认与PRAGMA-%Dis的相关性(Spearman's ρ=0.582, p=0.0029),并延伸到支气管扩张(PRAGMA-%Bx;ρ= 0.698,p = 1.5×10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba)、气道中性粒细胞(ρ=0.569, p=0.0046)和BALF MPO (ρ=0.803, p=3.9×10)gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
BALF MetO与早期CF的结构性肺损伤、气道中性粒细胞和MPO相关。蛋氨酸氧化是否直接导致早期CF肺部疾病,并探索这些发现指示的潜在治疗靶点,还需要进一步的研究。gydF4y2Ba
摘要gydF4y2Ba
识别与早期CF肺病相关的分子可能会导致限制进展的新方法。我们发现髓过氧化物酶产生的气道液蛋氨酸亚砜与1-3岁CF患者的肺部疾病有关。gydF4y2Bahttp://ow.ly/m0u630lnSx3gydF4y2Ba
简介gydF4y2Ba
囊性纤维化(CF)是一种多器官疾病,由影响CF跨膜电导调节(CFTR)阴离子通道蛋白表达、稳定性、调节和/或功能的基因突变引起。CF的特点是进行性支气管扩张导致呼吸衰竭,这是死亡的主要原因[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba].在儿童时期,CF气道表现为中性粒细胞炎症、感染和粘液纤毛清除受损[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba].炎症可能是肺部疾病发展的关键,因为它发病早,在常规病原体检测之前。的确,在一项针对幼年CF患儿的研究中,气道液中中性粒细胞弹性蛋白酶的存在是持续性支气管扩张发展的最强预测因子[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba].中性粒细胞释放的初级颗粒含有中性粒细胞弹性酶、髓过氧化物酶(MPO)等能够损伤气道黏膜的蛋白,是CF气道疾病发病的可能机制[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba].认识到CF炎症的最早发生和潜在机制是限制疾病进展的关键。gydF4y2Ba
气道黏膜液主要受上皮细胞调节,可在促进CF气道炎症中发挥重要作用[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].CFTR通过与其他蛋白质(如上皮钠通道)相互作用直接调节气道液体组成和体积[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba].当CFTR功能不足时,气道液体可能以促进疾病的方式发生变化,要么提供直接的促炎线索,要么损伤气道细胞[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba].传入的中性粒细胞,gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba强烈的代谢和效应活动,可能进一步改变CF气道液体。由于人体气道生理学的复杂性,无偏倚的方法,如非靶向代谢组学,可能有助于确定意想不到的生化变化驱动发病机制。gydF4y2Ba
灵敏的胸部计算机断层扫描(CT)技术已经开发用于检测CF患者的早期肺部疾病。其中一种方法,珀斯-鹿特丹注释网格形态测量分析(PRAGMA-CF),可以量化<6岁CF患者的支气管扩张、粘液堵塞、空气滞留和其他气道异常[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].肺显像可结合支气管肺泡灌洗(BAL)检查气道液体和细胞,以发现与结构性肺病的相关性。例如,BAL液(BALF)中的蛋白结合谷胱甘肽以前与支气管扩张的高风险有关[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba].非靶向分析已经确定了几十种候选代谢物生物标志物,用于检测CF肺病[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba].从生物标志物到病理机制的转变可能会导致新的治疗策略,以治疗CF早期肺部疾病。gydF4y2Ba
在这里,我们假设与疾病进展相关的早期CF BALF代谢产物应该与PRAGMA-CF相关。我们应用基于高分辨率精确质谱(MS)的代谢组学来确定前瞻性BAL和胸部CT的CF儿童的相关性。我们确认了最重要的代谢物(蛋氨酸亚砜(MetO))的身份,并定量了MPO,一种来自中性粒细胞的酶,能够通过产生强氧化剂产生MetO。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
研究设计gydF4y2Ba
该研究是CF患儿支气管肺泡灌洗液中炎症标志物(I-BALL)研究的一部分(gydF4y2BaClinicalTrials.govgydF4y2Ba标识符gydF4y2BaNCT02907788gydF4y2Ba).这是一项通过前瞻性收集BALF、外周血、胸部CT和临床随访数据,对新生儿筛查确定的CF婴儿进行转译、探索性和观察性研究。伊拉斯谟医学中心(荷兰鹿特丹)机构审查委员会批准了该研究(协议号NL49725.078.14),所有家长都签署了知情同意书。gydF4y2Ba
样品收集gydF4y2Ba
