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我们比较候选人T-cell-based结核病生物标志物和发现HLA-DR Mtb-specific t细胞作为优先级标记http://ow.ly/TyHa30iwVbL
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肺结核(TB)的诊断疾病,全球感染造成死亡的最常见原因(1),取决于直接检测结核分枝杆菌从痰标本,一般。然而,多达半数的结核病患者病原学上确定的证明没有长时间的排痰性咳嗽(2),需要产生痰。应对这一挑战,调查人员已经确定了候选人blood-based主机结核病生物标志物的诊断,基于结核分枝杆菌特殊记忆t细胞表型,激活或细胞因子表达谱(3- - - - - -9]。等生物标志物也表明潜在代理人监控结核病治疗反应(3,10]。在这里,我们旨在:1)比较几个blood-based t细胞生物标志物的诊断性能在结核病患者和控制;2)确定这些生物标记物提高诊断性能的组合;3)确定所需的最小数量的流式细胞仪参数区分活动性结核病患者与潜在的人结核分枝杆菌感染(LTBI);和4)翻译测量这些生物标志物的外周血单核细胞全血,使一个简化的应用领域的研究。
我们招收25与LTBI健康成人,由QuantiFERON-TB黄金管试验(QFT;试剂盒、希尔登,德国)和25阴性成人结核病(XpertMTB / RIF +)(美国造父变星,桑尼维尔CA)在南非地区结核病的流行。血液收集治疗开始前与活动性结核病人,12 - 18个月后,当他们被宣布治愈后(n = 19)。控制,血液也在12 - 18个月后收集报名(n = 20)。全血刺激了整个分枝杆菌(BCG,诺),从QFT管ESAT-6 / CFP-10肽,TB122肽池(11)使用标准化的协议(12]。细胞被染色后抗体:anti-CD3(贝克曼库尔特、Krefeld、德国;克隆UCHT1;正欲ECD)、anti-CD4 ((BD),富兰克林湖,新泽西,美国;克隆RPA-T4;BV605)、anti-CD8 (Biolegend、圣地亚哥、钙、美国;克隆RPA-T8;BV510), anti-IFNγ(双相障碍;克隆B27;Alexa萤石700),anti-TNF (eBioScience、圣地亚哥、钙、美国; clone Mab11; PE-Cy7), anti-IL2 (BD; clone 5344.111; FITC), anti-CD27 (BD; clone M-T271; APC), anti-HLA-DR (Biolegend; clone L243; BV421) and analysed by flow cytometry (BD LSRII).
我们第一次评估发表t细胞生物标志物(3,4,6- - - - - -9]的能力区分LTBI参与者与结核病患者。的比例HLA-DR-expressing IFNγ-producing CD4 t细胞(3,6,7),CD27平均荧光指数(MFI)比IFNγ-producing CD4 t细胞(4)和频率的IL2-producing t细胞(8]ESAT-6 / CFP-10刺激后显著降低在LTBI参与者与结核病患者相比,虽然单TNF-producing CD4 t细胞的比例(9组(之间)没有不同图1一个)。刺激患者样本并没有统计上的不同(确切概率法)如果控制被归类为无,无法解释的表型结果。只有HLA-DR和CD27 MFI比率达到接受者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC) > 0.8 (图1一个)。
接下来,我们旨在确定这些出版的小说组合生物标记物可以提高诊断性能。为此建立了一个工作流定义(图1 b)。我们只分析细胞因子组合的应答率超过80%在每个学习小组,以减少偏见和确保生物标志物的鲁棒性。HLA-DR表达式出现在所有排名前十的组合,因此最有益的特性(图1 c)。应该注意的是,只有CD4和CD8 t细胞特定特性的前10名。当我们观察到一系列的auc(和置信区间)的选择组合,这些并没有统计上的不同,可能由于我们的研究群体的相对较小的样本大小。然后我们利用Youden指数来确定阈值的否决,最大化每个生物标志物的敏感性和特异性。只有HLA-DR表情BCG-specific IFNγ+ TNF IL2 - CD4 + t细胞(无论CD27)达到95%的特异性和敏感性(95%图1 c)。
