文摘
流行病学研究已经涉及肺部炎症急性心血管事件的危险因素,但底层机制连接肺损伤与心血管事件在很大程度上是未知的。
我们的目标是开发一种新型的小鼠模型的急性肺部炎症和动脉粥样硬化斑块破裂相关研究在这一过程中中性粒细胞的作用。
脂多糖(LPS);3 mg·公斤−1)或生理盐水(控制)直接灌输进入肺部的男性载脂蛋白E-null C57BL / 6 j小鼠后8周的西式饮食。24小时后,会在正确的头臂动脉干稳定性进行评估体外使用高分辨率的光学投影层析成象和组织学。68%的老鼠LPS-exposed发达脆弱的斑块,特点是intraplaque出血和血栓,与12%的saline-exposed小鼠(p = 0.0004)。斑块不稳定性检测早在8 h post-intratracheal有限合伙人滴剂,但不是与腹腔滴注法。损耗的循环中性粒细胞减少斑块破裂。
我们已经建立了一个新颖的斑块破裂模型相关肺损伤引起的气管内的有限合伙人。在这个模型中,中性粒细胞发挥重要作用在肺部炎症和斑块破裂。这个模型可以用作筛选治疗靶点,防止急性血管事件相关肺部炎症。
文摘
中性粒细胞中扮演重要角色相关的动脉粥样硬化斑块易损性LPS-induced肺部炎症http://ow.ly/Y7dWW
介绍
肺损伤和炎症被认为是主要的触发急性心血管事件(1]。例如,急性呼吸道感染和重型暴露空气污染增加缺血性心脏病的风险、心肌梗死或中风的2到4倍(2- - - - - -7]。大多数急性心血管事件源于破裂和血栓形成粥样斑(或不稳定)的脆弱。脆弱粥样斑、独立的大小的特点是薄,肿大坏死”核心(非细胞空间通常被脂质),炎症细胞浸润增加肩区域和地区斑块完整性的丧失造成的出血或微血管渗漏1]。相比之下,稳定粥样斑有厚帽,一个更小的坏死核心和炎症细胞的减少。因此,它们形态健壮和可能破裂。粥样斑虽然普遍认为脆弱来自稳定的,目前尚不清楚如何(或者即使)急性肺部炎症诱发这种转变。的一个主要障碍的调查这个至关重要的过渡已经缺乏可靠的动物模型,证明粥样斑块破裂。在小型啮齿动物,粥样斑块往往非常稳定,很少展示弱点没有外部操纵。在这项研究中,我们建立了一个新的小鼠模型,使用一次性的脂多糖(LPS)灌输直接进入肺部通过气管促进粥样斑稳定的过渡到脆弱的(诱导斑块破裂),确定循环中性粒细胞促成这种转变。
材料和方法
进一步的细节发表在在线补充材料。
动物和研究设计
男性载脂蛋白(ApoE E-null老鼠−−/)对C57BL / 6 j背景(股票编号:002052;美国杰克逊实验室,巴尔港,我)从猪油吃西式饮食含有21%的脂肪和0.15%胆固醇(TD88137;哈伦实验室Inc .,麦迪逊,美国WI) 8周诱导动脉粥样硬化斑块形成的头臂动脉干(BCT) (8]。这些老鼠被随机分为三组:1)有限合伙人(n = 28);2)盐(n = 20);和3)西式饮食控制(n = 6)。实验计划中说明了图1一个。LPS组,单一剂量的100µg有限合伙人(大肠杆菌O111: B4;3 mg·公斤−1)(L2630;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),溶解在50µL无菌生理盐水,是喷洒气溶胶粒子(16 - 22µm质量中值直径)直接进入肺部通过声带使用微灌(msa - 250 m;Penn-Century Inc .)位于宾州怀因特摩尔市,宾夕法尼亚州,美国)。生理盐水组,单一剂量的50µL无菌生理盐水喷洒气溶胶进入肺部以同样的方式(9,10]。有限合伙人的剂量和时间决定基于一个试点研究(在线补充图S1a)。本研究通过英属哥伦比亚大学的动物保护委员会(a06 - 1494;a10 - 0257)。
中性粒细胞减少体内抗体注射
确定中性粒细胞在斑块破裂的作用在这个模型中,我们给小鼠腹腔内两次注射1)鼠anti-mouse Ly6G克隆1 a8抗体(BE0075-1;X细胞生物,西方黎巴嫩,美国NH)耗尽循环中性粒细胞(LPS-neutrophil损耗(ND)组;n = 15);或2)鼠IgG2A同形像克隆2 a3抗体(BE0089;生物X细胞)作为控制(LPS-ctrl;n = 14)。第一剂量LPS挑战前24小时,其他剂量后立即给出了有限合伙人的挑战(图1 b)。每个剂量(400µg)在400年被稀释µL无菌PBS (11]。为了调查如果自己注射抗体诱导斑块的脆弱性,我们包括额外的比较器组有限合伙人(不接触),包括1)小鼠的腹腔内注射免疫球蛋白抗体非特异性控制作为控制(ctrl;n = 4)和2)小鼠腹腔注射与特定anti-Ly6G抗体,neutrophil-specific抗体对照组(ND);n = 5)。