在入组后前瞻性地安排了支气管镜检查和CT检查,平均连续3天内进行。患者在全身麻醉下进行BAL手术前禁食一晚。从12-38个月的CF患者中采集了24个右中叶BAL样本。无菌生理盐水(1ml·kggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba体重)注入并回收三次,从第二和第三等分液中收集的研究样本放置在冰上≤2小时,然后通过330离心分离BALFgydF4y2BaggydF4y2Ba4°C保存5分钟,然后在- 80°C保存。第一个BAL样本用于临床病理,包括细菌培养和细胞计数。使用SOMATOM Force超高速扫描仪(Siemens Healthcare, Camberley, UK)在无麻醉的情况下进行自由呼吸胸部CT扫描。使用PRAGMA- cf对支气管扩张的百分比(PRAGMA-%Bx)和全肺疾病的百分比(PRAGMA-%Dis)进行定量评分[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].在评分时,CT扫描由一名不了解其他研究信息的观察者解释。Dis是由PRAGMA-%Bx、粘液堵塞和支气管壁增厚组成的复合物。附加的人口统计数据和调查结果也在后面gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
代谢组学gydF4y2Ba
以乙腈和内标1:2的混合物从BALF中提取代谢产物,在冰上进行30分钟,然后在16 000下涡旋和离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃保温10分钟。上清液保存在自动进样器中,保持在4°C并进行分析gydF4y2Ba通过gydF4y2BaQ型Exactive高场混合质谱仪(ThermoFisher, Waltham, MA, USA)。检测到的质量电荷比强度(gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba)特征提取采用apLCMS版本6.3.3 [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba],使用xMSanalyzer 2.0.8版本评估数据质量[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]及预过滤,详情见gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba.重要特征用METLIN进行标注[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba].标准参考物质(SRM) 1950(美国国家标准与技术研究所(NIST), Gaithersburg, MD, USA)作为质量控制和参考标准与BALF样品并行分析。gydF4y2Ba
MPO化验gydF4y2Ba
MPO的丰度和活性在一种适用于gydF4y2Ba查普曼gydF4y2Ba等gydF4y2Ba.[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba].简单地说,免疫捕获MPO,并分别用ELISA和Amplex Red氧化法测定其丰度和活性。测定定量下限为1.0 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(Amplex Red)和0.13 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(ELISA)均由三个独立的检测方法建立。gydF4y2Ba
额外的方法gydF4y2Ba
方法中给出了其他方法gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
代谢组学数据分析,包括日志gydF4y2Ba2gydF4y2Ba转换,分位数归一化,Pearson与p值计算的相关性和错误发现率调整的q值计算,使用内部R包(gydF4y2Bahttps://github.com/kuppal2/xmsPANDAgydF4y2Ba).由于电喷雾电离质谱固有的卷积(每种化合物可以观察到多个信号),我们选择q<0.25作为代谢组学结果的多重比较调整。使用MetaboAnalyst进行附加分析[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]和ggplot2 [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba].MPO测定采用SoftMax Pro 7.0.3版本校准(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)。Prism版本7 (GraphPad, La Jolla, CA, USA)用于计算Spearman相关性和Mann-Whitney U-test,并生成图形。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
患者特征及肺部疾病的CT诊断gydF4y2Ba
患者特征见gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba.50%的患者为F508del纯合子,除1人外,其他人携带至少一个等位基因副本。3个基因型为R117H-7T等位基因,汗液氯化物<60 mmol·LgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba重新指定为CF筛查阳性,诊断不确定(CFSPID;在条形图和散点图中以红色突出显示;汗氯24 ~ 55 mmol·L范围gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba].超过90%的患者在手术时使用抗生素,不到一半的患者在BAL培养中呈致病生物阳性。gydF4y2Ba
