文摘
囊性纤维化的缺氧环境航空公司允许兼性厌氧细菌的持久性,它可以通过发酵产生短链脂肪酸(SCFAs)。然而,SCFAs的相关性在囊性纤维化肺病是未知的。我们表明,SCFAs出现在囊性纤维化患者的痰样本在毫克分子浓度(意味着±扫描电镜1.99±0.36毫米)。
SCFAs积极与痰中性粒细胞计数和高SCFAs一氧化氮受损生产预测。我们研究的影响SCFAs乙酸、丙酸和丁酸气道炎症反应使用上皮细胞系和原代细胞培养。SCFAs在浓度出现在囊性纤维化航空公司(0.5 - -2.5毫米)集落刺激因子的释放,影响粒细胞集落刺激因子和白介素6 (IL)。SCFAs也导致更高的引发释放刺激囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道F508del-mutant野生型相比CFTR-corrected支气管上皮细胞。丙酸在25毫米减少引发释放控制但不是主要囊性纤维化上皮细胞。低(0.5 - -2.5毫米)SCFA浓度增加,而高(25 - 50毫米)浓度降低诱导一氧化氮合酶表达。此外,SCFAs生长的影响铜绿假单胞菌在一个浓度和pH-dependent方式。
因此,我们的数据表明,SCFAs导致囊性fibrosis-specific改变的呼吸道感染和炎症反应。
文摘
短链脂肪酸有助于CF-specific改变的呼吸道感染和炎症反应http://ow.ly/L7ZI9
介绍
囊性纤维化肺病的特点是慢性炎症的反复和持续感染某些病原体的航空公司(1]。粘液积聚导致炎症和感染,以及维持一个低氧环境(2]。许多典型的囊性纤维化病的病原体,包括金黄色葡萄球菌,流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌,是兼性厌氧菌3]。最新进展在肺部微生物宏基因组分析进一步揭示了囊性纤维化的主要存在专性厌氧物种的航空公司(4,5),但这些物种在囊性纤维化肺病的临床意义尚不清楚。
在厌氧细菌代谢收益在缺乏氧气。发酵的碳水化合物和氨基酸产生短链脂肪酸的形成(SCFAs)如醋酸(CH3首席运营官−)、丙酸(C2H5首席运营官−)和丁酸(C3H7首席运营官−在丰裕的降序排列。在大肠中,可以找到SCFAs浓度从30到150毫米(6]。这些代谢物调控多种功能包括肠上皮内稳态、能源供应、炎症、调节t细胞发育和微生物多样性7,8]。
我们提出,在囊性纤维化肺病SCFAs发挥作用,特别是在炎症反应和主机防御假单胞菌感染。我们的气相色谱法测量检测到毫克分子浓度SCFAs囊性纤维化患者的痰了。因此,我们评估了SCFAs对炎症的影响在一个肺泡上皮细胞系(A549),囊性纤维化支气管上皮细胞系和初级囊性纤维化的细胞培养和控制。我们还研究了SCFAs的成长的影响铜绿假单胞菌菌株。我们发现SCFAs在囊性纤维化痰液浓度测量影响气道上皮细胞的炎症反应和生长的铜绿假单胞菌。
方法
痰液样本
囊性纤维化患者痰液样本来自如前所述[9]在儿童医院(多伦多,加拿大)依照研究伦理委员会的批准(儿童医院;1000019444)(10]。样本来自临床稳定的患者,以及患者肺恶化之前和静脉注射抗生素治疗后2周。看到表1对病人的特点。
坚实的粘液栓治疗痰样本处理0.1% Sputolysin(二硫苏糖醇、Calbiochem体态,加拿大)在水9]。单一化痰然后离心机和上层清液冻结在未来分析−80°C。
短链脂肪酸气相色谱
痰液上层清液过滤30 kDa超滤设备(缝匠肌或微孔Vivaspin;缝匠肌,米西索加、加拿大或Amicon超;微孔,体态,加拿大)。上层清液过滤然后使用甲酸酸化,掺入了内部标准,2-methylbutyric酸。挥发性化合物的酸化滤液被蒸馏减压和液氮温度下,溶解在超纯水和注入气相色谱装置与火焰电离探测器。样本SCFA浓度计算基于一个标准曲线SCFAs分析以相同的方式。
细菌培养和紧张