调查通过气管内的早期动脉粥样硬化不稳定的路线和腹腔内有限合伙人的接触途径
来确定早期斑块的变化,我们在8 h后评估斑块形态1)气管内的有限合伙人暴露(LPS-IT;n = 16)或2)气管内的盐水暴露(saline-IT;n = 14)。确定的路线有限合伙人滴注法修改响应的斑块,另外两组使用:1)腹腔内接触有限合伙人(LPS-IP;n = 5)和2)腹腔内盐水暴露(saline-IP;(n = 5)12]。LPS-IP组100µg有限合伙人的无菌生理盐水溶解在50µL直接注入腹腔内空间。saline-IP组,50µL使用无菌生理盐水(图1 c实验设计)。相同的麻醉程序被用于它和IP组。
器官和组织采购和支气管肺泡灌洗
在麻醉下(异氟烷吸入5%),血液收集使用25从下腔静脉导管针(ProtectIV +;史密斯医疗国际有限公司,英国Rossendale) 24小时后对细胞因子和化学测量有限合伙人挑战。心脏和血管的直接采购血液采集后进行。心脏,主动脉弓及分支动脉包含BCT收获很仔细,灌注3毫升的PBS直接注入左心室注入速度1毫升·分钟−1(美国哈佛装置,Holliston, MA)。支气管肺泡灌洗(BAL)收集的液体洗肺一次600µL PBS。左肺收获,与400µL 10%福尔马林灌注25而言不啻的压力2O为组织学。肺外器官,包括肝脏和肾脏也收获和苏木精和伊红())部分被用于形态学检查。
光学投影层析成象
想象的斑块体外没有令人不安的斑块,光学投影层析成像(选择)(Bioptonics 3001;MRC技术、伦敦、英国),使整个主动脉弓的三维成像和旅级战斗队的老鼠13,14]。斑块被蒙蔽的方式评估和斑块被认为是脆弱的,如果有一个可见血栓或出血的证据在这些斑块(> 0.0005毫米大小3)。血栓和红细胞产生了不同的自发荧光信号强度大于10倍的动脉壁,使体积量化阈值分割。选择的细节,请参阅在线补充材料。
定量组织学和脆弱的斑块的定义
关联选择的结果与组织学图像,整个旅级战斗队的连续横断面图,被嵌入在石蜡(或最佳切削温度复合和液态氮冷冻)染色使用)和Movat pentachrome染色,在显微镜下检查15]。脆弱的斑块被定义的存在血栓或intraplaque出血。Intraplaque出血时指出有红细胞内动脉粥样化在至少两个连续的部分间距为50µm。的形态学分析的细节,请参阅在线补充材料和在线补充图印地和c。
Immunofluorescent染色和信号定量
详情参考在线补充材料。
评价:肺部炎症细胞计数在落下帷幕
离心后,细胞颗粒球流体与PBS resuspended,轻轻地混合cytospun到载玻片和固定染色之前与甲醇)和Wright-Giemsa污渍。多形核细胞(中性粒细胞)数量除以获得颗粒成相等的四象限,然后从每个象限四个随机领域使用图像Pro软件(媒体控制论Inc .,罗克维尔市,医学博士,美国)在400×放大(16]。多形核白细胞形态被评估他们的大小、形状、multinucleation和颗粒的存在。单核细胞和肺泡巨噬细胞也由形态决定的。测量值的算术平均值是用于统计分析。一个自动化血细胞总数血球计也用来证实BAL液体和血液细胞计数。
评估系统性炎症:血清细胞因子
血清样本用来测量单核细胞趋化蛋白1,角化细胞化学引诱物,白细胞介素- 6和肿瘤坏死factor-α使用Luminex MagPix(美国马EMD微孔,Billerica)和鼠标多路检测装备,根据制造商的协议。
血浆LPS测量和血液化学测试
有限合伙人的血浆浓度测定在重复使用商用动态比浊鲎变形细胞溶解产物分析工具包(Lonza Walkersville,医学博士,美国)根据制造商的协议。血浆样本heat-inactivated然后稀释1:50 0 10毫米氯化镁溶液中,使积极的产品控制在50 - 200%恢复。血浆尿素和肌酐、乳酸脱氢酶、白蛋白、碱性磷酸酶、总胆红素、天冬氨酸转氨酶,丙氨酸转氨酶和γ-glutamyl转肽酶测量使用ADVIA 1800临床化学系统(西门子、德国慕尼黑)。