对1岁、2岁或3岁的CT扫描进行PRAGMA-CF分析。PRAGMA- cf分析发现大多数患者存在支气管扩张(PRAGMA-%Bx;0 ~ 3.74%),综合评分(PRAGMA-%Dis)为0.82% ~ 7.47%。临床变量,如性别、F508del纯合度和BAL培养阳性,对PRAGMA-%Dis没有显著影响,或者我们没有考虑这些变量,因为数据分布不均匀(gydF4y2Ba如gydF4y2Ba.胰腺功能不全)。gydF4y2Ba
代谢组学gydF4y2Ba
一份11 . 188gydF4y2Ba米/gydF4y2Ba最初从BALF样本中恢复z-by-保留期特征(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba),应用强度、技术精度和缺失值阈值,得到1798年的工作特征表。一个样本被确定有异常数量的缺失值,并从研究中删除(gydF4y2Ba补充图S1a及bgydF4y2Ba).然后记录数据gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-转换和分位数归一化前测试(gydF4y2Ba补充图S1cgydF4y2Ba).最终,190个特征在p<0.05时显著,其中104个特征通过q<0.25的多重比较调整阈值gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba).重要特征在METLIN中标注[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba然后进行同位素分析,我们分配了30个注释,与总共22种独特的代谢物相匹配(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba).在属于同一代谢物的多个离子的情况下,显示最高平均强度离子的数据。gydF4y2Ba
与MetO匹配的最重要的注释特性(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba).几种代谢产物对应于精氨酸代谢途径(包括精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和二乙酰精胺)或甘油磷脂和溶固体脂。其他包括石胆酸、葫芦巴碱和其他几种氨基酸。大多数与PRAGMA-%Dis呈正相关,但三种(磷脂酰胆碱42:6,磷脂酰乙醇胺酰基/醚32:0和石胆酸)呈负相关。12个不明特征,从gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba675 ~ 861和330 s共洗脱与PRAGMA-%Dis (gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba;R >0.6, p≤0.001),但这些没有产生合理的数据库匹配,也没有进一步评估。gydF4y2Ba
MetO的识别和基准校准gydF4y2Ba
我们试图确认MetO (gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba;代表性痕迹gydF4y2Ba补充图S2agydF4y2Ba).我们合成了同位素富集gydF4y2Ba13gydF4y2BaCgydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2BaN -gydF4y2BalgydF4y2Ba-MetO,并将其加入CF BALF和SRM 1950中,通过稳定同位素共洗脱和MS/MS鉴定MetO。自然发生的和同位素富集的MetO在同位素富集试剂中产生了相同的五个片段,其质量发生了适当的变化(gydF4y2Ba补充数字S2b和cgydF4y2Ba),证实了BALF和SRM 1950中MetO的二维结构(gydF4y2Ba补充图S2dgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
我们在SRM 1950中校准了MetO和蛋氨酸,以便对BALF样品进行参考校准,并计算MetO相对于MetO和蛋氨酸之和的百分比(%OxMet)。SRM 1950用20.68 μ M蛋氨酸(nist认证参考值的93%,22.3 μ M)和1.22 μ M MetO校准,对应5.6%的OxMet。MetO随后在BALF中进行参考校准,范围为24 ~ 1031 nM(平均±gydF4y2BasdgydF4y2Ba(174±240 nM),而OxMet %的范围为3.8% ~ 62.7%(平均±gydF4y2BasdgydF4y2Ba18.8±14.8%)。校准后,MetO与PRAGMA-%Dis使用非参数Spearman相关(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
CF BALF中MPO的定量研究gydF4y2Ba
