文摘
Forskolin-induced肿胀(FIS)患者的肠道瀑样囊性纤维化(CF)囊性纤维化跨膜电导调节的措施功能(雌性生殖道,CF的蛋白质突变。
我们调查FIS是否符合临床结果雌性生殖道函数的参数和生物标志物在34个婴儿被诊断为CF和FIS的关系进行了研究。对肺和胃肠道疾病的指标。
FIS较低的儿童有更高水平的免疫反应性的胰蛋白酶原(p = 0.030)和pancreatitis-associated蛋白(p = 0.039),经常有胰腺功能不全(p < 0.001),有更多的异常在胸部计算机断层扫描(p = 0.049),和z分数较低的最大呼气流量功能余气量(p = 0.033)相比,儿童FIS高值。金融中间人与汗水氯浓度显著相关(SCC)和肠道电流测量(ICM) (r =−0.82和r = 0.70,分别;p < 0.001)。个人评估的鳞状细胞癌,ICM和FIS建议金融中间人可以帮助个体疾病严重程度进行分类。
因此,分层FIS确认子组在肺和胃肠道的结果参数不同。FIS肠道与建立CFTR-dependent瀑样相关生物标志物如鳞状细胞癌和ICM,和充分执行在这个概念验证研究的集团和个人层面。
文摘
培育mini-guts通知个人囊胞性纤维症患儿的疾病特征http://ow.ly/J19W30ldzTH
介绍
在体外测试使用文化可持续生活的病人组织从生物银行可能会提供一个便于患者使用和具有成本效益的替代方案在活的有机体内检测在临床护理设置。识别LGR5就(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled受体5)作为干细胞标记建立了干细胞为基础的瀑样存储这样的组织文化和生活起生物(1- - - - - -4]。这些资源的价值对个人临床护理尚不清楚直接的研究比较在体外结果从这些stem-cell-derived文化与个体临床特点是缺乏。
我们这里研究肠道瀑样文化是否可以用来通知个人患有囊性纤维化的疾病特征(CF),一个无性生殖的缩短罕见疾病的突变引起的囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)基因5- - - - - -7]。肠道瀑样是在体外培养多细胞,模拟的三维上皮结构在活的有机体内肠上皮细胞,包括干细胞自我更新,multi-lineage分化和细胞极性,可以存储在一个活的生物2,8]。我们最近开发了一个分析使用肠道瀑样CFTR量化检测功能(9]。雌性生殖道蛋白功能作为离子通道在许多粘膜表面,离子和液体内稳态的关键调节器(10]。雌性生殖道的激活forskolin诱发腔的液体分泌和瀑样的迅速肿胀、缺失或强烈减弱在瀑样与CF主题。当前数据表明forskolin-induced肿胀(FIS)是一个CFTR-dependent读出,使一种快速、健壮和精确的雌性生殖道剩余函数的输入在体外正如前面演示(9,11]。
CF是一个逐步积累多器官功能障碍的特点是肺和胃肠道的粘稠的粘液,导致细菌感染,慢性炎症和营养不良。高度的可变性在器官功能障碍与CF和生存之间存在对象,可以由变化引起的雌性生殖道基因本身,因为超过2000雌性生殖道变异在囊性纤维化突变已报告数据库(wwwcftr .genet.sickkids.on.ca /检测/应用程序),以及额外的遗传和环境因素(12]。因此,临床医生面临巨大困难时预测个体病人的临床病程在雌性生殖道基因型的基础上,特别是对受试者携带罕见的雌性生殖道变体(13]。雌性生殖道的临床和功能翻译(CFTR2)项目(www.CFTR2.org)旨在提供CFTR功能和临床信息检测突变。
