摘要
金黄色葡萄球菌已发展成为医院和社区环境中肺炎的重要原因。葡萄球菌肺部感染可导致严重的肺部炎症。在感染期间,中性粒细胞释放骨髓相关蛋白(MRP)8和MRP14 (MRP8/14)复合物。MRP8/14已被证明发挥促炎和趋化活性,并协助杀死金黄色葡萄球菌.在目前的研究中,我们试图确定MRP8/14在宿主反应中的作用金黄色葡萄球菌肺炎
通过鼻内接种1×10诱导野生型和mrp14缺陷小鼠(不能形成MRP8/14的小鼠)肺炎7CFU的金黄色葡萄球菌USA300。分别于感染后6、24、48、72 h处死小鼠进行分析。
金黄色葡萄球菌肺炎与支气管肺泡灌洗液和肺组织中MRP8/14的强烈升高有关。令人惊讶的是,MRP14缺乏对细菌清除的影响有限,并与支气管肺泡灌洗液中细胞因子水平升高和肺组织病理学加重有关.此外,MRP14缺乏还与感染后晚期中性粒细胞向支气管肺泡灌洗液的转运减少以及核小体释放减少有关。
MRP8/14在葡萄球菌肺炎中对肺起意想不到的保护作用。
摘要
MRP8/14意外保护小鼠葡萄球菌肺炎过度肺部炎症http://ow.ly/IwYt6
简介
在过去的几十年里,甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)已发展成为医院感染的最重要原因,包括医院获得性肺炎和呼吸机相关肺炎[1,2].近年来,与社区相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的毒力菌株也出现了,在没有公认危险因素的情况下,在个体中引起感染[1,3.].虽然这些菌株主要与皮肤及软组织感染有关,但也可能引起较严重的临床表现,例如暴发性坏死性肺炎[3.- - - - - -5].事实上,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的下呼吸道感染具有急性起病期,可导致严重的肺部炎症,从而导致器官损伤和高死亡率[4- - - - - -7].渐进性抗生素耐药性可能使葡萄球菌肺炎在未来成为更大的健康威胁[1],敦促有必要更多地了解可能影响这种疾病结果的宿主防御机制。
急性金黄色葡萄球菌感染与多种促炎机制相关,以大量招募中性粒细胞进入肺实质[8,9].除吞噬入侵微生物外[10]时,这些细胞被刺激释放构成性可用的内源性分子(也称为警报素),这些分子被模式识别受体识别,并能够延续炎症反应[11].这些警惕性蛋白包括骨髓相关蛋白(MRP)8和MRP14的复合物(MRP8/14称为钙保护蛋白)[12].细胞外MRP8/14诱导多种先天免疫反应,包括增强细胞因子释放通过toll样受体(TLR)4对脂多糖的反应[13]和白细胞招募[14,15].
除了促炎作用外,MRP8/14还利用其金属螯合特性减少感染环境中的微生物生长[16].最近的研究表明,MRP8/14通过锌和锰的结合抑制葡萄球菌的生长和毒力[16- - - - - -18].相应地,MRP8/14缺乏的小鼠在静脉注射后表现出防御功能受损金黄色葡萄球菌注射(17,18].中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)可能促进MRP8/14的抗菌特性[19].我们最近证明,在NETs中阻断MRP8/14,减少了net介导的葡萄球菌生长抑制在体外[20.].
在目前的研究中,我们研究了MRP8/14在实验诱导的葡萄球菌肺炎的炎症和细菌清除中的作用。为此,我们使用了野生型和mrp14缺陷型(mrp14−−/)感染了社区相关MRSA菌株(USA300)的小鼠通过航空公司。的mrp14−−/尽管MRP8 mRNA水平正常,但小鼠在蛋白质水平上缺乏MRP8,因此MRP8/14缺乏[13].我们假设mrp14−−/小鼠的肺部葡萄球菌清除能力受损,但相关炎症可能减弱。令人惊讶的是,在这里报道的研究中,mrp14−−/与野生型小鼠相比,小鼠肺部的细菌负荷仅表现出最低程度的增强,肺细胞因子水平增强,肺组织病理学加重。
方法
老鼠
C57Bl/6野生型小鼠购自Charles River Laboratories Inc. (Maastricht, Netherlands)。的mrp14−−/如所述,将>回交10次到C57BL/6背景的小鼠生成[21]并在学术医疗中心(荷兰阿姆斯特丹)的动物设施中饲养。的mrp14−−/小鼠在健康状态下未表现出任何异常[21,22].动物实验按照荷兰动物实验法案进行,并得到阿姆斯特丹大学动物保护与使用委员会(DIX100121AB)的批准。
设计
小鼠通过吸入异氟醚(Abbot Laboratories, Queenborough, UK)轻度麻醉,并鼻内接种亚致死剂量1×107金黄色葡萄球菌USA300 (BK 11540)(由爱尔兰都柏林三一学院微生物系Timothy J. Foster提供),50 μl盐水溶液(每个菌株n= 7-8)。这种亚致死剂量是在先前描述的初步研究中确定的[23].在6、24、48或72 h后处死小鼠[23].