MetO是由甲硫氨酸与mpo衍生氧化剂次氯酸(HOCl)和次溴酸(HOBr)反应产生的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].在BALF中检测到MPO,并表现出与中性粒细胞相同的免疫反应性(gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba).我们测定了MPO在CF BALF中的催化活性和蛋白质丰度,以评估其与PRAGMA-%Dis和MetO的潜在关系。MPO范围为0.0087 ~ 4.5µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2BaBALF(均数±gydF4y2BasdgydF4y2Ba0.90±1.17µg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba),只有一个CFSPID样本没有检出。MPO的分布是非正态的,而归一化后与蛋白质的分布相似(gydF4y2Ba补充图S4agydF4y2Ba).BALF MPO在以Amplex red为基础的过氧化物酶测定中是活性的,与ELISA结果相比,没有一个样品表现出低活性百分比(gydF4y2Ba补充图S4b和cgydF4y2Ba).BALF MPO与PRAGMA-%Dis (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba),以及MetO (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
MetO和MPO与支气管扩张及中性粒细胞的关系gydF4y2Ba
我们试图了解支气管扩张症(PRAGMA-%Bx)和气道中性粒细胞百分比对MetO、%OxMet和MPO的具体贡献。我们对这些变量进行了成对斯皮尔曼相关(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba).对于每个变量,包括气道中性粒细胞,PRAGMA-%Bx比PRAGMA-%Dis具有更强的相关性。观察到的两个自变量之间相关性最强的是%OxMet和MPO。gydF4y2Ba
关键相关性的稳健性gydF4y2Ba
为了确保关键相关性的稳健性,我们分析了一个患者子集,排除了cfspidl指定的3个样本和其他5个临床并发症使其无法在连续28天内完成BAL和CT手术的患者。去除8个样本后,MetO仍与PRAGMA-%Bx和MPO显著相关,但与PRAGMA-%Dis显著相关消失(gydF4y2Ba补充图S5gydF4y2Ba).由于子集相关的强度(ρ=0.4353)与原始的(ρ=0.5817)相当,功率的下降可能解释了缺乏显著性。MPO与PRAGMA-%Dis和PRAGMA-%Bx (gydF4y2Ba补充图S4d和egydF4y2Ba).gydF4y2Ba
全球的相关性gydF4y2Ba
为了比较MetO、MPO和PRAGMA-CF与临床变量的整体相关性,我们准备了一个Spearman相关矩阵(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba).我们考虑了BAL免疫细胞百分比、BALF总蛋白、患者年龄、汗液氯化物和抗生素疗程的次数。与PRAGMA-%Dis相关性最强的三个因子是巨噬细胞的MPO、MetO和BAL百分比(ρ=−0.5824,p=0.0036);中性粒细胞MPO、MetO和BAL百分比与PRAGMA-%Bx相关性最强。中性粒细胞BAL百分比与巨噬细胞BAL百分比呈强反比关系(ρ=−0.9683,p=3.9×10)gydF4y2Ba−14gydF4y2Ba).年龄、BALF蛋白与PRAGMA-%Dis、PRAGMA-%Bx呈正相关。嗜酸性粒细胞BAL百分比、淋巴细胞BAL百分比、汗液氯化物、近12个月抗生素疗程数与其他变量无相关性。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
综上所述,我们的结果与CF病理中早期出现的中性粒细胞内流、颗粒胞吐和分泌的MPO的氧化活性一致,特别是支气管扩张症gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba).中性粒细胞性炎症在CF肺病中的作用已被广泛认识,但其确切的发病机制尚不完全清楚。直接针对CF炎症的干预措施目前仅限于大剂量布洛芬,美国食品和药物管理局尚未批准专门针对气道中性粒细胞的治疗方法[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].如果在CF的早期阶段进行这种干预,可能是最有效和最持久的。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].目前尚不清楚CFTR调节剂将如何影响肺部炎症,这些药物还不能用于幼儿。gydF4y2Ba
本研究证明了MPO氧化蛋氨酸在早期CF肺病中的潜在重要性。气道MetO和%OxMet与MPO呈强相关,表明MPO与检测到的MetO有关。生物标志物研究表明,MPO确实在CF气道中产生HOCl和HOBr [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].具有不同反应性的不同氧化剂在气道中产生,可能有助于或损害宿主,HOCl和HOBr与持久的分子损伤有关[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba].这些氧化剂具有特殊的还原潜力,可迅速氧化蛋氨酸[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba],而较弱的氧化剂和受动力学约束的氧化剂,如低硫氰酸和过氧化氢(HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba),它们与蛋氨酸的反应要慢得多,因此它们对蛋氨酸的氧化的贡献gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba可能为零[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]gydF4y2Ba.gydF4y2Ba在该队列中观察到的MPO和%OxMet的强相关性支持了MPO在年轻时在CF气道中产生显著的HOCl和HOBr的观点。