CFTR个体生物标志物的检测诊断的功能发挥重要作用CF或其他CFTR-related疾病(14]。在活的有机体内汗水氯浓度(SCC)测量和肠道电流测量(ICM)体外CFTR直肠活检建立诊断的生物标志物的检测功能。这些生物标志物在临床研究验证,导致阈值对CF诊断和疾病严重程度分类。这些研究表明,残余雌性生殖道功能关联雌性生殖道基因型与疾病严重程度(在集团层面13,15- - - - - -25]。然而,这些生物标记物也与相当多的技术和non-CFTR-dependent生物变异有关,这可能会限制他们的能力精确评估单个雌性生殖道功能,因此可以降低他们的能力单独通知对疾病严重程度(20.,26- - - - - -28]。
金融中间人提供了一个敏感和准确测定单个雌性生殖道功能也是一种文化相关的偏见,和迄今为止从未被评估在临床环境中CF疾病表现。本研究的目的是在肠道瀑样定义金融中间人之间的关系和临床结果参数在连续的新诊断婴儿CF。我们也比较有FIS瀑样与鳞状细胞癌和ICM和他们如何通知临床结果参数在个体水平。
材料和方法
CF确认通过新生儿筛查和治疗患儿CF诊所或“乌得勒支大学医学中心的伊拉斯谟医学中心的鹿特丹(荷兰)参加一个标准化的监控协议,改编自澳大利亚的协议呼吸囊性纤维化的早期监测团队(AREST-CF) [29日,30.]。新生儿筛查CF的荷兰协议包括测量免疫反应性的胰蛋白酶原(红外热成像)和pancreatitis-associated蛋白质(PAP)在针刺足跟血31日]。监控协议包括鳞状细胞癌基因分型结果测试和雌性生殖道出生后,和细菌性呼吸道文化在每一个普通门诊访问。1年的年龄,做了全身麻醉的病人胸部计算机断层扫描(CT)扫描,支气管镜检查收集的支气管肺泡灌洗(BAL)流体和直肠吸活检对ICM和瀑样的文化。病人从鹿特丹也表现婴儿肺功能测试(ILFT)。监控协议的详细描述,请参阅辅料S1。乌得勒支大学医学中心的伦理委员会和鹿特丹伊拉兹马斯医学中心批准使用其他材料的直肠活检瀑样的文化和临床数据的使用。知情同意是来自所有参与的受试者的父母或看护人。
测量SCC根据标准操作程序进行的欧洲社会囊性纤维化的临床试验网络(ECFS-CTN)和乌特勒支和鹿特丹都认证中心执行汗水测试(18,32]。ILFT、胸部CT、支气管镜检查和平衡进行按照标准化程序(33- - - - - -35]。ILFT,测量强迫过期使用快速thoraco-abdominal压缩技术和通货紧缩技术。对于CT过程,明白了辅料S2。疾病严重呼吸道疾病(%)在随机顺序,失明病人标识符使用Perth-Rotterdam注释了网格的形态学分析CF (PRAGMA-CF) CT评分法。%疾病反映肺总量的百分比显示支气管扩张、支气管增厚或粘液堵塞(36]。支气管镜检查是在全身麻醉下进行。落下帷幕了1毫升·公斤3整除−1氯化钠0.9%正确的中间叶在受影响最严重的叶和一个整除。icm在直肠活检是使用标准化的协议19,37)(详细描述,请参阅辅料S3)。累积碳酰胆碱,forskolin和组胺用于分析。
代肠道瀑样方法和测量FIS略改编自协议前面描述的9,11,38]。额外的细节提供了这些方法辅料S4。
不同分析师汗水测试执行,icm和FIS化验,分析师蒙蔽了CFTR其他生物标志物的检测功能和的结果在活的有机体内观察。
从病人的文件收集临床资料回顾性从生命的第一年,从目前的诊断新生儿筛查。
统计分析
首先,描述性统计的临床参数用来描述研究人口。然后我们评估是否研究人群可分为不同的亚种群基于FIS结果forskolin浓度。为此,FIS结果转化为获取标准正态分布,然后凝结的分层病房与欧几里得距离聚类是使用。我们确定集群的数量显然在30种不同的数据基于多数票集群指数(39),然后评估FIS的结果在一个forskolin浓度是否能识别结果FIS病人集群。
然后我们确定FIS病人集群之间的临床参数相比,报告中位数和四分位范围和执行Mann-Whitney U-tests非正态分布的连续数据,对正态分布均值和标准差和执行t连续数据,并与费舍尔的确切数字和百分比分类数据的测试。同样,临床参数据鳞状细胞癌患者组之间比较,建立了生物标志物的阈值。
