文摘
烟蒸汽含有自由基诱导氧化应激与潜力。自从在气道细胞氧化应激增加platelet-activating因子受体(PAFR)表达式,和PAFR肺炎双球菌坚持宿主细胞所利用,我们提出由于电子烟蒸汽增加肺炎链球菌粘附气道细胞。
鼻上皮PAFR non-vaping控制评估,在成人之前和之后的5分钟vap。我们确定蒸汽对氧化应激的影响,PAFR-dependent肺炎链球菌粘附气道上皮细胞在体外小鼠鼻咽,肺炎球菌殖民。元素分析蒸汽通过质谱分析,和蒸汽氧化潜力的评估抗氧化消耗在体外。
没有汽之间的基线鼻上皮PAFR表达差异(n = 11)和控制(n = 6)。vap增加鼻PAFR表达式。烟汽肺炎链球菌粘附增加气道内含有尼古丁,尼古丁自由细胞在体外。Vapour-stimulated附着力在体外减毒的PAFR阻滞剂CV3988。含有尼古丁烟蒸汽增加鼠标鼻PAFR表达式和鼻咽的肺炎球菌殖民。蒸汽包含redox-active金属,有相当大的氧化活性,附着力是减毒抗氧化剂n -乙酰半胱氨酸。
这项研究表明,由于电子烟蒸汽有可能增加对肺炎球菌感染的易感性。
文摘
气道细胞的接触烟蒸汽上调肺炎双球菌坚持使用的受体细胞http://ow.ly/p9Be30hE5B1
介绍
流行病学研究表明,吸入毒素增加呼吸道细菌感染的风险。例如,吸烟与四倍(95% CI 2 - 7日)侵入性肺炎球菌病的风险增加(1),被动接触环境烟草烟雾与1.5倍(95%可信区间;(1.2 - -1.9)儿童肺炎的风险2),在幼儿接触化石能源的可吸入颗粒物与1.3倍(95% CI 1.0 - -1.6)细菌性肺炎(增加3]。肺炎球菌感染的风险增加,细菌性肺炎的最常见原因(4),也在职业和环境设置,包括接触焊接烟雾(5和空中尘埃6]。因为侵入性肺炎球菌菌株坚持,把,呼吸道上皮细胞粘附是可敬的前提条件,建立肺炎球菌病(4]。建立公司粘连,肺炎双球菌拉拢host-expressed platelet-activating因子受体(PAFR),然后使用受体作为一个特洛伊木马进入气道细胞受体性(7]。先前的研究表明,生物upregulation PAFR是一个合理的机制之间的联系吸入毒素和脆弱性的肺炎球菌感染。例如,我们发现,香烟烟雾提取物,化石能源的可吸入颗粒物和焊接气体,通过诱导的氧化应激,上调PAFR-dependent肺炎链球菌粘附降低气道细胞在体外(8- - - - - -10]。
电子香烟(ECs)是面向成年人和年轻人作为一个更安全的替代吸烟和戒烟可能援助。ECs的蒸汽,产生的汽化的丙二醇(1,2-propandiol),甘油,尼古丁和口味在EC液体,含有有毒物质比烟草烟雾少(11]。虽然猜测一些不利健康的影响吸入EC汽减少与烟草烟雾相比,有新兴的证据的毒性作用,包括损害肺部细菌宿主防御的能力。例如在老鼠中,EC蒸汽消耗肺抗氧化剂和延迟从肺肺炎双球菌的间隙12,13]。因此我们提出EC蒸汽增加PAFR-dependent肺炎链球菌粘附气道细胞。为了解决这个假设,我们寻求在目前的研究,以确定:1)vap的影响在成人鼻上皮PAFR表达式;2)电子商务的影响蒸汽在PAFR-dependent肺炎链球菌粘附气道细胞在体外;和3)EC蒸汽的影响鼻PAFR表达和鼻小鼠模型的无症状的鼻咽癌肺炎球菌肺炎球菌负担殖民。
方法
人类志愿者学习
vap的成年人每周至少一次,健康成人控制招募从未吸过烟。排除标准是烟草吸烟(汽),3个月内任何吸烟(控制),慢性呼吸道疾病,最近鼻手术和鼻疗法。鼻上皮细胞样本来自的两个鼻孔参与者使用Rhino-probe(美国VWR,二,PA)和集中在初级细胞媒体(Promocell、海德堡、德国)包含penicillin-streptomycin和primocin (InvivoGen,图卢兹,法国)。在汽,鼻细胞得到EC之前和1 h之后立即使用。vap观察5分钟时间。汽被要求吸入EC蒸汽在他们正常的频率和正常呼气。鼻活检被控制在一个场合。评估PAFR表达式,鼻细胞被洗和resuspended DPBS含有10%的边后卫在染色前的anti-PAFR主要抗体(1∶Abcam,剑桥,英国)如上所述。