细菌培养从甘油库存保持在−80°C或从单一的殖民地选择trypticase大豆琼脂板上。铜绿假单胞菌菌株PAO1和PA508(实验室的尼尔·B的礼物。Sweezey,The Hospital for Sick Children) were cultured in trypticase soy broth (TSB) at 37°C for all experiments. Bacteria were grown overnight in TSB at 37°C and 225 rpm shaking, and further diluted in TSB modified with different concentrations of SCFAs or other chemicals (sodium acetate, sodium propionate, sodium butyrate and sodiuml乳酸)和pH值调整到7.0,6.5,6.0和5.5与盐酸。微型板块阅读在一个ω板阅读器(BMG Labtech、卡里、数控、美国)的光学密度在600海里。进行分析、空白TSB-corrected光密度读数被正常化pH-matched TSB控制每个时间点。microaerobic条件,板密封使用光学清晰PCR实验电影开始的时候。由于凝结的电影,光密度在600 nm,减去通过光学密度在800海里。
细胞系和文化
人类adenocarcinomic肺泡基底上皮细胞A549,囊性纤维化41 o-immortalised支气管上皮细胞从一个纯合子患者F508del囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)等位基因转染F508del CFTR (CFBE)或野生型检测向量(corrCFBE)被用于这项工作。A549和CFBE细胞培养在v / v 10%胎牛血清的DMEM(写到Bioproducts,圣布鲁诺,加拿大)和4.5 g·L−1葡萄糖,110 mg·L−1丙酮酸钠,2毫米谷酰胺,100台·毫升−1青霉素、链霉素在37°C和5%的公司2。CFBE corrCFBE细胞培养和µg·300毫升−1潮霉素B。
主要人类支气管上皮细胞获得控制或囊性纤维化捐赠者从主气道细胞生物(瞿麦吉尔大学、蒙特利尔,加拿大),在支气管上皮生长培养基培养。人类支气管上皮细胞培养在支气管上皮生长培养基含有10%的牛血清白蛋白,µg·50毫升−1庆大霉素,100台·毫升−1青霉素、µg·100毫升−1链霉素和250µg·毫升−1两性霉素b细胞通过一次达到80 - 90%的融合交汇,之后培养,直到90%,随后用于实验过程。
Cytomix刺激
A549, CFBE corrCFBE或主要人类支气管上皮细胞被播种在12——或者24-well盘子和增长到70 - 90%融合。盘子被洗,补充血清媒体和孵化的24 h。细胞培养1 h和各种SCFAs cytomix之前(10 ng·毫升−1每个人白介素(IL) 1β,肿瘤坏死因子(TNF) -α和干扰素(IFN) -γ)刺激和进一步孵化指定时间。SCFA浓度选择基于范围在结肠内腔(10 - 50毫米)和囊性纤维化航空(0.1 - 5毫米),和先前的研究。
免疫印迹
样本在硝化纤维膜电泳和转移。膜是孵化anti-inducible一氧化氮合酶(间接宾语)或anti-glyceraldehyde 3 -磷酸脱氢酶抗体(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)和anti-rabbit辣根过氧化物酶共轭二次抗体(Santa Cruz)。增强化学发光底物(热,米西索加、加拿大)直接添加到每个膜和使用射线照相胶片开发柯达X-Omat 2000处理器(美国公司温莎)。
细胞因子分析