降低试验成本和简化分析,然后试图减少荧光流式细胞仪参数,同时保持高水平的诊断性能。分析4荧光参数可以进行小和廉价流血细胞计数器,更容易在资源受限的设置。基于上述分析性能,我们选择HLA-DR表情IFNγ和肿瘤坏死因子共同表达t细胞。共同表达两种细胞因子的检测抗原t细胞不受文物来自自发荧光或非特异性抗体染色,通常观察到单cytokine-producing细胞(数据未显示)。几乎所有在我们的数据集结核分枝杆菌特殊CD4 + t细胞,但由于其他人提出,CD8 +测量反应可能产生额外的诊断价值(5),我们推断控制总CD3 +细胞将包含来自CD4 +和CD8 +细胞的反应。虽然抗原刺激的选择似乎没有影响生物性能(图1 c),我们专注于刺激结核分枝杆菌特殊抗原ESAT-6 / CFP-10,这可以提供一个额外的好处,即区分人敏感结核分枝杆菌感染从那些不敏感(例如结核分枝杆菌未感染)。这将扩大的适用性blood-based对结核病诊断测试还包括诊断结核分枝杆菌感染。
基于这些考虑,我们重新进行流式细胞仪数据,关注HLA-DR表达式IFNγ和TNF-expressing CD3 + t细胞使用这个色板,并忽略其他抗体的存在。LTBI distinctive参与者来自那些活动性结核病(AUC 0.97, 95% ci 0.91 - -1.00) (图1 c)。重要的是,所有十大生物标志物的表达(数据未显示),特别是HLA-DR +的比例结核分枝杆菌特殊技能CD3 + t细胞共同表达IFNγ和肿瘤坏死因子(评估与色板;图1 c),降至水平在健康对照组所观察到的类似成功治疗的结核病患者。
我们的研究发表的独立验证t细胞诊断生物标记使用整个blood-based方法,哪个更适合翻译实地测试比外周血单核细胞(PBMCs)。之前我们系统地评估所有可能的组合验证生物标志物和比较竞争相同的人口。我们的研究结果与最近的工作表明,在协议更好的观察歧视HLA-DR表达式CD27相比PBMCs [7]。虽然以前的研究都集中在测量HLA-DR或CD27的表情结核分枝杆菌您完全由IFNγ表达式[t细胞识别3,5),我们的研究结果表明,与表型资料结合两种功能的结果可能会产生更好的诊断准确性。重要的是,我们展示潜在可行性测试基于流式细胞仪面板组成的有限只有四个抗体,产生了一个诊断的敏感性为86%,特异性为100%的疾病活动性结核病。这些性能特征属于世界卫生组织推荐的最低目标产品概况共识会议(14]。成功治疗的结核病导致这些生物标志物回到水平在健康的人与无症状结核分枝杆菌感染,确凿的结核病的高特异性。
虽然我们的研究不包括参与者合并感染艾滋病毒,最近的数据表明,HLA-DR表情结核分枝杆菌特殊t细胞明显高于与活动性结核病感染艾滋病毒的人相比,潜伏性感染控制(6,7]。这些结果表明,简化全血结核病诊断化验可能在艾滋病患者有适用性。未来关键步骤确定的性能T-cell-based生物标志物在感染艾滋病毒和儿科人口,包括对照组与其他呼吸道疾病的患者。总之,我们的数据支持进一步发展的一个简化的全血测定测量HLA-DR表情结核分枝杆菌特殊t细胞对结核病诊断和治疗监测。
脚注
支持声明:这项工作得到了比尔和梅林达•盖茨基金会(OPP1114368) Laboratoire d 'Excellence“内环境”(anr - 10 - labx - 69 - 01),和来自欧洲委员会TBVAC2020财团(h2020 - phc - 643381)。m . Musvosvi被纽约卡耐基基金会的支持。Elisa所是一个玛丽露英格拉姆的学者。资金信息,本文一直存放在Crossref资助者注册表。
利益冲突:T.J. Scriba报告收到gmgf每年资助大学的开普敦,在进行这项研究的。
利益冲突:大肠所收到比尔和梅林达•盖茨基金会的资助,在进行这项研究的。
- 收到了2017年12月2日。
- 接受2018年2月12日。
- 版权©2018人队