摘要
肺部疾病的早期症状脓肿分枝杆菌囊性纤维化(CF)患者可遗漏MABSC。血清学方法有助于根据危险程度对患者进行分层。本研究的目的是测试一种新方法的诊断准确性,以调查抗MABSC的IgG活性。
对哥本哈根CF中心的所有患者进行了一项前瞻性研究,在22个月的时间内培养MABSC,然后用抗MABSC IgG ELISA筛查患者。培养阳性患者储存血清,在培养转换前后检测抗体动力学。
307例患者3480份呼吸道标本培养后,用抗mabsc IgG ELISA检测。MABSC肺部疾病患者抗MABSC IgG水平中位数比无感染史患者高6倍(434与64个ELISA单位;p < 0.001)。检测灵敏度为95% (95% CI 74 ~ 99%),特异性为73% (95% CI 67 ~ 78%)。构建了一种诊断算法,根据风险对患者进行分层。
该测试准确地识别了由MABSC引起的肺部疾病患者,适合用于分枝杆菌培养的补充。
摘要
测量抗体脓肿分枝杆菌能否确定对健康构成这种新威胁的患者http://ow.ly/LlRYw
简介
非结核分枝杆菌(NTM)肺部感染是囊性纤维化(CF)患者的诊断和治疗挑战[1].脓肿分枝杆菌复合物(MABSC)是欧洲CF患者中NTM的主要形式,新的证据表明发病率增加、人际传播和对肺功能的有害影响重新激发了人们对这些普遍存在的分枝杆菌的兴趣[2- - - - - -4].MABSC的发病机制还没有被很好地理解,但这是一个研究重点,因为可能存在根除的机会窗口[5]或压制[6]在感染的早期阶段。
虽然现在大家一致认为结核分枝杆菌在资源有限的环境下最好避免血清学[7,8]之后,血清学在结核病研究的其他部分找到了一席之地,例如在阐明对分枝杆菌感染的免疫反应方面。大多数血清学结核病研究都把重点放在使用纯化抗原(如卡介苗抗原)的检测上[9,10或其他单一抗原[11],但越来越多的推荐方法是使用不同抗原的组合[12- - - - - -14].
CF患者一生都被密切跟踪,使用血清诊断作为常规培养的补充可能会有好处,就像抗体对抗铜绿假单胞菌而且曲霉属真菌已在许多CF中心成功使用[15- - - - - -19].已有报道称此类测定方法的预测价值存在局限性[20.],目前的抗体测量铜绿假单胞菌在临床上与培养结果结合使用,而不是作为单独检测[21].在整个CF人群中测量抗mabsc IgG可以指导临床医生决定他们在进行分枝杆菌培养时必须有多警惕。两项研究确实证明了使用抗原A60对CF人群分枝杆菌血清诊断的潜力[22,23].
本研究的目的是开发一种检测血清中抗mabsc IgG的多抗原酶联免疫吸附试验(ELISA),并测试其诊断准确性。我们的研究对象是一组同质且筛选良好的CF患者队列。我们假设抗mabsc IgG水平与疾病严重程度相关,因此可以开发一种有用的临床应用。这项研究分两部分进行。首先,我们描述了2012-2014年在哥本哈根CF中心(哥本哈根,丹麦)通过痰培养前瞻性筛查MABSC的CF患者的抗体血清学。其次,我们跟踪MABSC病例,描述MABSC培养转换开始前后的抗体动力学。
方法
患者与环境
哥本哈根CF中心照顾100名CF儿童和216名CF成人。自1968年该中心建立以来,CF患者每4周在门诊接受一次微生物和临床检查。在访问期间,在临床数据库中登记临床参数。每年至少收集一次用于抗体测定的血清样本,并在- 20°C保存,以供进一步研究。目前的研究得到了丹麦首都大区卫生研究伦理委员会(H-3-2012-098)和丹麦数据保护局(2007-58-0015)的批准。丹麦首都大区卫生研究伦理委员会批准豁免患者书面同意的要求。
设计与包容
2012年5月在哥本哈根CF中心注册的所有CF患者都符合条件。从2012年5月到2014年2月,患者在成人和儿科门诊就诊期间连续登记,并入住CF病房。2013年10月至2014年2月期间,每名患者采集一份血清样本进行抗mabsc IgG检测。在此之前死亡或接受肺移植的患者被排除在外。截至2014年2月,根据NTM培养结果和患者记录的临床资料,将患者分为三组:A组为血清采样时的MABSC肺疾病患者(MABSC- pd);B组为既往有mabus - pd但未现患的患者和既往或现有其他NTM感染的患者;C组为无已知NTM感染史的患者,包括培养结果阴性和本研究前无NTM培养结果的患者。一组健康的非cf受试者(成人和儿童)被纳入正常参考人群(D组)。
MABSC病例的纵向研究