钙粘蛋白(主要抗体用于1:10 0,Abcam)添加到确定上皮细胞(14]。细胞被洗,然后沾二级抗体共轭Alexa萤石488 PAFR表达式(1:3000 Abcam)和共轭APC上皮表达(1:1500 Abcam) 30分钟在室温下用颤抖的。一个PAFR同型的控制(兔单克隆免疫球蛋白(Ig) G EPR25A)是包括对非特异性免疫染色的调整。分析对BD流式细胞仪进行第二章机使用BD FACSDiva软件(BD生物科学,牛津大学,英国)闸门将排除细胞碎片。PAFR表达式纠正非特异性染色,是表达的平均荧光强度(MFI)。这项研究是由英国国家卫生服务研究伦理委员会批准(15 /不/ 0237),并要求书面同意。
由于电子烟汽
EC蒸汽被收集到棉花过滤器通过蠕动泵(Jencons科学有限公司东Grinstead英国)在一个固定利率从第二代电子商务(RBC CE5 Clearomizer, 3.7 V 650 mAh电源电池,https://www.ukecigstore.com英国)。过滤器被暴露于25泡芙在5分钟使用tobacco-flavoured EC包含24 mg·毫升的液体−1尼古丁,尼古丁自由tobacco-flavoured EC液体(https://www.ukecigstore.com)。EC蒸汽从过滤器中提取(ECV)获得通过涡流2毫升的杜尔贝科的磷酸盐(DPBS)和存储为100%原液−20°C。媒介控制股票是由从棉花中提取2毫升DPBS过滤器(DPBS控制提取)。纯粹的尼古丁(Sigma-Aldrich,普尔,英国)稀释DPBS产生股票的解决方案。尼古丁ECV和EC液体的浓度是由气相色谱分析-质谱法(gc - ms;补充材料)。
气道细胞
肺泡II型上皮细胞系A549是购自Sigma-Aldrich(英国Poole)和维护在胎牛血清的DMEM补充的边后卫和penicillin-streptomycin (Lonza、巴塞尔、瑞士),和通道数量少于20。支气管上皮细胞系BEAS-2B保持在rpmi - 1640(生命技术)和补充的边后卫和penicillin-streptomycin通道数量还不到20岁。人类原发性支气管上皮细胞(HBEpCs)从Promocell GmbH(德国海德堡)购买和维护按照制造商的说明和通道数量小于5。人类主要鼻上皮细胞(HPNEpCs)获得从未吸过烟,non-vaping成年女性使用Rhino-probe捐赠,和维护在BEGM(支气管上皮细胞生长中)补充BEGM BulletKit按照制造商的指示(Lonza)和通道数量小于5。上皮细胞的存在证实了评估的总百分比细胞与上皮钙粘蛋白标记染色,评估通过流式细胞术(如上所述)。细胞膜的完整性评估了乳酸脱氢酶释放,根据制造商的说明(Sigma-Aldrich)。细胞治疗与蒸馏水作为积极的控制,并表示100% LDH释放。
附着力和PAFR
毒性类型2链球菌引起的肺炎封装应变D39(国家反恐怖主义中心的7466)是购买从国家文化类型的集合(中央公共卫生实验室,伦敦,英国)发展到mid-logarithmic阶段(OD600年= 0.4 - -0.6)在脑心浸液肉汤(BHI)(英国贝辛斯托克Oxoid)和存储在−80°C。肺炎链球菌粘附气道细胞进行使用在体外附着力试验(8,9]。在这个试验,集落形成单位计数每毫升(CFU)反映了肺炎双球菌附着表面细胞的数量和细胞内细菌的数量(补充材料)。细胞内的组件是评估后第一次杀死表面附着的细菌与青霉素(200 mg·毫升−1)和庆大霉素(10 mg·毫升−130分钟)。细胞内肺炎双球菌,免受了抗生素杀死细胞溶菌作用与冰冷的无菌水和镀BHI琼脂来确定CFU [8]。细胞氧化应激的作用是由孵化与硫醇(抗氧化剂防治南汽;Sigma-Aldrich),最终浓度5更易·L−1(15]。细胞培养与南汽接触ECV 30分钟前,在ECV曝光。NAC是被洗涤前增加肺炎双球菌和评估附着力。PAFR的作用是评估通过添加CV3988(西格玛奥德里奇),一个特定PAFR受体阻滞剂与半最大抑制浓度(IC50μM (0.28)16]。CV3988添加到粘附试验的最终浓度20μM,正如前面报道(17]。我们寻求建立完整的结果在A549细胞然后确认在其他气道细胞重要发现。
