文摘
在初级纤毛运动障碍(PCD),能动的纤毛功能障碍源自纤毛缺陷通常经透射电子显微镜(TEM)。在30%的病人,如那些DNAH11突变,显然是正常的超微结构使得诊断困难。遗传分析支持诊断,但可能不确定明确的因果变异。电子断层扫描,TEM的延伸,产生三维的超微结构与上级决议TEM纤毛模型。我们的假设是断层使用现有的患者样本将使可视化DNAH11 -超微结构的缺陷有关。从araldite-embedded双重轴x线断层照片收集鼻纤毛在13纤毛超微结构正常的患者(DNAH11n = 7,HYDINn = 2,CCDC65n = 3DRC1n = 1)和六个健康对照,然后使用IMOD中分析和嵌合体软件。
DNAH11蛋白质是近端纤毛局部地区。在这个地区,电子断层扫描显示缺乏> 25%的患者近端外动力蛋白臂卷DNAH11突变(n = 7)比其他患者PCD和正常的超微结构(n = 6)和健康对照组(n = 6)。DNAH11突变导致纤毛超微结构异常共享之前通过TEM检测不到。有利地,电子断层扫描可用于现有的诊断样本和建立一个结构异常,以前正常的超微结构的研究。
文摘
三维电子断层扫描识别缺陷在患者的纤毛纤毛和“正常”超微结构http://ow.ly/lZqd30hdPXM
介绍
原发性纤毛运动障碍(PCD)是一种遗传疾病影响15∼000的人口。无效的黏膜纤毛的清除,纤毛蠕动引起的破坏,导致慢性sino-pulmonary疾病的临床表型(1]。症状通常开始在新生儿期与新生儿呼吸窘迫,包括慢性咳嗽鼻涕又湿,进步在儿童上呼吸道和下呼吸道反复感染和最终的支气管扩张(1]。纤毛存在于胚胎节点和节点纤毛缺陷导致异常的左右一侧的决心(部位)∼50%患者(1]。
PCD是诊断使用的组合测试。这些可能包括鼻一氧化氮的测量,分析纤毛功能的高速视频显微镜和免疫荧光蛋白表达分析(2,3]。PCD诊断是最终确认缺陷的识别标志的纤毛超微结构呈现由透射电子显微镜(TEM)或检测nonambiguous biallelic突变基因(在一个已知的纤毛2]。正常的纤毛超微结构所示图1。PCD患者最常见的有结构缺陷影响动力蛋白臂和/或微管排列(2,4,5]。显然是正常的超微结构由传统的TEM是一种常见的现象,被认为发生在30%的情况下(5- - - - - -7]。基因分型结果也使得25 - 50%的情况下解决(2]。在这些情况下,作出明确的诊断是很困难的。
Biallelic突变DNAH11PCD的基因是一个常见原因,占≥22%病例的纤毛运动“正常”TEM超微结构的结果(8,9]。的DNAH11基因是编码一个重链axonemal外动力蛋白臂的动力蛋白的蛋白质组成部分(ODA)出现在近端纤毛的一部分(图1)[10]。令人惊讶的是,尽管相当大的分子质量(∼520 kDa),高致病性突变的后果DNAH11预测功能丧失导致的蛋白质(如。胡说,转移和必要的剪切位点突变)是由TEM检测不到9]。这早就提出了一个诊断神秘,阻碍明确诊断,尤其是在确定的情况下DNAH11突变不是之前报道或致病的。PCD是基因异构,尽管一些常见的因果变异被发现,大多数患者(包括那些携带DNAH11突变)有独特的突变,另外一些人列为变异由国际临床意义不明的变体调用和报告标准11),如。氨基酸替换“错义突变预测不确定的致病性(11]。DNAH11突变通常授予hyperfrequent纤毛击败想起使用高速视频显微镜。然而,这并不是完全独特的或诊断。因此,对于一个患者DNAH11突变,由于正常的超微结构和重要的存在保留纤毛蠕动通过光学显微镜,金刚石可以错过的诊断,而且,当诊断怀疑很难使用现有的结构或功能测试确认。
双重轴电子断层扫描是一个扩展传统的TEM技术。它允许纤毛结构的可视化三维(3 d)启用增强分辨率和纤毛超微结构的理解12,13]。我们之前用过电子断层扫描证明缺乏C2b中央双投影的下游的结构性缺陷HYDIN突变(14]。电子断层扫描没有平均已被证明在一个病人有潜在的检测干扰引起的纤毛超微结构DNAH11突变(10]。
在这项研究中我们测试的假设,尽管超微结构正常使用标准TEM, 3 d重建和subtomographic平均使用现有的患者样本可能使可视化DNAH11 -超微结构的缺陷有关。我们调查是否有损失的体积在纤毛ODA的三维重建DNAH11PCD金刚石与正常健康对照组相比,超微结构引起的DNAH11突变。在这一过程中,我们旨在研究三维层析成象技术的潜力诊断和推进现有知识的影响DNAH11蛋白质的位置不同DNAH11突变。