细胞培养上清液对细胞因子进行分析使用Milliplex工具包(微孔)根据制造商的协议。引发浓度测量使用商业酶联免疫试剂盒(PeproTech,落基山,新泽西,美国)。
扩散/可行性分析
细胞增殖化验,被播种在5×104细胞·毫升−1在96 -孔板和1 h SCFAs孵化,然后孵化24 h PrestoBlue试剂根据制造商的协议(分子探针,伯灵顿,加拿大)。评估可行性,细胞增长到80 - 90%融合在96孔板与SCFAs孵化。
统计程序
统计分析了使用Microsoft Excel(美国WA雷德蒙)或GraphPad棱镜5 (La Jolla、钙、美国)。痰SCFAs,未配对和非参数t进行配对,以及线性回归相关分析。对于细菌生长数据,重复测量方差分析进行Dunnett紧随其后的测试后对缓冲控制比较增长曲线。对所有其他人来说,未配对进行了非参数t。假定值< 0.05,对于所有的测试被认为是显著的。
结果
SCFAs囊性纤维化患者的痰
SCFAs囊性纤维化患者痰液中发现了毫克分子浓度(图1一个)。在临床稳定的主题,意味着(范围)总SCFA浓度是1991µM(821 - 4064年µM)。与囊性纤维化患者肺恶化,意味着(范围)总SCFA浓度抗生素治疗2周后治疗注射。µM抗生素1280µM(158 - 4570)和873年µM(166 - 4178年µM),分别为(图1)。意思是总SCFA浓度稳定的患者相比,治疗后显著降低(p = 0.0076使用Mann-Whitney紫外线测试)。尽管SCFA浓度降低对于大多数9(7)抗生素治疗后的患者,这种减少是统计学无意义的(图1)(n = 9, p = 0.2031使用Wilcoxon配对测试)。
中性粒细胞的数量痰是囊性纤维化气道炎症的标志。痰中性粒细胞数呈显著正相关,总SCFAs稳定患者(图1 b)(n = 10, r2= 0.8743,p < 0.0001),但不是患者的肺恶化之前(n = 9, r2= 0.0055,p = 0.85)或抗生素治疗后(n = 9, r2= 0.1999,p = 0.2276)。
气道一氧化氮(NO)曾被证明是减少囊性纤维化没有呼出和痰氮氧化物(NOx)增加后抗生素治疗囊性纤维化肺急性加重(11,12]。总SCFAs患者治疗前抗生素相关负面痰没有褶皱的变化x抗生素治疗后(图1c) (n = 7, r2= 0.7493,p < 0.05),表明高SCFA浓度痰用抗生素治疗之前阻止气道没有预期增产。然而,没有SCFAs和褶皱变化之间的相关性在抗生素治疗后痰引发浓度(图1d) (n = 9, r2= 0.0004,p = 0.9605)。
SCFAs调节气道上皮细胞的炎症反应
SCFAs已被证明对肠道上皮细胞起到支持或抗炎作用,取决于他们的浓度(13- - - - - -16]。调查的影响SCFAs气道和肺泡上皮细胞的炎症反应,刺激细胞的混合IL-1β,IFN-γTNF-αSCFA预处理后。主要由A549细胞因子分泌肺泡基底上皮细胞集落刺激因子(gm - csf), IL-1α,il - 6 (图2一个- - - - - -c)和引发(数据未显示)。Pre-incubation SCFAs调节生产gm - csf和IL-1α,和更少的il - 6,浓度的方式。有趣的是,尽管所有SCFAs 0.5 5毫米调节gm - csf和IL-1α生产,在25毫米醋酸导致调节gm - csf, IL-1α和il - 6 (图2a - c)。