我们还直接比较了连续FIS结果与连续使用散点图、鳞状细胞癌和ICM结果估算皮尔逊相关系数和使用线性回归。
R 3.2.1 Mac (R项目;www.r-project.org)是用于分析和假定值都是基于双边测试报告。
结果
2011年5月到2015年1月,34个新生儿被录取。表1显示了研究人群的临床特点在生命的第一年。icm是可以从对象从鹿特丹(n = 23),但是无法确定病人从乌得勒支因为技术原因。所有可用的值和技术上可靠的ICM所示的反应辅料S5。
Forskolin瀑样存在剂量依赖的相关性引起的肿胀的病人——和CFTR-genotype-dependent时尚(图1和2)。总的来说,1552年我们测量数据点和审查9分,这些都是合格的,极端异常值(> 6所示sd不同的实验复制)的平均值。只有forskolin浓度≥0.128µM诱导明显瀑样肿胀、最大µM 5点。基于FIS值聚类分析所有forskolin浓度从0.128到5µM强劲确定两个不同的组(高FIS n = 9,低FIS n = 25;图3)。这两组也可以准确地确定图1在forskolin浓度≥0.8µM曲线下面积(AUC)阈值为1000。
组间临床参数比较高与低FIS (表2)。较低的受试者FIS (FIS < 1000 AUC 0.8µM forskolin)相比,高FIS有更高的红外热成像(160与µg·123毫升−1;p = 0.030)和PAP浓度(5.9与3.0µg·毫升−1;p = 0.039),更频繁的胰腺功能不全(19 25与两个九个病人;p < 0.001),高PRAGMA-CF CT分数%疾病(3.6与1.8;p = 0.049)和较低的z得分为最大呼气流量功能余气量(−1.9与−0.2;p = 0.033)。这些数据表明,FIS的一个重要指标相关临床参数在生命的第一年。
0.8µM forskolin, FIS的瀑样个别病人与配对显著相关在活的有机体内鳞状细胞癌(r =−0.82, 95%可信区间0.91 - 0.68−−;p = 1.97×10−9;图4一)和体外ICM (r = 0.70 (95% CI 0.41 - -0.86;p = 1.93×10−4;图4 b)。我们从这得出FIS值明显与当前临床建立在活的有机体内和体外CFTR-dependent生物标志物。
我们下一个比较组间临床参数和高与低价值的金融中间人和鳞状细胞癌(表2)。我们没有比较ICM值与临床参数显著降低数量的观察可能引入一个偏见的解释。划分组与高、低SCC CF的严重或温和的表型值,我们使用60公认SCC边缘型更易·L−1(18,40,41]。鳞状细胞癌患者高值(> 60更易·L−1)在低鳞状细胞癌患者相比,值浓度更高的红外热成像(160与µg·109毫升−1;p = 0.012),更频繁的胰腺功能不全(20 26与8位患者中的一个;p < 0.001),高PRAGMA-CF CT分数%疾病(3.7与1.3;p = 0.007)。发现的子组高或低FIS或鳞状细胞癌值由三个不同个体(数字13、26和27)在这个队列。总之,FIS-based子组与5个9个研究临床终端在生命的第一年,相比三SCC-based子组。