评估PAFR表达式,气道细胞脱离细胞培养瓶与胰蛋白酶和洗手再悬浮在DPBS含有10%的边后卫和彩色anti-PAFR主要抗体(1∶Abcam,剑桥,英国)在室温下1 h和摇晃。一个PAFR同形像控制(兔免疫球蛋白单克隆EPR25A)包括控制非特异性染色。第二章分析对BD流式细胞仪进行机器使用BD FACSDiva软件(BD生物科学,牛津大学,英国)。PAFR表示为小额信贷机构。
小鼠肺炎球菌殖民模型
女性CD1小鼠6 - 8周的年龄(查尔斯河,马尔盖特,英国)每天服用两次100%原液含有尼古丁ECV,尼古丁自由ECV期间或DPBS控制提取实验。第四天的剂量,1×105CFU肺炎链球菌在10µL PBS被灌输进鼻腔的麻醉下,诱导无症状的鼻咽癌马车。四天接种后,鼻咽组织被单一化和洗细胞通过一个过滤器。肺炎球菌菌落测定英里和Misra可行的数量(如前所述)(18]。鼻PAFR表达式是由流式细胞术(补充材料)。动物实验进行依法利物浦大学动物科学程序事先批准的法案1986年,英国内政部(PPL 40/3602)和利物浦大学的动物福利和伦理委员会。
元素分析和氧化潜力
元素组成是由感应耦合等离子体质谱法(ICP)使用PerkinElmer ICP质谱仪NexION 350 d,酸性消化后(补充材料)。ECV的氧化电位(OP)是由量化的损失两个低分子量抗氧化剂抗坏血酸盐和谷胱甘肽合成人类呼吸道粘膜液(RTLF) / 4 h潜伏期在37°C, pH值7.0,使用我们之前报道的方法(19)(补充材料)。数据表示为抗坏血酸盐和谷胱甘肽的损失比例相对于4 h DPBS控制。包含在分析1)消极控制点较低的OP(八;50纳米炭黑粒子与简单的表面化学(20.]),2)一个粒子OP -城市点标准较高的srm - 1648(国家标准与技术研究院,马里兰州,美国)。粒子在最终使用μg·50毫升的浓度−1。
统计分析
数据从研究人类志愿者、动物和OP总结是指(扫描电镜),并分析了通过t检验或单向方差分析事后多重比较测试。数据从在体外粘附的研究从至少四个实验,除非表示,在不同时间进行,代表的意思是至少三个复制,概括为中位数(四分位距(差),克鲁斯卡尔-沃利斯与分析事后多重比较测试。分析使用棱镜7 (GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)被认为具有统计显著性,p < 0.05。
结果
人肺泡上皮细胞A549细胞
尼古丁自由和含有尼古丁ECV增加肺炎链球菌粘附A549细胞剂量依赖性的方式(图2一个)和时间的方式(图S1)。接触细胞5% ECV 2.5 h没有造成A549细胞膜损伤,评估LDH释放(图S2),因此这个剂量和持续时间是用于后续实验。肺炎球菌渗透进入细胞,评估后杀死细菌细胞表面,增加了尼古丁自由和含有尼古丁ECV 5% (p < 0.05, p < 0.01,分别图2 b)。5%的尼古丁自由和含有尼古丁ECV PAFR表达增加(p < 0.01, p < 0.001,分别图2 c),PAFR拮抗剂CV3988减毒肺炎链球菌粘附刺激5%尼古丁自由和含有尼古丁ECV (p < 0.05, p < 0.01,分别图2 d)。CV3988没有减弱低级“基底”肺炎链球菌粘附被曝光的细胞(图2 d)。抗氧化剂NAC完全减毒肺炎链球菌粘附刺激5%尼古丁自由和含有尼古丁ECV (p < 0.05,图3一)。南京没有减弱“基底”肺炎链球菌粘附被曝光的细胞(图3一)。孵化的A549细胞稀释DPBS增加粘附在2.5毫克的尼古丁·毫升−1(p < 0.01与控制,图S3),没有附着力较低浓度的增加。没有差别在肺炎链球菌粘附刺激通过生成新鲜或冷冻ECV(数据没有显示)。
其他人类呼吸道上皮细胞