方法
病人的选择
七个病人,7 - 18岁,与已知biallelic致病突变DNAH11被选中。主题的细节,总结他们的诊断调查所示表1。这项研究是由伦敦布鲁姆斯伯里研究伦理委员会批准在08年/ H0713/82批准。
两个比较器组。第一组由六个健康对照组无纤毛运动。第二组由六个科目金刚石和正常TEM的诊断,没有携带DNAH11突变。这些病例是由于biallelic突变HYDIN(n = 2),CCDC65(n = 3)DRC1(n = 1)。PCD比较器组被选中,是因为超微结构通常被认为是正常的在这些情况下,但这并不是预期它也没有看到过ODA是受这三个基因的突变14- - - - - -17]。这些基因突变与孤立的缺陷c2b中央对投影(HYDIN)和nexin-dynein监管复杂(CCDC65和DRC1)。一个主题功能丧失的突变DNAH5用已知的ODA TEM用作负控制缺陷。
电子断层扫描样品制备
超薄部分(∼150海里)将使用一个ultra-microtome从鼻刷块嵌入环氧树脂。部分沾2%醋酸双氧铀及柠檬酸铅和随后贴上10 nm黄金基准标记。
以下方面(平面部分所示图1 c)使用断层扫描评估:1)纵向部分基因丝的近端部分的纤毛;2)纵向部分基因丝的远端部分的纤毛;3)横截面,至少六每视野,的近端部分基因丝(在该地区的微绒毛)。
代电子x线断层照片
JEOL 1400 + TEM(英国)韦林花园城,是用于收集一系列的图像在不同阶段倾斜。4 k 000×20×4 k数字图像放大被捕用JEOL断层扫描软件和数码相机(AMT 16 x岁,埋葬圣埃德蒙兹,英国)。软件位置自动调整阶段,关注和曝光。+ 65°的标本是通过角度倾斜−65°和图像获得1°的增量。后图像生成的示例是手动旋转90°,在同一地区第二个系列的图片。这两个形象系列一致,结合产生一个双重轴重建使用IMOD软件(18,19]。
Subtomographic平均
Subtomographic平均提高ODA结构进行电子断层扫描,使用粒子估计IMOD软件方案的一部分(19]。纵向x线断层照片的区域选择平均每隔96 nm (20.]。对横截面的中心每个微管的微管紧身上衣(图1)被选为中心的平均。质量控制,平均的内在动力蛋白臂和径向辐条呈现可以被认为是可接受的进行进一步分析。
结果
DNAH11纵向x线断层照片证明损失ODA的体积在近端纤毛地区
根据证据表明不同的ODA类型的近端和远端纤毛10)(图1 c)我们创造了平均纵向x线断层照片的近端和远端地区纤毛基因丝从主题DNAH11突变。x线断层照片从近端获得地区所有显示ODA体积的丧失。代表图像的96 nm的近端纤毛微管包含四个oda所示图2一个比较话题# 4,携带两个转移功能丧失DNAH11等位基因健康控制。量化的胳膊在四卷DNAH11受试者相比,控制没有呼吸道疾病(n = 3)表明,大约三分之二的ODA体积是迷失在个人DNAH11缺陷(图2 b)(p < 0.01)。x线断层照片从剩下的三人DNAH11主题和三个控件没有收集由于纵向电子断层扫描的技术困难。
保留结构的近端ODA进一步使用断层扫描研究。在x线断层照片图片,似乎重链头被保留在每个ODA,大概没有DNAH11但保留DNAH5蛋白质以及轻链与DNAH11如NME8(相关的蛋白质图2 b)。这证实了免疫荧光抗体染色从两个DNAH11-deficient主题(DNAH11# 2和# 7)在ODA的重链动力蛋白DNAH5 (ODA头组件)和axonemal轻链动力蛋白NME8(组件将是密切相关的ODAβ重链杆)都是完整的(图3 b和d)。
DNAH11是近端局部区域的纤毛和远端地区的x线断层照片看起来正常
从远端纵向x线断层照片无差异区域的纤毛与三个科目DNAH11突变,而两个对照组(图2一个通过免疫荧光和b)。我们确认一个近端axonemal本地化DNAH11从健康对照组无纤毛蛋白出现在远端纤毛(图3一和c)。
根据这一发现,纤毛模式DNAH11主题,所评估的高速视频显微镜显示出更高的近端区域纤毛运动障碍的发生率,较远的地区。六个样品中有减少弯曲底部的纤毛和保存波形提示(在线辅助视频1和表1),与健康对照组相比(补充视频2)。的不完整的打DNAH11主题的结果在一个显然hyperfrequent纤毛,之前报道,据推测是由于减少弯曲,因此较短的有效和恢复中风,导致更多每秒跳动(8,9]。我们推测,这个结果缺乏DNAH11近端纤毛而DNAH9——包含顶级(远端)纤毛仍然是移动的一半。综上所述,高速视频显微镜、x线断层摄影术和免疫荧光研究证实DNAH11本地化纤毛的近端部分,因此进一步的x线断层照片都来自这一地区。