囊性纤维化航空展览持续炎症环境和一些细胞因子包括gm - csf、il - 1、il - 6,引发,IFN-γTNF-α出现在囊性纤维化航空在高浓度17,18]。因此,我们下一个检查的影响SCFAs CFBE细胞的炎性概要文件(19),最常见的囊性fibrosis-causing白种人的突变(1),转染向量overexpressing F508del-CFTR。控制我们使用相同的细胞系转染与向量overexpressing野生雌性生殖道(corrCFBE) [20.]。类似于A549细胞,结果SCFAs在0.5 - -2.5毫米,特别是丙酸,增加gm - csf和粒细胞(G)脑脊液生产cytokine-stimulated corrCFBE细胞,但不是在CFBE细胞(图3和c),而丙酸调节il - 6在两个细胞系(图3 b)。在0.5毫米醋酸降低il - 6表达CFBE但不是corrCFBE细胞。乙酸的混合(0.5毫米),丙酸(0.1毫米)和丁酸(0.005毫米)也导致增加il - 6和g - csf corrCFBE细胞(图3 b和c,APB低)。相比之下,引发的生产,粒细胞招募中发现高浓度的关键细胞因子在囊性纤维化航空公司,是调节的0.5 - -2.5毫米醋酸刺激CFBE但不是在corrCFBE细胞(图3 d)。
在初级气道上皮细胞,我们发现高表达下调gm - csf(25毫米)丙酸浓度、il - 6和g - csf在囊性纤维化和non-cystic纤维化控制细胞有或没有cytomix刺激(图4- - - - - -f)。相比之下,低(0.5毫米)丙酸浓度调节g - csf在刺激囊肿性纤维化而不是控制细胞(图4 f),在对比发现CFBE细胞。我们还观察到25毫米丙酸减少引发主要控制但不囊性纤维化细胞,在缺乏细胞因子刺激(图4 g)。SCFAs并不影响引发的生产与控制或囊性纤维化细胞因子刺激细胞,可能是由于基底细胞因子刺激后引发水平较高(图4 h)。
接下来,我们检查了上皮细胞炎性细胞因子刺激下伊诺表达。有趣的是,低浓度(0.5 - -2.5毫米)SCFAs增加伊诺上面A549细胞表达细胞因子刺激仅在早期(4 h和8 h)(在线补充无花果S1a b和S2a b)和后期(24小时)时间点(图5- - - - - -c和无花果就是S1c S2c)。相比之下,在更高浓度(25 - 50毫米),类似于以前在肠道的健康受试者报告,结合个人SCFAs或SCFAs显著降低细胞因子诱导伊诺表达式(图5和无花果S1和S2)。伊诺的表达在如果没有A549细胞并不是由丁酸(调节图5)或乙酸/丙酸(数据未显示)。我们无法检测转染伊诺的囊性纤维化细胞系(CFBE或corrCFBE)之前或之后细胞因子刺激,与先前的报道(21]。在non-cystic纤维化的主要文化气道上皮细胞,表达伊诺SCFA孵化和细胞因子刺激类似于A549细胞(图6)。在刺激主要囊性纤维化上皮细胞,伊诺蛋白表达检测,但相比,控制细胞减少。重要的是,和符合发现在A549和non-cystic纤维化控制细胞,表达伊诺在囊性纤维化的主要细胞进一步减少到检测不到的水平高(25毫米)丙酸治疗,但是低(0.5毫米)丙酸导致增加伊诺表达式(图6)。
因此,我们的数据表明,SCFAs调解的重要生产和进气阀打开上皮细胞炎性细胞因子表达的变化,和囊性纤维化上皮细胞反应不同SCFA敞口比non-cystic纤维化细胞。
SCFAs改变铜绿假单胞菌的生长
Psuedomonas绿脓杆菌是兼性厌氧菌,可以产生SCFAs [22]。自SCFAs的存在可能会影响细菌的新陈代谢,我们问是否SCFAs影响的增长铜绿假单胞菌。在这些在体外实验中我们观察到一个二分浓度SCFAs对细菌生长的影响。在高浓度时,丙酸(图7)、乙酸和丁酸(在线补充无花果S3和S4)抑制铜绿假单胞菌增长≥6 h。相比之下,我们发现低浓度SCFAs导致增强细菌生长,尤其在mid-log阶段的增长。囊性纤维化气道分泌物已经被证明有微酸性pH值(23),尽管这种观点是有争议的24]。作为SCFAs有更高比例的质子化了的物种在酸性条件下,他们通过膜扩散是极大地增强了(7]。因此我们还测试了细菌生长条件不同的博士发现,在pH值下降有均匀降低细菌生长与SCFA孵化(图7)。我们使用实验室铜绿假单胞菌应变PAO1这些实验,观察到类似的结果与临床分离PA508(在线补充图S5和数据未显示)。