抗氧化剂NAC完全减毒肺炎链球菌粘附BEAS-2B细胞刺激5%尼古丁自由ECV和含有尼古丁ECV (p < 0.05,图3 b)。5%的尼古丁自由ECV增加肺炎链球菌粘附在初选HPNEpC鼻细胞(p<0.05),主支气管(HBEpC)细胞(p<0.05)和BEAS-2B支气管上皮细胞(p < 0.05,图4一- c)。5%含有尼古丁ECV增加肺炎链球菌粘附HPNEpC主要鼻细胞(p < 0.05), HBEpC主支气管细胞(p < 0.01)和BEAS-2B细胞(p < 0.01,图4一- c)。PAFR阻滞剂CV3988减5%的肺炎链球菌粘附刺激尼古丁自由在初选HPNEpC ECV鼻(p < 0.05), HBEpC主支气管(p < 0.05)和BEAS-2B细胞(p < 0.05,图4一- c)。CV3988也减5%含有尼古丁ECV刺激肺炎链球菌粘附在初选HPNEpC鼻细胞(p < 0.05),主支气管HBEpC细胞(p < 0.05)和BEAS-2B细胞(p < 0.01,图4一- c)。
增加5%的尼古丁自由ECV PAFR表达HPNEpC主要鼻细胞(p < 0.05), HBEpC主支气管(p < 0.05)和BEAS-2B细胞(p < 0.01,图5一个- c)。5%含有尼古丁ECV PAFR表达增加HPNEpC主要鼻细胞(p < 0.001),主支气管HBEpC (p < 0.01)和BEAS-2B细胞(p < 0.001,图5一个- c)。
在11的汽从基线活检获得足够的细胞含有尼古丁ECV文化与5%在体外。在这些主要从汽鼻细胞,PAFR表达式在体外增加了5%含有尼古丁ECV 2.5 h (p < 0.01与媒介控制,图5 d)。
元素组成及氧化潜力
5%的尼古丁自由和含有尼古丁ECV包含金属诱导氧化应激的能力(表S1)。虽然两个提取的元素成分大体相似,含有尼古丁ECV铜的浓度增加(p < 0.05)与尼古丁自由,(表S1)。5%的尼古丁自由和含有尼古丁ECV提取氧化抗坏血酸盐(p < 0.0001)与低OP粒子控制,图7)。抗坏血酸盐的损失百分比5%含有尼古丁ECV与粒子具有较高OP粒子相比增加(p < 0.0001),增加与尼古丁自由ECV相比(p<0.0001,图7)。类似的模式被发现谷胱甘肽耗竭,更高的损失百分比观察与含有尼古丁ECV相对较低和较高的OP粒子(p<0.0001,图7 b),并增加了OP与尼古丁自由ECV (p<0.001,图7 b)。
尼古丁
含有尼古丁的尼古丁浓度E-liquid 24 mg·毫升−1由制造商——相同的报道。尼古丁自由E-liquid只含有微量的尼古丁,DPBS控制提取中不含尼古丁。5%的尼古丁浓度尼古丁自由ECV略高于试验的检测水平在0.03 mg·毫升−1,5%含有尼古丁ECV含有0.4毫克·毫升−1。
讨论
在这项研究中,我们试图评估是否接触呼吸道上皮EC蒸汽增加其支持肺炎链球菌粘附和感染的能力。在成人志愿者我们发现vap增加鼻上皮PAFR表达式,并且post-vaping PAFR表达高于对照组。PAFR表达式不是持续增加了vap,因为pre-vaping水平不高于控制。兼容的报道增加肺炎链球菌粘附气道细胞暴露于毒素如香烟(8),焊接烟雾(10和化石能源的可吸入颗粒物9),我们发现ECV增加肺炎链球菌粘附气道上皮细胞体外。
粘附刺激ECV在体外是由于增加PAFR表达式,因为ECV明显增加PAFR气道细胞上的表达,和PAFR阻滞剂CV3988完全变弱ECV-stimulated粘附在鼻,支气管和肺泡上皮细胞。这种效应CV3988兼容以前的报告,阻断PAFR变弱增加肺炎链球菌粘附刺激通过炎症介质(21),或毒素,引起氧化应激(10,22]。CV3988对控制的影响细胞的缺乏也兼容报道,低水平“基底”粘附如果细胞是由一种PAFR-independent,还未定义,机制21]。
有证据表明从先前的研究ECV有可能诱发气道细胞的氧化应激。例如,克oelet al。(23)报道,ECV包含10×1013自由基每卷(23],Carnevaleet al。(24)报道,增加循环氧化应激标记在成人vap之后,和Solletiet al。(25)报道,ECV是一个有效的诱导物的基因在支气管上皮细胞氧化应激反应在体外。在目前的研究中,ECV OP高,存在的ECV redox-promoting金属,如铜和铁,和衰减ECV-stimulated肺炎链球菌粘附抗氧化剂n -乙酰半胱氨酸,支持对氧化应激作用的初始刺激PAFR-dependent附着力。