横向x线断层照片一直显示ODA体积的损失DNAH11受试者相比,控制
纵向x线断层照片被发现有一个高技术故障(14 26 x线断层照片),因此不能经常使用。横截面(飞机所示图1 c)x线断层照片被用来产生一个更健壮的方法。所有的横向x线断层照片收集(n = 19)包含动力蛋白臂和成功可以分析。减少体积的ODA被确认在所有七个DNAH11人与健康对照组(图4一)。ODA比例微管紧身上衣的中位数(四分位范围(差)的10.3% (9.3 - -10.5%)DNAH11受试者相比,13.8%(12.9 -14.4%)在健康对照组。主题与纤毛运动引起的其他缺陷(HYDIN,CCDCD65和DRC1突变)有一个值(差)官方发展援助的比例14.4%的微管紧身上衣(13.1 - -16.0%),与健康对照组相似。没有重叠的ODA体积之间的损失DNAH11组和对照组(图4一),表明ODA卷所带来的重大损失DNAH11突变(p < 0.01)。无义突变纯合子的主题DNAH5(c.13285C > T;p.Arg4429 *)是包括作为一个消极的控制。近端地区ODA比例2.4%,下面的一个值的范围DNAH11和其他对照组。
三维图像分析表明,体积减少DNAH11特战分队“前臂”一节的主题是x线断层照片(图4 b,补充视频3和4)。这是发现始终在所有测试受试者携带不同的突变中的变异DNAH11基因(绿色标注,图4 b)。
讨论
我们表明,DNAH11突变导致纤毛超微结构的异常特征被电子断层扫描,而不是传统的TEM。缺陷是特定于前臂的官方发展援助,只有在检测到的近端部分纤毛DNAH11所在。
横剖面电子断层扫描技术在这项研究中的应用是有利的,因为它使用现有固定嵌入式样本存储为诊断标准TEM,从而避免额外的取样。强度的技术用于这项研究结果的量化和使用MTD体积作为一个在量化内部控制,减少偏差引入的图像分析,如手动选择的图像特性和阈值。量化显示,ODA体积测量之间没有重叠或纤毛运动控制和健康DNAH11主题,确定明确的潜在缺陷的成像分辨率的性质。的可靠性测试结果表明,该技术有潜力用于诊断途径高度非典型纤毛运动情况。
用免疫荧光和电子断层扫描我们证明DNAH11突变不会导致整个ODA的损失。我们发现部分ODA头地区的重链(假定DNAH5蛋白质),以及至少部分剩余的ODA结构(NME8-positive),仍然完好无损沿着近端纤毛地区的患者DNAH11突变。这些保留的本地化结构,再加上DNAH11损失的近端性质,提供了可能的解释显然是正常的纤毛结构的长期难题DNAH11患者在使用传统的TEM。图5显示了一个动画演示ODA损失的预测模型DNAH11用例。这些数据引起的三维层析成像推进我们对PCD疾病的细胞生物学的理解,以及它如何影响纤毛,这样大部分的结构保持完全原状而非常具体的损失只有一部分ODA足以导致无效的黏膜纤毛的间隙及其临床后果。
在这项研究中,我们已经表明,横剖面电子断层扫描可以区分DNAH11和控制情况下不需要更复杂的纵切面或低温电子断层扫描技术。的近端位置DNAH11意味着适当选择近端区域横向电子断层扫描是这项技术的关键。在目前研究微绒毛的存在是用作接近细胞表面标记,因此DNAH11地区;然而,这种方法是不完美的,因为偶尔提示弯曲纤毛的结构可能驻留在这个地区。控制和明确的区别DNAH11案例表明这不是一个定义的主要限制DNAH11本研究缺陷。电子断层扫描技术的其他限制因素是费时,劳动密集型和需要专业培训。需要好几天的时间才能够收集、重建和平均每个x线断层照片,导致只有少数的截面被评估和阻碍其作为一种高通量诊断筛查工具使用。然而,高吞吐量从来不是我们的目的,这种技术可以用于参考中心的专家在少数情况下因为标本已经嵌入之间可以很容易地运输中心。使用嵌入部分化学和限制层析倾斜范围(±65°而不是±90°)都是因素限制分辨率层析的全部潜力。大多数DNAH11蛋白体积成像横剖面的oda时深度(z),导致损失的决议而在纵向平面图像采集。使用纵向部分或低温电子断层扫描将克服一些分辨率限制,从而进一步阐明人类DNAH11的结构性作用[20.]。然而,我们发现纵向断层扫描技术挑战性和无法收集完整的数据集使用这种技术(图2 b)。低温电子断层扫描是不实用的诊断评估诊所或审查现有的,以前没有解决,临床样本,由于低温电子显微镜的要求,需要立即准备样品后活检或文化12]。