这些组的关联与临床疾病严重程度表明,FIS可能有额外的价值解释个体的临床疾病。我们比较个人的措施FIS、鳞状细胞癌和ICM CFTR区分低或高残留检测功能(FIS)或轻微或严重CF表型(SCC和ICM使用60更易·L−1和10µA·厘米−2随着阈值,分别)[19]。FIS的显示了一个明确的两个分布数据(图5一个),相比更逐渐分散SCC和ICM(值图5 b和c)。一般来说,低FIS值与鳞状细胞癌> 60更易·L−1和ICM值< 10µA·厘米−2观察,但也有一些差异。例如,个人数字4,临床上严重的表型(抗生素预防胰腺功能不全,需要6个月的年龄之前),显示低FIS和相应SCC值高,不料ICM价值非常高。个人与一个非常低的FIS 13号(病人)类型与一个中间鳞状细胞癌和低ICM。临床数据对这个人提出了一个基于雌性生殖道严重疾病表型的基因型(根据CFTR2),胰腺功能不全(粪便弹性蛋白酶< 15µg·g−1),需要八个抗生素治疗,因为肺部症状的第一年的生活。另外两个人与鳞状细胞癌> 60更易·L−1(26和27)显示高FIS水平(第27号的ICM也很高,而不是用于数字26)。这些主题也表现出温和的表现型说明了胰腺充分性(粪便弹性蛋白酶> 500µg·g−1)个人和几乎没有肺部症状。总之,数据表明,FIS可能附加价值来评估个体疾病特点SCC和ICM旁边。
讨论
本研究调查的性能在体外生物标志物在临床培养成人干细胞识别不同的子组与CF一岁的孩子。我们发现,分层FIS的肠道瀑样确定子组在肺和胃肠道临床结果参数不同。FIS相关与目前建立CFTR-dependent生物标志物如鳞状细胞癌和ICM,和充分执行集团和个人层面通知有关肺和胃肠道疾病表型。FIS测量集成的影响雌性生殖道突变和其他特定的修饰符CFTR基因表达肠道细胞培养行动检测功能。很可能CFTR FIS的强烈依赖性检测以及最优由于重复测量灵敏度和精度,使个人估计准确在活的有机体内雌性生殖道剩余函数,从而促进连锁疾病特征。
我们的聚类分析基于FIS forskolin浓度的值> 0.128µM令人信服地将这群连续的婴儿CF患者分成两个独立的团体。FIS 0.8µM forskolin精确识别这两个集群,因此它似乎足以衡量FIS值少forskolin CFTR输入检测残留浓度的功能。令人印象深刻的是,FIS数据的聚类分析的只有少数的主题产生了截然不同的子组,显然是与临床相关疾病严重程度指标,本质上产生类似的数据队列时用SCC-based标准分为子组先前建立在更大规模的研究40,41]。
这个研究最重要的发现是雌性生殖道功能以FIS已经证明是一种衡量指标的相关临床参数(表2)。CF疾病是由雌性生殖道突变,其他修饰基因和环境因素,以及这些变量的影响与特定疾病表现和年龄的变化。而雌性生殖道功能是胰腺外分泌功能障碍的主要决定因素12),和雌性生殖道功能测量高度信息,气道阻塞和肺部感染的变化强烈修改其他遗传修饰符和环境因素12]。通过专注于婴幼儿早期疾病的特点,我们可能会更直接相关的临床表型研究雌性生殖道功能障碍,环境的侮辱是有限的老年受试者相比。研究在不同的年龄段需要研究雌性生殖道功能如何测量FIS仍与临床表型相关,可能会导致更好的理解的影响雌性生殖道剩余功能和non-CFTR-dependent通路对进步的疾病特点。
确切FIS阈值区分临床相关的差异在雌性生殖道剩余功能仍有待在后续研究决定。分布的鳞状细胞癌组与更严重的疾病的数据显示,鳞状细胞癌组的平均值(106更易·L−12.5)隔开sd从60更易·L−1阈值,符合公布的数据(13]。相应的组被FIS具有更严重的疾病显示平均的68.3 AUC膨胀单元,由11.3sd单位从1000年定义的AUC阈值。数据组的分布与温和的疾病表现出相似的分布和相对于阈值用于鳞状细胞癌和FIS (SCC的均值37.4更易·L−1和1.5sd到60更易·L−1;FIS意味着2702年的AUC和1.7sd1000 AUC)。这表明一个进一步细化的雌性生殖道剩余函数可能FIS,可能扩大当前分类的雌性生殖道突变具有显著的残余no-to-minimal与否对一个系统函数,低或高剩余函数是认可的。