我们将ELISA方法应用于从1987年起所有既往或正在发生MABSC的患者先前储存的血清样本。肺移植患者在MABSC感染前、中、后的抗体动力学分析中未被排除。
NTM疾病分类
CF中心采用美国胸科学会(ATS)及美国传染病学会(IDSA)的标准对NTM患者进行分类[24].在这项研究中,我们使用术语mabus - pd来描述符合ATS/IDSA肺部疾病的临床、放射学和微生物学标准的患者。我们将mabus - pd清除定义为培养转化为阴性后12个月的培养阴性(基于至少四种独立的mabus -阴性培养)。
呼吸道样本和分离物
采集痰标本或喉吸标本伯克不过根据前面描述的方法,使用选择性琼脂作为培养基[25].第一批阳性样本被转移到Statens血清研究所(哥本哈根,丹麦)的国际分枝杆菌参考实验室,在那里通过InnoLipa种(InnoGenetics,根特,比利时)和/或使用高可变区a引物进行16S DNA测序进行MABSC鉴定。随后的分离株用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间)进行局部控制,并进行抗生素敏感性测试。在疑似新NTM物种的情况下,分离株再次转送参考实验室。纵向研究也依赖于1987年至2012年的NTM培养数据,这些数据根据之前详细描述的方法收集[26].
ELISA方法
分枝杆菌抗原制备按C损失et al。[27在网上的补充材料中有详细的描述。ELISA检测抗mabsc IgG水平,该方法由我们实验室先前描述的方法改进而来[15,28],并在ELISA单位中表达。试验阳性阈值采用受试者工作曲线(ROC)确定。对来自10例患者的样本进行双测定(盲法),覆盖抗体滴度从高到低的光谱,并使用变异系数表示。临床数据提取自患者档案和丹麦CF登记处。
统计方法
基线数据以非正态分布连续变量的中位数和四分位区间(IQR)和分类变量的百分比报告。组间比较采用Kruskal-Wallis非参数检验和Dunn多重比较检验。p值≤0.05认为有统计学意义。使用SPSS 19.0版本(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)和GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)进行数据分析。
结果
研究设计流程图如图所示图1.哥本哈根CF队列包括316例患者,其中307例纳入研究。在2012年5月至2014年2月期间,对这些患者进行了3480例NTM培养。每个患者的平均培养次数为11(范围1-23)。在2013年10月至2014年2月期间,所有307例患者都采集了一份血清样本。B组36例既往有MABSC- pd病史(n=11)或目前有MABSC感染但不符合ATS/IDSA标准(n=11),其中14例既往或现有MABSC病史鸟型分支杆菌复杂。2014年2月患者和健康非cf对照的特点见表1.
不同组的抗体水平
MABSC-PD患者的抗mabsc IgG中位数是B组患者的4倍m . avium复杂或非pd型MABSC (p=0.03),是无NTM病史的CF患者的6倍(p<0.001) (图2)。健康、非cf对照组的IgG水平最低,95%的受试者显示抗体值<77个ELISA单位。在MABSC- pd组中未观察到MABSC亚种差异(数据未显示)。B组间差异无统计学意义。
试验的可重复性
板内、每日和板间变化测量值分别为5%、16%和11% (IQR分别为3-9%、10-27%和5-14%)。
MABSC病例的纵向研究
从1987年到2010年,哥本哈根CF患者的NTM发病率稳定,每年新增1.1例MABSC培养阳性病例(范围0-3)。从2010年到2014年,MABSC病例数量上升到每年6.7例(范围4-9例)。图5显示26例符合MABSC- pd标准的MABSC患者和6例仅一次MABSC培养阳性的患者首次培养阳性前后抗MABSC IgG水平。
26例患者中有11例在第一次阳性培养前IgG呈阳性。这11例患者中的大多数(9例)在2012年筛查较少的情况下被发现为MABSC培养阳性。值得注意的是,其中4例患者的第一次MABSC培养阳性也是第一次NTM培养阳性。7例(27%)患者在培养转换前抗体滴度升高,尽管之前的NTM培养呈阴性,提示诊断有不同程度的延迟。总的来说,85%发展为mabus - pd的患者在培养阳性前后抗体急剧增加,证实了该测试的诊断潜力。其中3人的抗体水平缓慢上升,在被分类为mabc - pd的3年内没有达到125个ELISA单位的截止值。大多数只有一次MABSC培养阳性的患者没有变成IgG阳性(图5b)。