免疫荧光可用于DNAH11缺陷的确认。然而,抗体DNAH11不是和其他广泛使用表明,蛋白质仍然存在于纤毛从个人与纤毛运动由病原引起的DNAH11错义突变由于染色的控制(10]。一个个体(主题# 5)在目前研究纯合错义突变。纤毛从这个主题展示相同的层析体积损失25%的其他六个科目携带预测零突变(过早截断和移码突变)。我们推测能力检测蛋白质损失引起的错义突变,电子断层扫描是由于上级解决技术相比,免疫荧光;然而,这需要进一步验证错义变体。ODA体积的差异可能可以代表动力蛋白的构象变化而不是DNAH11蛋白质的直接损失。这将提供另一种可能的解释为错义突变量的损失,一些蛋白质预计仍将存在。有趣的是,维oughertyet al。(10)和数据在这个研究表明DNAH9可以进入近端区域的基因丝DNAH11的缺失。我们的研究表明,任何这样的替代蛋白仍然没有完全占领DNAH11蛋白质留下的结构性缺陷。
因此,这项研究提供了概念证明,电子断层扫描可以用来证实诊断为纤毛运动,传统TEM显示正常。我们建议电子断层扫描,由于显微镜设备要求和其耗时的特性,可用于专家中心金刚石已经不确定的情况下,其他测试和基因测试如果可用依赖于变量的不确定的意义,要求功能确认(如。未发表的错义突变)。的在线补充材料演示了一个示例案例研究断层扫描是用来证实诊断病人的错义变体DNAH11。
总之,我们展示了一个一致的超微结构的受试者携带有害的缺陷DNAH11突变后认为“正常的超微结构”。我们已经表明,断层扫描技术具有良好的分辨率和精度检测PCD的缺陷DNAH11显然缺乏患者正常的超微结构。纤毛电子显微镜的主要进步促进了PCD。提高分辨率和断层的三维可视化已经承诺提供重要的细胞生物学见解的原因和可变性PCD和一种改进的新型基因突变的意义的理解。
补充材料
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补充材料和方法erj - 01809 - 2017 - _supplementary_methods
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补充视频1:DNAH11高速视频显微镜纤毛跳动500 fps记录和回放30 fpserj - 01809 - 2017 - _video_1
补充视频2:健康控制高速视频显微镜纤毛跳动500 fps记录和回放30 fpserj - 01809 - 2017 - _video_2
补充视频3:x线断层照片DNAH11横剖面erj - 01809 - 2017 - _video_3
补充视频4:x线断层照片控制横截面erj - 01809 - 2017 - _video_4
确认
我们要感谢PCD家庭为他们参与这项研究金刚石专业英国和英国国民健康保险制度的支持服务。我们要感谢迈克尔·辛普森的工作(英国伦敦国王学院、伦敦),露西Jenkins和克里斯托弗Boustred (NE泰晤士区域分子遗传学服务大奥蒙德街儿童医院NHS信托基金会,伦敦)进行遗传分析。我们承认威康信托基金会奖WT091310 UK10K并感谢UK10K联盟(调查人员在上市www.uk10k.org/),尤其是罕见疾病组,whole-exome测序纤毛运动的患者。作者是BESTcilia FP7和成本之下的成员行动BEAT-PCD (BM1407)。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持支持声明:莫莱森Mitchison大奥蒙德街医院的儿童慈善机构,英国PCD家庭支持集团和国家卫生研究所(NIHR)生物医学研究中心的大奥蒙德街儿童医院NHS信托基金会和伦敦大学学院。a . Shoemark资助的博士后研究奖学金NIHR英格兰和健康教育(庆熙-高碳钢p13 - 04 - 004),指导c·霍格莫莱森Mitchison和a·布什。答:布什支持的NIHR呼吸道疾病生物医学研究单位在皇家主管布朗普顿和地铁站Harefield NHS信托基金会和伦敦帝国理工学院。这份报告是独立研究因支持的博士后研究奖学金NIHR英格兰和健康教育。中表达的观点不一定是作者和出版的NHS, NIHR或卫生部。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
利益冲突:没有宣布。
- 收到了2017年9月8日。
- 接受2017年12月10日。
- 版权©2018人队