ICM,我们使用了验证Rotterdam-Hannover协议和引用值(> 10µA·厘米−2),定义患者胰腺充分性之间的差异和不足,如前面发表(19]。ICM协议可以在实验室之间有所不同类型的美国商会灌注(或循环)或药理操纵的活组织检查17,19,20.,23,24]。这些研究普遍发现在CF ICM和临床表型之间的关系,主要是在诊断和胰腺充分性。ICM的新欧洲标准操作程序还处于开发阶段,所以阈值用于ICM在这项研究未来可能在不同的地点和不同阈值对新标准的操作程序。瀑样技术是小说和依赖于许多(国产)媒体因素,瀑样所需额外的多中心验证,研究站点再现性和阈值的一致性。这项研究目的不是比较的性能三个CFTR-dependent预测个体的临床疾病的生物标记物,但作为一个观察研究表明金融中间人之间的关系和临床观察与CF儿童。在大多数情况下,雌性生殖道的三个生物标记函数在个体水平对齐类型个人典型或严重的CF或温和形式的CF。有趣的是,FIS似乎结合个人临床表型和基因型的一般疾病责任在CFTR2 ICM和鳞状细胞癌不一致(病人2、4、13、17、27)。必须指出个人2和17只显示水平略高于这里使用的ICM阈值,表明在ICM阈值略有增加可能有更好的合格的病人在当前的研究中。问题13显示55更易·L−1氯浓度接近60更易·L−1鳞状细胞癌的阈值,不符合ICM, FIS,基因型(F508del纯合)和临床表型。很可能SCC对主题重复测量13日将导致重新分类的病人(SCC > 60更易·L−1)。这样重复措施也可能导致低SCC价值主体12(160更易·L−1),这似乎超出人类生理极限,公布的数据27]。就目前而言,我们的数据表明,FIS的上下文中出现信息对个人疾病分类边界SCC和ICM或鳞状细胞癌和ICM不同意,但是仍需要进一步验证在更大群病人。
ICM的雌性生殖道功能提供快速和敏感测量新鲜分离原生组织CF患者,于一体的CFTR个人检测基因型和其他基因影响离子运输,以及环境因素如雌性生殖道调节器,可以影响雌性生殖道功能(42,43]。病人4和12,我们观察到相对较高的ICM反应出现不符合雌性生殖道的临床表型和其他生物标记和很大程度上超过了值函数中发现的其他婴儿纯合子F508del(见原来的轮廓辅料S6)。使用老年病人组研究中,如此高的icm没有报道使用灌注系统(44- - - - - -46在病人身上,很少使用再循环我们室(47]。意料之外的高响应ICM两患者样本可能年龄相关,或由于环境影响肠道组织饮食或炎症等组件。特定的机制,控制F508del蛋白质成熟和顶端贩卖,不维护瀑样的文化,也可以贡献(46),因为可能营地/ Ca的影响2 +刺激信号通路在氯化non-CFTR频道(48]。作为crypt-based瀑样培养条件丰富干细胞分泌上皮车厢的肠道上皮细胞,而不是整个肠道上皮细胞,ICM-based观察可能造成电流诱发肠道细胞减少的瀑样的文化,如杯状细胞(49]。显然,额外调查超出了本研究的范围需要理解这些有趣的发现。
本研究的局限性包括一个相对较小的病人队列和有限的临床随访时间。此外,相对较高的ICM值人失踪。此外,瀑样肿胀是高度依赖于雌性生殖道,但并不是一个直接读出雌性生殖道功能;它依赖于耦合CFTR-dependent离子传输流体运输。虽然分析相对简单和健壮的比其他在体外读数,表示1552年9个技术辍学测量,瀑样测量需要相当大的当地专业知识和昂贵的设备。此外,不同瀑样化验条件用于研究雌性生殖道CFTR功能与野生型检测(11]。非常低的雌性生殖道剩余函数的准确打字也需要不同的实验装置相比,我们这里使用的协议,如。通过长时间刺激forskolin或测量腔的体积增加50]。最重要的是,这对预测生物标志物的有效性的长期效果还有待证实。