清除感染
7例患者在清除前接受了广泛的抗微生物治疗,其中2例还进行了肺移植。5例(56%)患者IgG水平下降和清除时间有明显重叠(±12个月),定义为至少4种培养阴性12个月。两名患者的抗体仍呈阳性,尽管持续培养阴性,并有临床和放射学迹象显示疾病进展停止(图5c)。
讨论
这项研究是迄今为止对CF中抗NTM抗体的最大检查。其主要优势是在同质CF队列中的前瞻性设计,每月筛选一次。
主要发现
抗mabsc IgG在MABSC-PD患者中显著升高,该测试显示出良好的诊断准确性。对已知MABSC病例的纵向测量显示,早期抗体反应的模式表明明显的诊断延迟,提示有可能早期干预。每位患者平均进行11次培养,并进行相应的临床评价,从而降低了验证偏差的可能性[29].通过使用27年前储存的血清样本,MABSC病例研究可以纵向可视化抗体反应动力学,为回顾性评估MABSC- pd发病机制提供了一个独特的机会。我们构建了一个诊断算法,利用检测交叉反应性和低特异性在CF环境中是一个可以忽略的问题,在CF环境中,培养总是跟随血清学。研究的不足之一是1987-2011年期间分枝杆菌培养技术和筛选程序的变化,这可能会混淆这一时期NTM的总体发病率。关于验证,板内和板间的变化是良好的(分别为5%和11%)。每日变化为16%,可归为可接受。所有生物标志物测定都具有固有的分析变异性,范围从5%到20%不等[30.].受试者体内随时间的变化也存在差异,每日ELISA变化<20%表明有足够的可重复性[31].
需要改进诊断措施
CF人群中MABSC的上升值得关注,需要新的诊断措施。我们的研究小组最近发现,在斯堪的纳维亚的CF患者中,只有不到三分之一的反复MABSC培养的患者能够清除感染,多达四分之一的患者接受了肺移植或死亡[26].尽管越来越多的人认识到mcuus - pd的潜在致病性,但诊断原则基本没有改变,其固有障碍也是如此。连续两次痰培养可能需要相当长的时间,培养失败是常见的,通常是由于材料不足或革兰氏阴性菌过度生长或曲霉属真菌.此外,CF患者的放射病理是非特异性的[24].
分枝杆菌免疫学试验
在资源受限的环境中,对分枝杆菌的免疫检测是不合适的,在这种环境中,过度诊断患者的风险相当大[7,32].结核菌素皮肤试验(TST)和后来的干扰素-γ释放试验已在结核病发病率低的高收入国家广泛使用[33,34],并在通过金标准(培养)选择患者进行进一步检查时找到了一席之地,要记住TST的敏感性较低,而且受卡介苗接种的影响,而干扰素-γ释放试验只对以前未接触结核病的患者敏感。CF人群的情况与上述两种情况有根本不同。CF患者暴露于NTM的风险很高,结核风险可忽略不计,一生都受到密切关注,每年例行进行一次NTM培养,不使用商业上可获得的干扰素-γ释放测定法,它不能检测出与CF相关的NTM [35].CF的一个主要临床挑战是避免新发m脓肿- pd病例的诊断延误,因为这些患者最有可能从及时治疗中获益。正是在这种情况下,分枝杆菌的血清学诊断重新成为CF研究的兴趣领域肝et al。[22]显示,在4例CF和NTM患者中,抗分枝杆菌种间抗原A60的IgG抗体升高。Ferroniet al。[23]在一项186名CF患者的研究中使用了相同的商用测试,发现15名masm - pd患者的IgG滴度是144名无NTM患者的6倍。来自307名受试者的结果同样显示了IgG水平的6倍差异,尽管应该注意的是,应用的单位不同,我们使用的是IgG值的中位数,这被认为在分析小群体的倾斜分布时更合适。
诊断的延迟
我们对MABSC病例的纵向研究揭示了早期抗体反应的模式,指示着显著的诊断延迟。米artiniano等.[6]之前的研究表明,在第一次NTM阳性培养前1 s内的低用力呼气量与后续感染是否具有临床意义相关。作者避免猜测所涉及的因果关系是肺功能差导致对NTM的易感性增加,还是相反,未检测到的NTM本身导致在第一次分离前的一年里肺功能下降(诊断延迟)。我们对抗mabsc IgG动力学的研究支持后一种假设,即NTM本身更有可能是肺功能不良的原因。在培养阳性之前抗体水平的上升提示明显的感染,尽管临床上未发现。
风险算法的有效性