重要的是,不管H的来源如何,MPO都可以这样做gydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,生成gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba来自多种生理过程[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba].虽然吞噬细胞NADPH氧化酶2可能是中性粒细胞来源的HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba超氧化物),其他来源的HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba不应排除这种可能性。gydF4y2Ba
虽然MPO的影响在CF气道病理生理学中得到了很好的认识[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba],据我们所知,这项研究是MetO和%OxMet首次被确定为CF患儿支气管扩张和气道中性粒细胞的相关因素,这是我们使用无偏倚代谢组学方法发现的。值得注意的是,非目标质谱数据可能会导致多次比较的惩罚,最终过于保守,因为多个相互依赖的光谱可能来自样本中的单个化学物质[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba],从而更有可能出现第二类错误[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba].认识到这一点,我们对非目标质谱数据使用了q<0.25的适度多次比较阈值。然而,我们注意到,包括MetO在内的多种代谢物将超过更严格的阈值。尽管我们的数据表明蛋氨酸是对早期CF中性粒细胞增多和支气管扩张最敏感的气道代谢物之一,但还需要进一步的研究来验证蛋氨酸氧化在早期CF中的重要性。除了这些发现外,我们的研究证实了先前通过研究发现的CF BALF中%OxMet和MPO的关系gydF4y2BaDickerhofgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
为了使临床应用最大化,在未来的研究中,气道MetO和%OxMet测量应扩展到包括侵入性较小的样本,如呼气冷凝物(EBC)、痰液和气管吸入物。虽然我们预计痰液和气管吸入物将足够浓缩以进行强有力的代谢组学研究,但方法创新以提高稀释EBC样本的敏感性是必要的。幸运的是,MS已被证明可用于CF EBC代谢物检测[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba].根据最佳临床实践进行标准化采集也至关重要,特别是在早期儿科研究中,可重复的样本采集可能具有挑战性。gydF4y2Ba
MetO和%OxMet与支气管扩张的相关性与先前假设的CF中氧化还原失调和氧化应激一致。很多人强调CF气道中谷胱甘肽丰度降低和加速氧化[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31gydF4y2Ba].相反,我们发现胱氨酸(半胱氨酸的同二聚体二硫化物)与PRAGMA-%Dis呈正相关。由于样品没有经过处理以保存硫醇,因此结果可能表明了总半胱氨酸和胱氨酸池,而不仅仅是氧化形式。这表明谷胱甘肽和半胱氨酸可能支持呼吸道中不同的氧化还原信号通路,就像其他生理隔室一样[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba].在当前的研究中,我们没有检测到不可逆氧化的谷胱甘肽磺酰胺,这可能是由于方法上的差异和/或反映了它的低丰度,可能受到其严格反应的限制(3 mol HOCl或HOBr与1 mol谷胱甘肽反应)[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
MetO与早期CF支气管扩张的相关性可能是多种病理生理过程的结果。过度和持续的中性粒细胞转运与进行性气道损伤有关[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba],是HOCl/HOBr高效氧化蛋氨酸所必需的腔内MPO积累的必要前体。然而,中性粒细胞可分泌其他几种潜在的损害因子,MetO可代表多种途径的代理损害。例如,MPO的释放通常伴随着中性粒细胞弹性蛋白酶的释放[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba].然而,还需要进一步的实验来建立这些酶在早期CF中的关系。特别是,未来的研究将评估在患有CF的婴儿中是否容易测量依赖于mpo的MetO产生,而弹性蛋白酶活性可能不容易测量,这是由于气道抗蛋白酶屏障在疾病过程早期有效地平衡弹性蛋白酶[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