CFTR FIS还提供额外的优势其他生物标志物的检测功能。直肠活检可以运送到专门的中心集权化和标准化的分析。FIS还可以测量响应CFTR-modulating疗法在预处理的一项研究中,这是特别相关的主题和罕见的或未知的雌性生殖道基因型或可疑疾病(11]。患者早期指标的风险严重的长期结果可能有助于决定何时开始CFTR-modulating疗法。几个案例研究表明体外和在活的有机体内反应CFTR-regulating疗法明显相关(11,43,51,52),这表明FIS试验可以扮演一个角色在决定药物治疗的时机和有效性都在个别病人。此外,肠道瀑样可以用在雌性生殖道调制器的临床前阶段发展(53测量后,残余雌性生殖道CFTR功能和反应检测调节器,细胞可以为未来生物分析无需进一步采样和病人不适(54]。
总之,分层FIS的肠道瀑样确定子组在肺和胃肠道临床结果参数不同。FIS相关与当前建立CFTR-dependent生物标志物SCC和ICM。FIS似乎是有用的在鳞状细胞癌和ICM值是有问题的,而不是在注册表赞同CFTR临床表型或检测基因型数据(CFTR2)。在这个研究结果支持了这样的观点,即金融中间人在肠道瀑样CF疾病严重程度的临床相关的生物标志物,并表明patient-derived干细胞资源可以有价值对个人疾病类型在临床护理。
补充材料
补充材料
请注意:补充材料并不是由编辑部,编辑和上传已由作者提供。
S1。监控协议后积极的新生儿筛查CFerj - 02529 - 2017 - _supplement_s1
S2。CT过程erj - 02529 - 2017 - _supplement_s2
S3。肠道电流测量erj - 02529 - 2017 - _supplement_s3
S4。瀑样文化从直肠活检和forskolin-induced肿胀试验erj - 02529 - 2017 - _supplement_s4
S5。概述和ICM的氯化物分泌反应来衡量erj - 02529 - 2017 - _supplement_s5
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
利益冲突:J.M.现场报道一项授权专利,数量CA2859614 A1,快速定量分析方法来衡量雌性生殖道功能主要肠道文化模式。
利益冲突:参考Dekkers报告授权专利,数量CA2859614 A1,快速定量分析方法来衡量雌性生殖道功能主要肠道文化模式。
利益冲突:r·弗里斯报告支持从CZ顶点为药物筛选和诊断的发展,在提交工作。
利益冲突:H.A.W.M. Tiddens报告费用/赠款从罗氏的行业研讨会在CF的治疗,诺华的讲座和咨询委员会,从CFF肺分析,从顶点肺分析和顾问委员会,从基列讲座和咨询委员会,从基耶西的研究者发起的试验,提交之外的所有工作。他还报告了一个许可专利与DNase Vectura特定目标相结合,和一个发布PRAGMA-CF评分系统的专利。他领导的伊拉斯谟医学中心/索菲娅儿童医院核心实验室肺分析。
利益冲突:K.M. de Winter-de Groot没有披露。
没有披露利益冲突:莫莱森詹森。
利益冲突:R.T. van Uum没有披露。
利益冲突:g . Berkers没有披露。
利益冲突:a . Vonk没有披露。
利益冲突:大肠Kruisselbrink没有披露。
利益冲突:h . Oppelaar没有披露。
利益冲突:h .聪明没有披露。
利益冲突:R.H.J. Houwen没有披露。
利益冲突:J.C.埃舍尔没有披露。
利益冲突:信号发生器伊莱亚斯没有披露。
利益冲突:H.R.·德容没有披露。
利益冲突:Y.B. de Rijke没有披露。
利益冲突:C.K. van der Ent没有披露。
支持声明:资金是来自荷兰的囊性纤维化基金会(Nederlandse囊性纤维化左;HIT-CF计划)。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2017年12月6日。
- 接受2018年7月20日。
- 版权©2018人队