统计分析
所有的结果都表示为±sd,除非另有指示。数据分析使用确切概率法(用于比较两个独立的团体之间的破裂发生率),t(用于比较的两个独立的团体正态分布)和Mann-Whitney U-tests(用于比较两个独立的团体,不是正态分布)。克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来比较两个以上的独立组织当变量的分布是不正常的。所有进行了分析使用棱镜5 (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国),p值< 0.05(双尾)被认为是具有统计学意义。
结果
动脉粥样化形成ApoE−−/基线和LPS-induced炎症
形态学测量动脉粥样化在8周后的旅级战斗队的西式饮食S1在线补充表所示。这些老鼠不断发达粥样斑块旅级战斗队,以内膜的增厚,泡沫细胞积聚,坏死核心和一顶帽子(在线补充图印地)。没有脆弱的斑块显示组织学特性(出血或血栓)在有限合伙人或盐水。直接滴注法的有限合伙人进入肺部动脉导致小鼠肺中性粒细胞炎症(在线补充图S2a和b)和系统性炎症的特点是高促炎细胞因子(在线补充图S3)。
血栓和intraplaque出血检测中使用选择LPS-exposed老鼠
所示图2,高分辨率选择显示血栓的三分之二的LPS-exposed老鼠(在线补充视频S1),但在这三个saline-exposed老鼠(在线补充视频S2)。血栓主要坐落在边缘的斑块和扩展到主动脉弓(在线补充视频S3)。此外,我们发现出血在斑块和缺乏鲁米那三分之一的LPS-exposed小鼠血栓(在线补充视频S4),但这些表型观察saline-treated老鼠(所有的老鼠)。
定量和斑块易损性的描述
我们使用串行组织学量化脆弱斑块旅级战斗队的横截面。这表明17(68%)的25 LPS-exposed老鼠怀有脆弱的斑块,含有intraplaque出血或血栓(的组织学特征图3)。8 (32%)LPS-exposed老鼠了腔的血凝块或血栓,这大多是位于边缘的斑块。9 (36%)LPS-exposed小鼠出血动脉粥样化内显示。斑块并发症总结在网上补充图S4。相比之下,只有两个(12%)的17个saline-exposed控制老鼠(图3 d)证明intraplaque出血和这些动物怀有斑块包含血栓(p = 0.0004有限合伙人与生理盐水组)。
动脉粥样化的形态学数据所示表1。意味着帽厚度(相对于斑块厚度)LPS-exposed老鼠大约是三分之一,saline-exposed老鼠(13±10%与39±26%,p = 0.0004)。坏死核心LPS-exposed老鼠的大小是saline-exposed老鼠的两倍(36.9±12.9%与18.6±11.8%,p = 0.0004)。然而,整个斑块的大小(101±41×10 LPS-exposed老鼠3µm2)没有明显不同的老鼠比saline-exposed (78±34×103μm2,p = 0.102)。
中性粒细胞减少和斑块易损性的描述
我们脆弱的斑块特征的旅级战斗队LPS-ND和LPS-ctrl团体用组织学和选择(图4)。总之,10(71.4%)的14 LPS-ctrl老鼠怀有脆弱的斑块,含有intraplaque出血或血栓的组织学特征。相比之下,只有四个(26.7%)的15 LPS-ND老鼠怀有脆弱斑块(p = 0.0268) (图5)。进一步斑块特征图S5a在线补充和b所示。5(35.7%)的14 LPS-ctrl老鼠了腔的血凝块或血栓。类似于之前的发现,这些并发症大多位于边缘的斑块(在线补充图S5c)。8(57.1%)的14 LPS-ctrl小鼠出血动脉粥样化内显示。相比之下,只有两个(13.3%)的15 LPS-ND老鼠证明intraplaque出血(p = 0.0209),只有两个(13.3%)的这些动物怀有斑块,血液凝块。代表BCT LPS-ctrl图片和LPS-ND在线补充视频中演示了老鼠S5;代表斑块组织学证实图5 b。LPS-exposed老鼠neutrophil-specific抗体处理降低了斑块易损性被选择(LPS-ND与LPS-ctrl, p = 0.0042) (图5度)。有限合伙人没有挑战,非特异性控制的注射免疫球蛋白抗体和抗体neutrophil-specific没有诱导斑块漏洞或改变斑块表型(零的斑块破裂,4点至5点)(在线补充图S5d)。Immunofluorescent髓过氧化酶(MPO)表明,MPO的染色+多形核细胞局部边缘和核心地区LPS-ctrl斑块的老鼠,但明显减少斑块LPS-ND老鼠(图5 d和在线补充图S5e-g)。