与MetO相反,它与PRAGMA-%Bx的相关性比PRAGMA-%Dis强,蛋氨酸则相反:它与PRAGMA-%Dis的相关性比PRAGMA-%Bx强(然而,两者的相关性都不如MetO强;数据未显示)。这种逆转可能反映了蛋氨酸与与MPO活性不直接相关的不同疾病过程的关联,如代谢物与中性粒细胞或蛋氨酸挽救途径大量进入气道腔内。通过全基因组关联和转录组研究表明,蛋氨酸挽救途径(蛋氨酸和腺嘌呤从多胺生物合成的副产物中回收)与CF肺功能恶化有关gydF4y2BaAMD1gydF4y2Ba(腺苷蛋氨酸脱羧酶1),gydF4y2BaMTAPgydF4y2Ba(甲基硫代腺苷磷酸化酶)和gydF4y2BaAPIPgydF4y2Ba(APAF1相互作用蛋白)[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba37gydF4y2Ba].气道蛋氨酸氧化可能促进这一途径的表达增加,在未来的研究中应考虑这种病理相声的可能性。还需要进一步的研究来确定蛋氨酸的稳态氧化还原电位在气道中积极维持的程度,包括MetO立体异构体的个体命运,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba蛋氨酸-gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba-亚砜和蛋氨酸-gydF4y2BaRgydF4y2Ba亚砜。这些被不同的酶还原为蛋氨酸[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba],尽管哺乳动物不编码有效的游离蛋氨酸-gydF4y2BaRgydF4y2Ba-亚砜还原酶[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
CF的炎症可在极早的年龄出现,由固有的上皮缺损引起[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba].最近一项针对18岁以下儿童的研究显示,大剂量布洛芬暴露患者的年肺功能下降率降低,长期生存率增加[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba].大剂量布洛芬的作用可能包括抑制中性粒细胞氧化爆发[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba],这反过来又会限制MPO生成HOCl和HOBr。许多化合物已被研究作为候选MPO抑制剂,包括2-硫杂anthines和对乙酰氨基酚[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba].这类药物可能在限制早期CF肺病方面有用,但这需要进一步的测试。直接针对HOCl等关键反应物种的其他干预措施也有可能限制低卤酸引起的气道疾病[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba47gydF4y2Ba].限制CF中氧化失衡的策略应考虑产生的氧化剂的种类及其各自的作用,因为氧化剂在宿主防御和氧化还原信号传导过程中起着不同的关键作用[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
我们纳入了3例R117H-7T突变患者,在初始入组后被指定为CFSPIDgydF4y2Ba通过gydF4y2Ba研究中的新生儿筛查。有趣的是,其中一名患者在胸部CT上表现出明显的炎症,MetO升高和PRAGMA-CF评分升高,尽管其突变被认为不是导致CF的原因。因此,PRAGMA-CF和BAL研究在识别CF中的肺部疾病过程中有用,似乎也适用于CFSPID。未来的研究可能会确定在其他方面健康的CFSPID和/或控制良好的CF患者中促进中性粒细胞性肺病的环境和遗传因素。gydF4y2Ba
总之,我们提供的数据证明了蛋氨酸氧化的重要性gydF4y2Ba通过gydF4y2BaMPO在早期CF气道疾病中的应用MetO、%OxMet和MPO与早期肺部疾病和支气管扩张的敏感指标PRAGMA-%Dis和PRAGMA-%Bx密切相关。我们最初的发现是通过无偏倚代谢组学方法得出的,并使用靶向分析进行了证实。MetO和MPO在早发性CF气道疾病的病理机制方面有待进一步研究,这可能会为治疗提供新的生物标志物和靶点。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
请注意:gydF4y2Ba补充材料不是编辑部编辑的,上传时是作者提供的。gydF4y2Ba
补充方法和文件细节gydF4y2Baerj - 01118 - 2018 - _supplementgydF4y2Ba
补充图S1。全球变化和数据分布分析。A)将25份CF BALF样本的HRMS分析的分析特征加载到MetaboAnalyst中(gydF4y2Bahttp: /gydF4y2Ba/www.metaboanalyst.ca/)进行主成分分析。样本25是一个异常值,与PC1和PC2上的其他BALF样本分开。还要注意BALF和血浆参考样品的预期分离(SRM 1950,内部QSTD),以及它们各自的聚类。从伊拉斯谟到埃默里的两批BALF(“BAL1”,“BAL2”)也被评估为可能的簇分离迹象(未观察到)。B)所有BALF样品中HRMS分析缺失值的计数。样本25的缺失值比所有样本的中值多20倍。我们的结论是25号样品不应进行分析。C)去除样品25和QC样品后,可视化BALF中代谢物的转化后分布,以确认非靶向Pearson相关分析的适用性。gydF4y2Baerj - 01118 - 2018 - _figure_s1gydF4y2Ba