囊性纤维化痰是缺氧的环境,我们试图确定SCFAs的影响铜绿假单胞菌在这种情况下成长。我们发现SCFAs造成明显的生长抑制作用,放大pH值较低,相比,整体增长大大减少有氧条件(在线补充图S6)。我们得出这样的结论:SCFAs改变的生长假单胞菌菌株浓度和pH-dependent的方式。
讨论
这是第一个研究定量评估中存在SCFAs囊性纤维化患者的呼吸道分泌物。痰SCFA浓度被发现在毫克分子范围内临床稳定的患者和那些展示肺恶化。抗生素治疗导致减少SCFA水平在大多数,但不是所有的痰样本,表明细菌导致的短链脂肪酸水平痰。然而,随着痰SCFA水平在治疗肺恶化之前没有从临床稳定的病人,其他因素也可能导致SCFAs在航空公司。这些可能包括定量和定性的差异气道微生物,细菌代谢活动,气道炎症的程度,以及不同个体的治疗方法。然后,我们研究了影响SCFAs培养气道上皮细胞的炎症反应。而高浓度的丙酸和丁酸A549细胞增殖,减少他们没有影响他们的生存能力(在线补充图S7)。我们的研究结果表明,SCFAs可以影响气道上皮细胞的炎症反应,可能导致正常和囊性纤维化气道炎症之间的区别。我们发现高(25 - 50毫米)的浓度SCFAs增强诱导的炎性细胞因子如gm - csf和il - 6在A549和corrCFBE细胞,而低(0.5 - -2.5毫米)乙酸的浓度调节引发CFBE但不是corrCFBE细胞。在原代细胞培养、高(25毫米)的浓度SCFAs non-cystic纤维化抑制引发生产控制,但不是在囊性纤维化气道上皮细胞,这表明SCFAs可能导致增加引发的水平,它是囊性纤维化气道炎症的特点(17]。
有趣的是,早期的研究调查的影响丁酸及其导数4-phenylbutyrate药理拯救F508del-CFTR发现,与我们的结果一致,4-phenylbutyrate(6 - 10毫米)对CFBE促炎症效应细胞(CFBE41o,也用在这项研究中,和IB3-1细胞)通过上调引发(25,26]。然而,在我们的研究中没有的短链脂肪酸浓度之间的相关性肺恶化引发或抗生素治疗后引发的变化,也没有相关性的变化前后的短链脂肪酸浓度抗生素治疗引发的变化或抗生素治疗后引发的水平,说明SCFAs可能导致但不影响引发个体的主要因素的水平。SCFA-mediated细胞因子的变化从上皮细胞培养生产表明SCFAs可能导致受损的决议的中性粒细胞炎症和加剧了持久性。这是支持的短链脂肪酸浓度之间显著正相关,在囊性纤维化痰中性粒细胞总数。除了对细胞因子水平的影响,SCFAs可以导致中性粒细胞趋化性,可能因此对气道嗜中性(也有直接影响27]。需要更大规模的研究来进一步阐明SCFAs之间的联系和气道炎症在囊性纤维化。
伊诺的表达,一种重要的酶生产的活性氮物种,保护受损在囊性纤维化气道上皮细胞21,28,29日浓度),没有航空公司的囊性纤维化患者通常下降(30.,31日]。然而,抗生素治疗急性肺发作可能导致改进伊诺表达式(32和气道没有生产11,12囊性纤维化。变化没有新陈代谢恶化与改善治疗后肺功能(10,33];因此,其他更直接的策略来改善气道没有生产在囊性纤维化正在接受调查34,35]。我们这里显示SCFAs可以影响伊诺浓度的方式表达在肺泡和气道上皮细胞在体外。在A549细胞,正常控制和主要囊性纤维化上皮细胞培养,低浓度增强cytokine-stimulated伊诺表达式。相比之下,高浓度明显废除伊诺表达A549以及主要控制和囊性纤维化上皮细胞。虽然不清楚对伊诺表达的影响是直接或由炎症反应的变化,SCFAs及其衍生物曾被证明能够直接抑制活化的核factor-κB伊诺转录的关键调节器(26,36]。SCFAs在航空公司的存在可能导致失调的NOS在囊性纤维化航空公司,这是由我们的观察,低浓度的这些细菌代谢物在痰液的囊性纤维化患者预测增加气道没有抗生素治疗后在我们的小群体。