血清学筛查可通过选择性提高高危患者的诊断警觉性来加快诊断。铜绿假单胞菌血清学已被证明是支持临床决策的有用临床工具[15,17- - - - - -19].该原则有其局限性[20.,21],治疗决定不应基于铜绿假单胞菌单看抗体水平,因为抗体对某些抗原的反应可能会延迟[17].此外,诱导的抗体反应可能由于免疫记忆而持续存在,这一原理在疫苗学领域得到了很好的描述。在本研究中,我们提出了一种风险算法,可以选择性地增加MABSC感染风险最高的CF患者的分枝杆菌培养频率。该算法需要在大型多中心队列研究中进行验证,才能推荐用于常规临床应用。常规培养仍然是金标准,是MABSC感染的最终诊断所必需的。然而,每年的血清筛查可以根据风险对患者进行分层,使临床医生能够很容易地区分需要加强观察的患者和可以等待常规年度培养的患者。首先进行血清筛查,然后进行培养,这一序列可以实现高敏感性(血清学)和随后的高特异性(培养)的最佳结合。这解释了我们选择相对较低的阳性阈值(125个ELISA单位)进行IgG筛查的原因。当截断400个ELISA单位时,可以获得较高的阳性预测值,而截断125个ELISA单位的优势是将假阴性率(5%)降到最低。阳性预测值的权衡是可以接受的,因为抗体筛查后总是要进行培养。 Applying the algorithm to our MABSC-negative population, 73% were IgG negative, resulting in no clinical consequence, 23% had intermediate values between 125 and 400 ELISA units, warranting two to four annual NTM cultures, and just 4% were high-risk patients who would be subjected to monthly NTM culturing. With a positive likelihood ratio of 13 for patients with anti-MABSC IgG >400 ELISA units, the test fulfils the prerequisites of a useful diagnostic test for this purpose [36].Ferroniet al。[23]表明,使用A60测定法制造商推荐的截止点会导致低灵敏度(80%),但通过应用他们自己的截止点可以在一定程度上提高(到86%)。我们有意将临界值设得较低,以实现高灵敏度(95%)和排除疾病(低风险患者)的能力。这在我们中心是一种合理的方法,但MABSC抗体检测的最佳使用可能取决于环境。区分真正的疾病与单纯的定植已被宣布为NTM管理中最重要的挑战之一[1],任何疾病进展的客观标记都有助于进行这一区分。该测试是否有其他用途,如监测MABSC患者的治疗效果,还有待观察。当然,补充的疾病监测方法是有需求的,因为目前没有根除MABSC的良好指标。文化转换是必要的,但其本身并不足以停止治疗,而且已知在停止治疗后会复发[37].MABSC治疗方案负担过重,听力损失和肾毒性是最可怕的不良事件[37].因此,欢迎任何有助于减少不必要的长期治疗的指标。
结论
CF合并MABSC- pd患者抗MABSC抗体水平显著升高。抗mabsc IgG筛查被证明是一个有用的诊断工具,可以帮助临床医生识别需要更频繁分枝杆菌培养的CF患者,从而减少诊断延迟的问题。
确认
作者要感谢哥本哈根囊性纤维化中心的工作人员以及Lena Lingren Nørregaard和Ulla Rydahl Johansen(丹麦哥本哈根Rigshospitalet临床微生物学系)提供的出色技术支持。
脚注
本文的补充资料可从www.qdcxjkg.com
支持声明:本研究由Rigshospitalet研究委员会、哥本哈根囊性纤维化中心和丹麦哥本哈根Rigshospitalet临床微生物学系资助。大卫·泰勒-罗宾逊受到医学研究理事会人口健康科学家奖学金(G0802448)的支持。本文的资助信息已存入FundRef.
利益冲突:可以在本文的在线版本中找到相关信息www.qdcxjkg.com
- 收到了2015年1月22日。
- 接受2015年3月17日。
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