补充图S2。与蛋氨酸亚砜质量准确匹配的确认。166.0533gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba在BALF和SRM 1950参比物中检测到保留时间为4.7 min,并与蛋氨酸亚砜(MetO) [M+H]加合物相匹配。A)天然存在MetO的全扫描离子色谱图。迹是一个有代表性的CF BALF样本的三个技术重复的平均值。B)混合CF BALF中天然存在MetO的30% HCD MS/MS谱。五个下降峰值gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba与MetO的预期碎裂相对应的是红色,以及分子离子。未分配光谱用蓝色表示。各自观测峰值gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba所记录的最大强度值如下(括号内为公式赋值):[M+H], 166.0535 ([CgydF4y2Ba5gydF4y2BaHgydF4y2Ba11gydF4y2Ba没有gydF4y2Ba3.gydF4y2BaS + H)gydF4y2Ba+gydF4y2Ba);1, 149.0264 (cgydF4y2Ba5gydF4y2BaHgydF4y2Ba9gydF4y2BaOgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba年代);2, 102.0552 (cgydF4y2Ba4gydF4y2BaHgydF4y2Ba8gydF4y2Ba没有gydF4y2Ba2gydF4y2Ba);3, 75.0267 (cgydF4y2Ba3.gydF4y2BaHgydF4y2Ba7gydF4y2Ba年代);4, 74.0240 (cgydF4y2Ba2gydF4y2BaHgydF4y2Ba4gydF4y2Ba没有gydF4y2Ba2gydF4y2Ba);5, 56.0499 (cgydF4y2Ba3.gydF4y2BaHgydF4y2Ba6gydF4y2BaN)。未分配的基峰(用*表示)在20%的强度下被切断,以便更好地可视化。C)混合BALF和SRM 1950血浆中meto指定的MS/MS光谱(1-5和[M+H])的相对强度。光谱的gydF4y2Ba13gydF4y2BaCgydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba分析了两种基质中的N-L-MetO内标(Istd)。Istd峰移位3 ~ 6amu,取决于反应。D) L-MetO的结构分配为166.0532gydF4y2Bam / zgydF4y2Ba基于准确的质量和保留时间匹配和质谱/质谱碎片。给出了峰1-4对应的反应。峰值5,需要两个中性损失,没有描绘。注意,两个手性中心(对应于D/L α碳和R/S氧硫)没有被分解。根据哺乳动物生物学规范,其身份被认为主要是L-MetO。gydF4y2Baerj - 01118 - 2018 - _figure_s2gydF4y2Ba
补充图S3。BALF与中性粒细胞MPO的Western blot比较。将1.7 μg总蛋白或指定量的hMPO标准品(EMD Millipore)经β -巯基乙醇还原后装入15 μL孔中,SDS-PAGE(4-20%凝胶)分离,用Trans-Blot Turbo (Bio-Rad)转移到PVDF膜上。MPO采用ELISA原代(1:10 00)和IRDye 680RD山羊抗兔(1:10 00;Li-Cor) 3.0强度(700nm滤波器;Li-Cor Odyssey成像仪)。观测到三个已知的波段(59、39、13.5 kDa)和一个额外的波段(23 kDa)。Pooled早期CF BALF,“B2+3”;来自健康献血者的中性粒细胞;PMNs1”和“B.PMNs2”。gydF4y2Baerj - 01118 - 2018 - _figure_s3gydF4y2Ba
补充图S4。早期CF BALF中髓过氧化物酶的特异性活性。A)用BALF总蛋白归一化MPO数据产生的分布与体积归一化结果相似(两者都是非正态的)。由于BALF蛋白与炎性渗出液混淆,我们选择不使用蛋白归一化数据。B) Wilcoxon配对符号秩检验样本内定量差异显著。Amplex Red - ELISA法检测两种方法的平均浓度差为0.54 μg/mL。*表示p<0.05。C) Amplex Red法定量MPO的结果除以ELISA结果,再乘以100,得到估计的MPO活性百分比。的意思是,133±52%。CFSPID样本用红色表示。gydF4y2Baerj - 01118 - 2018 - _figure_s4gydF4y2Ba
补充图S5。MetO、MPO和PRAGMA-CF相关性的子集分析。CT和BAL间隔4周的>样本和CFSPID样本被从分析中移除,以确定观察到的相关性是否稳健。分析了MetO与PRAGMA-%Dis (A)、PRAGMA-%Bx (B)和MPO (C)的Spearman相关性。还分析了MPO与PRAGMA-%Dis (D)和PRAGMA-%Bx (E)的相关性。在每个散点图中插入相关结果(rho估计值、ρ和p值)。gydF4y2Baerj - 01118 - 2018 - _figure_s5gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢患者及其家属同意参与这项研究。我们感谢研究协调员E. Nieuwhof, E. van der Wiel和B. Manai (Erasmus MC-Sophia,鹿特丹,荷兰)在招募患者方面的支持。我们感谢M.W.H. Pijnenburg, J.C. de Jongste, L. Duijts, S. Kloosterman和I.M. de Kleer (Erasmus MC-Sophia,鹿特丹,荷兰)进行支气管镜检查。我们感谢M. Kemner (Erasmus MC-Sophia,鹿特丹,荷兰)对PRAGMA-CF评分的指导。我们感谢Nina Dickerhof(奥塔哥大学,克赖斯特彻奇,新西兰)关于MPO检测方法的深刻技术讨论。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这篇文章有补充资料可从gydF4y2Bawww.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