中性粒细胞招聘在肺部和循环白细胞计数
没有有限合伙人的曝光,控制注射非特异性免疫球蛋白抗体或抗体neutrophil-specific到老鼠没有诱导肺中性粒细胞入渗(在线补充图S6a)。在有限合伙人,中性粒细胞肺入渗的观察;嗜中性粒细胞计数在球在有限合伙人和LPS-ctrl集团持续升高(在线补充图S2)。然而,它被注射neutrophil-specific显著减毒抗体(LPS-ND组与LPS-ctrl组,p = 0.0002)。巨噬细胞数量在球保持一致的抗体对照组没有和存在的有限合伙人(在线补充图S6b)。管理neutrophil-specific抗体明显减少了循环嗜中性粒细胞计数的有限合伙人(LPS-ND组0.10±0.06与LPS-ctrl组0.8±0.5×109·L−1;Mann-Whitney试验p = 0.0021)。血液中的淋巴细胞和单核细胞计数LPS-ND和LPS-ctrl组之间没有显著差异,或ND和ctrl组。各个组的白细胞计数S2在线补充表所示。
的早期阶段斑块不稳定的8 h通过气管内的但不是腹腔途径有限合伙人滴注法
探讨早期动脉粥样硬化不稳定的,我们检查了斑块在旅级战斗队8 h post-intratracheal有限合伙人滴剂使用解剖显微镜和选择。8 h,有证据显示斑块易损性的旅级战斗队(LPS-IT: 8/16与saline-IT: 1/14, p = 0.017)。所示图6和b在旅战斗队,血栓和出血被检测到。脆弱性信号随机选择的旅级战斗队(11 LPS-IT老鼠与10 saline-IT老鼠)是用数量来表示。LPS-IT组表现出显著的信号比saline-IT组(p = 0.04)。然后,我们调查是否能找到相似的变化通过注射相同剂量LPS腹腔内。没有显著差异的发生腹腔内有限合伙人之间脆弱的斑块滴剂和盐水控制(LPS-IP: 1/5与saline-IP 0/5;p = 1.0)。LPS组(它和IP)展示了高血浆LPS水平与生理盐水对照组相比。有趣的是,血浆LPS水平增加17 000倍LPS腹腔内注射时,但同样的剂量气管内的血浆LPS水平增加40倍(图6 c)。注射小鼠腹腔内有限合伙人还演示了较高的血浆乳酸脱氢酶和尿素水平相比,小鼠暴露于气管内的有限合伙人(图6 d)。球细胞计数数据显示中性粒细胞和巨噬细胞计数LPS-IP和saline-IP组之间没有显著差异;然而,LPS-IT组的人表现出较高的中性粒细胞计数(在线补充图S6c和d)。循环白细胞计数显示非常相似的模式在气管内的路线和腹腔内的有限合伙人(在线补充图S7)。在一起,这些数据表明,气管内的管理LPS诱导肺中性粒细胞炎症,但导致系统性吸收和降低肝脏和肾脏损伤与腹腔内有限合伙人。重要的是,气管内的有限合伙人滴剂(但不是腹腔内注射)促进稳定的斑块过渡到脆弱的这个模型。
讨论
我们发现一个气管内的有限合伙人管理引起的动脉粥样硬化斑块在24 h的接触变得脆弱。8 h post-instillation,脆弱的斑块显示特征包括出血和血栓形成,这可能是检测和量化的使用选择。然而,政府同样的剂量LPS腹腔内未能诱发这些急性变化,尽管导致血清LPS水平和更大的上涨更多的终末器官损害肝脏和肾脏。这些发现强调肺部炎症和损伤的重要性在急性斑块破裂的发病机理。此外,我们发现,选择性耗尽的循环中性粒细胞气管内的有限合伙人暴露前预防斑块脆弱性和破裂,表明中性粒细胞扮演着一个关键角色,斑块漏洞引起的肺损伤的发病机制。我们的研究结果是一致的的概念中性粒细胞炎症在动脉急性心血管事件(17]。假设,在心血管疾病中,中性粒细胞激活,招募到冠状动脉释放azurophilic(初级)颗粒,放大原始炎症信号。在这项研究中我们已经通过实验验证的重要性,中性粒细胞在斑块破裂急性有限合伙人暴露所致的肺部炎症有关。