相比之下,尼古丁的作用本身在移植肺炎链球菌粘附更为复杂。一方面,尼古丁增加PAFR表达式和肺炎链球菌粘附在A549细胞,结果兼容母鸡et al。(26)报道,尼古丁增加PAFR mRNA表达A549细胞。另一方面,PAFR-dependent附着力也增加了尼古丁自由ECV。此外,尼古丁的浓度在5%含有尼古丁ECV·毫升(0.4毫克−1)低于浓度(2.5 mg·毫升−1)需要显著刺激附着力在体外当用作稀释纯化合物。因此,我们得出这样的结论:在体外反应,氧化还原活性金属等其它化合物ECV刺激PAFR-dependent粘连。相比之下,尼古丁的作用在刺激鼻PAFR增加在活的有机体内仍不清楚。然而,值得注意的是,PAFR表达增加与vap成年人使用尼古丁自由EC液体。未来的研究vap成年人应该目标比较鼻PAFR反应含有尼古丁ECV,尼古丁自由ECV,纯尼古丁鼻喷雾剂。
这项研究有一些局限性。首先,目前尚不清楚使用的ECV浓度和持续时间在体外反映了气道细胞的接触在活的有机体内。然而,与vap鼻PAFR表达的增加,增加PAFR在鼻细胞获得基线从汽和暴露于ECV提取在体外我们表明,在体外模型是有效的。第二,我们没有,因为道德原因,确定是否ECV-induced鼻PAFR表达增加肺炎球菌感染人类,但这是建立在动物模型。例如在侵入性肺炎球菌病的典范,Cundellet al。(21interleukin-1α]报道,之前曝光的兔子,一个移植上皮PAFR的中介,增加肺炎球菌菌落在肺灌洗。小鼠模型的无症状的肺炎球菌鼻殖民化,暴露在含有尼古丁ECV提高鼻PAFR表达与鼻咽癌肺炎球菌菌落负载。相比之下,尼古丁自由ECV并不增加鼻PAFR或肺炎球菌菌落。总的来说,这些数据表明,鼻PAFR表达肺炎球菌曝光之前直接影响后续鼻殖民。事实上,在研究Cundellet al。(21),衰减的肺炎球菌感染呼吸道PAFR拮抗剂与减少鼻殖民化了90%以上。因为肺炎球菌疾病在人类之前是无症状的殖民统治(27),我们推测,表达式的PAFR上呼吸道是临床相关。为什么尼古丁自由ECV老鼠模型中没有影响尚不清楚,但这可能是由于其较低的OP和含有尼古丁ECV相比。第三个限制是,反映我们当地vap人口,只招收男性。因此不能排除鼻腔反应的性别差异。最后,我们没有研究ECV的影响在其他细菌的粘附拉拢PAFR坚持人类细胞包括non-typeable流感嗜血杆菌(28,29日),鲍曼不动杆菌(30.),和一些菌株铜绿假单胞菌(31日),奈瑟氏菌属meningitides(32]。
总之,这项研究支持了假设ECV增加PAFR-dependent肺炎链球菌粘附上下气道上皮细胞。定期vap的影响肺炎球菌呼吸道感染的风险仍有待确定。
补充材料
披露的信息
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确认
作者的贡献如下。研究和设计概念:l . Miyashita r .苏瑞,尼尔,r·范·Zyl-Smit a Kadioglu和j .感谢;数据采集:l . Miyashita e·迪林高产Mudway,右眼鸽子和湄尼尔;数据分析:l . Miyashita r .苏瑞·e·迪林高产,尼尔,a Kadioglu和j .感谢;数据解释:l . Miyashita尼尔,a Kadioglu和j .感谢;文稿起草和修订:l . Miyashita尼尔,r·范·Zyl-Smit a Kadioglu和j .感谢。所有作者看到和批准了最终稿。j .感谢担保为这些数据。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:伦敦大学玛丽皇后,在利物浦大学的工作是由MRC项目资助(先生/ PO11284/1)授予Kadioglu。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
利益冲突:披露可以找到与这篇文章www.qdcxjkg.com
- 收到了2017年8月4日。
- 接受2017年11月20日。
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