作者贡献:实验概念和设计:R. Tirouvanziam, H.M. Janssens, B.J. Scholte和J.D. Chandler。进行实验:J.D. Chandler, H. Horati, C. Margaroli, M.B. Kilgore和M. Veltman。解释结果并提供重要支持:J.D. Chandler, H. Horati, C. Margaroli, M.B. Kilgore, H.K. Liu, B.J. Scholte, H.A.W.M. Tiddens, A.J. Taurone, L. Peng, L. Guglani, K. Uppal, y . m。去吧,h。m。詹森,d。p。琼斯和r。蒂鲁万齐亚姆。准备稿:J.D.钱德勒。审定或编辑审定稿件:所有作者。gydF4y2Ba
利益冲突:J.D.钱德勒报告了来自NIH和囊性纤维化基金会的资助,在提交的工作之外。gydF4y2Ba
利益冲突:C. Margaroli报告了NIH (R01HL126603)和CF@LANTA RDP Fellowship在研究期间的资助。gydF4y2Ba
利益冲突:H. Horati报告来自NIH的拨款,在提交的工作之外。gydF4y2Ba
利益冲突:M.B. Kilgore没有什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:维尔特曼先生没什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:H.K. Liu没有什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:a·j·托隆没有什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:L. Peng报告来自NIH的资助,在提交的工作之外。gydF4y2Ba
利益冲突:L.古格拉尼没有什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:K. upppal没有什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:Y-M。围棋没有什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:H.A.W.M. Tiddens参加了罗氏公司囊性纤维化治疗的行业研讨会,为诺华公司和吉利德公司做讲座和顾问委员会工作,获得了CFF和Chiesi的资助,并在提交的工作之外获得了Vertex公司的资助并从事了顾问委员会的工作;此外,H.A.W.M. Tiddens拥有Vectura专利授权和PRAGMA-CF专利评分系统,是Erasmus MC-Sophia儿童医院肺部分析核心实验室的负责人。gydF4y2Ba
利益冲突:B.J. Scholte在研究进行期间报告了ERARE (INSTINCT)、ZonMw(43000035)和NIH (1R01HL126603-01)的资助;之前的一项描述CF突变小鼠S1P代谢的研究部分由美国德克萨斯州Woodlands的Lexicon Pharmaceuticals公司的研究基金和化合物(S1P裂解酶抑制剂)资助。MTA授予Erasmus MC无条件的出版权。gydF4y2Ba
利益冲突:R. Tirouvanziam报告了NIH在研究期间的资助(R01HL126603和R01HL126603- 02s1);和个人费用(作为科学顾问委员会成员)从Celtaxsys, Inc.提交的工作之外。gydF4y2Ba
利益冲突,d·p·琼斯没什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:H.M. Janssens在研究期间报告了来自NIH和荷兰CF基金会的资助;并从Vertex公司获得了演讲费(支付给索菲亚研究办公室),以及索菲亚基金会在提交工作之外的研究资助。gydF4y2Ba
支持声明:由NHLBI F32 HL132493 (J.D. Chandler)支持;埃默里儿童CF和呼吸道疾病研究中心启动基金(J.D. Chandler和M.B. Kilgore);CFF P30 MCCART15R0 (C. Margaroli);NHLBI R01 HL126603和代谢组学共同基金补充HL126603- 02s1 (R. Tirouvanziam, A.J. Taurone, L. Peng, H. Horati, H.M. Janssens, B.J. Scholte和M. Veltman);荷兰囊性纤维化基金会(NCFS)资助HIT-CF 1和2 (H. Horati, M. Veltman, B.J. Scholte, H.A.W.M. Tiddens和H.M. Janssens);稀有的本能(M. Veltman和B.J. Scholte);和P30 ES019776, S10 OD018006和R01 ES023485(刘洪凯,K. Uppal, Y-M.)。去找D.P.琼斯)。本文的资助信息已存入gydF4y2Ba交叉参考基金注册gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2018年6月14日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2018年8月9日。gydF4y2Ba
- 版权所有©ERS 2018gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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