铜绿假单胞菌是一种投机取巧的病原体,经常会导致慢性囊性纤维化呼吸道感染。扩展先前的研究在SCFA-mediated抑制增长假单胞菌物种在体外(37),我们比较低和高的影响SCFAs毫克分子浓度和pH-dependent性质的影响铜绿假单胞菌增长。我们发现,虽然高毫克分子浓度增长受损,与先前的报告(37,38)、低毫克分子浓度提供了短暂的增加增长在mid-log阶段。铜绿假单胞菌经济增长普遍减少SCFAs的存在降低pH值。此外,我们确认这些SCFA microaerobic条件的影响。这是可以想象的,SCFAs可能影响铜绿假单胞菌生物膜的形成,但这不是在这些研究调查。在一起,因此,我们的研究结果表明,SCFAs行为对主机加剧炎症反应和殖民细菌增加他们的增长。这些发现也可能是其他厌氧肺感染的相关性如积脓症或肺脓疡,SCFAs也可检测和与积极的厌氧细菌培养(39]。
最近,出现了激增的兴趣SCFAs出版的一些报告关于SCFAs和他们的角色在维护结肠调节性T (Treg)细胞8,40]。这些研究表明,无菌鼠SCFAs不足,也缺乏亚群,粪便提取物诱导Foxp3无菌或antibiotic-treated老鼠不佳+亚群在体外。丁酸盐被确认为生成亚群,这种影响尤其重要Ffar2端依赖(8]。之间的平衡辅助(Th) 17细胞亚群与炎症密切相关和宽容在小肠41]。Th17途径主要是唤起嗜中性粒细胞的响应,这是特别有趣的背景下普遍嗜中性发现在囊性纤维化肺病18,42]。鉴于肠道的粘膜环境的相似性和肺部,这将是重要的调查SCFAs是否可以调节Th17 / Treg轴在囊性纤维化航空公司(43]。细胞特定类型FFAR2和其他SCFA受体的表达模式航空公司仍然不清楚,但他们的说明可以提供洞察SCFA活动的机制和目标细胞群。
总之,我们的数据表明,SCFAs在囊性纤维化患者痰液中浓度产生囊性fibrosis-specific影响气道上皮细胞炎症反应,诱导伊诺和铜绿假单胞菌增长。还需要进一步的研究来更好的描述这些分子在囊性纤维化气道炎症的作用,了解是否在囊性纤维化SCFAs痰可以用作标记的厌氧细菌活动或预测反应抗菌治疗。
确认
我们感谢Kervan Rivera-Rufner(营养科学部门,多伦多大学,多伦多,加拿大),Darakhshanda Shehnaz和海驴黄(研究所、儿童医院、多伦多)为优秀的技术援助。我们感谢David n Douda(布莱根妇女医院和哈佛医学院波士顿,MA,美国),海伦娜Obernolte,阿明布劳恩和凯瑟丽娜Sewald(弗劳恩霍夫项目,汉诺威,德国)有益的讨论。我们感谢克里斯汀•贝尔(儿童医院研究所)提供囊性纤维化上皮细胞系和尼尔·b·Sweezey(儿童医院)提供临床分离的铜绿假单胞菌。主要人类支气管上皮细胞和细胞培养媒体提供的囊性纤维化的主要气道细胞生物转化研究中心麦吉尔大学(加拿大蒙特利尔,),由加拿大囊性纤维化。我们承认Hailey Craig-Barnes生物活性分子的分析工具的复杂儿童疾病的研究中心(CSCCD)儿童医院(多伦多,加拿大),对多路复用ELISA服务。支持的CSCCD是加拿大创新基金会(渥太华,加拿大)。部分的手稿发表的硕士论文的一部分Peyman Ghorbani作为一个抽象的欧洲呼吸学会2012年年会(奥地利维也纳)。188bet官网地址
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:本研究得到了琳和阿诺德·欧文基金会和囊性纤维化中心儿童医院(多伦多,加拿大;2014 CF催化剂研究中心资助)。n Palaniyar支持加拿大囊性纤维化(格兰特2619)。p . Ghorbani支持部分由安大略研究生奖学金。为这篇文章一直存放在资助信息FundRef。
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本www.qdcxjkg.com
- 收到了2014年8月5日。
- 接受2015年3月30日。
- 版权©2015人队