我们的研究有几个优势。人们普遍认为的一个早期斑块变化导致急性心血管事件是脆弱的稳定斑块的过渡,以出血其次是破裂和血栓形成。然而,这个序列的机制(s)事件的发生在很大程度上是未知的。机械的研究和治疗的主要障碍的发现在这个领域一直缺乏一个简单的动物模型的斑块破裂。为了解决这个关键的差距,先前的研究已经使用多种介入方法使用手术(例如通过创建串联狭窄动脉(18])或药物(如。血管紧张素ⅱ直接注入到plaque-containing动脉(19])或长期与高脂肪饮食喂养8]。在这个实验中,不同于以往的研究,关注长期的因素,我们利用了强大的肺损伤和急性心血管事件之间的流行病学联系,证明了单一剂量的气管内的(但不是腹腔内)有限合伙人可以一直导致稳定斑块变得脆弱和诱发急性斑块破裂。此外,不同于以往的研究,仅仅依靠组织学证明斑块破裂,我们选择使用,一部小说体外影像工具,不需要组织切片,从而保留了船的架构。这种技术使高分辨率、器官/组织的三维成像。也可以结合包埋immunofluorescent染色技术研究特定分子的分布在器官和组织。通过这项新技术结合组织学结果,我们提供令人信服的证据表明,急性肺损伤导致斑块破裂。这部小说模式现在可以用于确定机械的途径,最重要的是,测试新化合物以防止急性斑块破裂有关急性肺部炎症。
我们使用有限合伙人作为方便引发诱导肺损伤和炎症,模拟急性肺部感染革兰氏阴性细菌。未来的研究应该探索更常见的人类病原体,如呼吸道病毒或细菌,这将提高该模型的应用和generalisability临床条件。然而,换来的可能是一个更复杂的肺部炎症模型和主机可能很难描述完全响应。有趣的是,LPS腹腔内接种没有诱导斑块破裂,这表明系统性炎症反应引起的肺损伤可能是唯一的对其下游对血管的影响。这个概念需要进一步评估。
在这个模型中我们发现循环中性粒细胞贡献LPS-induced急性不稳定斑块破裂。这是超出了本研究评估的范围下游分子直接负责斑块破裂。根据一些初步实验,我们推测,MPO和下游金属蛋白酶可能是重要的因素在这一过程中(在线补充图S4f) (20.- - - - - -30.),但还需要更多的研究来确定精确的分子途径导致急性斑块不稳定的和破裂。还应该指出的是,我们没有确定介质负责中性粒细胞的激活和招聘LPS刺激后斑块。需要进一步研究来解开这个过程的分子基础。
尽管有这些限制,本研究建立了一个新的小鼠模型的肺接触有限合伙人会导致肺部炎症和急性斑块不稳定的原因。此外,我们表明,在这个模型中中性粒细胞导致斑块不稳定的。这个模型中,特别是当加上选择成像技术,可以是一个有用的工具询问可能的治疗靶点,以防止急性斑块不稳定,从而减少心血管发病率和死亡率的负担相关肺损伤(31日]。
确认
感谢王习近平(心肺创新中心,不列颠哥伦比亚大学和圣保罗医院,温哥华,加拿大)动物实验的技术援助和大卫·格兰维尔(心肺创新中心,病理学和实验室医学部门,不列颠哥伦比亚大学和圣保罗医院),帕斯卡Bernatchez(心肺创新中心部门麻醉学,药理学和治疗,不列颠哥伦比亚大学和圣保罗医院)和Hye-Yun公园(肺和危重病医学,医学部门,三星医疗中心Sungkuynkwang大学,首尔,韩国)有用的反馈和建议。我们感谢尼古拉白和阿龙Hendel提供有用的评论形态测量学,克莱尔史密特和她的转基因模型团队协助准备伦理应用程序和设备安排,安穆立特谋求协助组织处理和瑞秋陈为援助immunofluorescent成像(心肺创新中心,英属哥伦比亚大学和圣保罗医院)。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:这项工作是由加拿大首席研究员计划支持和加拿大卫生研究院的研究。数字数据罪是一个一级加拿大研究主席在慢性阻塞性肺疾病。光学投影层析进行高通量Phenogenomics中心的英属哥伦比亚大学(哥伦比亚大学),一个设施在加拿大创新基金会的支持下,不列颠哥伦比亚省知识发展基金会,哥伦比亚大学牙科学院。
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本www.qdcxjkg.com
- 收到了2015年6月19日。
- 接受2016年1月25日。
- 版权©2016人队