血浆样品和匀浆的制备
样本的收集及处理工作如上文所述[24,25].简而言之,将血液抽入肝素化管,获得支气管肺泡灌洗液(BALF),无菌取出器官,并使用组织匀浆器在四卷无菌等渗盐水中均质(Biospec Products, Bartlesville, UK)。为了确定细菌负荷,将10倍稀释液镀在血琼脂板上,在37°C下培养16小时。如前所述,制备肺匀浆用于免疫检测[24,25].
支气管肺泡灌洗
BALF的获得如前所述[23].气管和支气管通过中线切口暴露。左主支气管结扎,气管插管使用22号无菌abbocatath - t导管(Abbott Laboratories,斯莱戈,爱尔兰)。通过灌注3份0.3 mL等份无菌PBS进行单侧右侧BAL。每只小鼠提取0.7 ~ 0.9 mL BALF。使用Z2 Coulter粒子计数和大小分析仪(Beckman-Coulter, Inc., Miami, FL, USA)对BALF中的总细胞数进行计数。用改良吉姆萨染色法(Diff-Quick;Baxter, McGraw Park, IL, USA)。
化验
肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6、角质形成细胞来源的趋化因子(KC)、巨噬细胞炎症蛋白2 (MIP-2)和e-选择素(所有研发系统,Minneapolis, MN, USA)和髓过氧化物酶(MPO) (Hycult Biotechnology BV, Uden,荷兰)根据制造商的建议使用特异性elisa进行测量。MRP8/14 [13]和核小体[26]的测量方法如前所述。
组织学
肺病理评分如前所述[24,25].简而言之,在指定的时间点采集肺,用4%缓冲福尔马林固定,并用石蜡包埋。用苏木精和伊红(HE)染色4µm切片,并由病理学家进行分析,如前所述,对各组进行盲法。为了对肺部炎症和损伤进行评分,对整个肺表面进行分析,并考虑以下参数:支气管炎、水肿、间质炎症、肺泡内炎症、胸膜炎、内皮炎和肺表面融合炎症浸润的百分比。每个参数被分为0 - 4级,0代表“缺席”,4代表“严重”。病理总评分表示为所有参数评分之和。如前所述,使用异硫氰酸荧光素标记的大鼠抗小鼠Ly-6单抗(Pharmingen, San Diego, CA, USA)进行粒细胞染色[27].通过数字图像分析定量肺组织切片Ly-6G的表达[28];Ly-6G阳性的数量表示为总表面积的百分比。肺组织MRP8和MRP14染色如前所述[21].肺组织抗瓜氨酸组蛋白H3 (H3Cit) (Abcam, Cambridge, UK)染色,如前所述[29,30.].
统计分析
数据以盒状和须状图表示,描述最小观测值、下四分位数、中位数、上四分位数和最大观测值。之间的差异mrp14−−/野生型小鼠采用Mann-Whitney u型检验。使用GraphPad Prism 5.0版本(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)进行分析。p值<0.05为有统计学意义。
结果
MRP8/14在葡萄球菌肺炎期间被释放
为了深入了解MRP8/14在葡萄球菌肺炎期间的表达,我们测量了未感染野生型小鼠和鼻内注射101×10的野生型小鼠的BALF、肺和血浆中的MRP8/14浓度7金黄色葡萄球菌.MRP8/14水平在感染后6小时在BALF中检测到,并在疾病过程中升高;72 h后最高(中位9 μg·mL)−1) (图1a).在未感染的全肺匀浆中,MRP8/14水平较低,感染后6小时呈高度升高(中位数为150 μg·mL)−1在24小时)(图1b).血浆MRP8/14水平仅在6小时时轻微升高,此后不久达到基础水平(数据未显示)。
为了深入了解MRP8/14的细胞来源,我们对从幼稚和感染野生型小鼠获得的肺组织切片进行MRP8和MRP14染色。未成熟肺未见MRP8或MRP14染色。感染6小时后,MRP8和MRP14的表达均显著增加,感染48小时后仍然存在(图1C和d)。
MRP14缺乏对金黄色葡萄球菌肺炎的细菌清除影响很小
早期研究表明MRP8/14抑制葡萄球菌生长在体外[16),在活的有机体内[17,18].为了研究MRP8/14在葡萄球菌肺炎期间宿主防御中的潜在作用,我们在感染后6、24、48或72小时收集了BAL液、肺、肝脏和血液,并测定细菌负荷(图2).值得注意的是,MRP8/14缺乏不影响清除率金黄色葡萄球菌从气道到显著程度,虽然在单一时间点(24小时)细菌负担适度,但在统计学上显著,肺匀浆较高mrp14−−/老鼠。在两种小鼠品系的所有时间点,葡萄球菌在所有其他身体部位的负荷相似。这些数据表明,MRP8/14在葡萄球菌肺部感染模型中对细菌清除的贡献最小。
MRP14缺失增强金黄色葡萄球菌肺炎早期细胞因子和趋化因子释放
先前的研究表明,MRP8/14增强骨髓来源的巨噬细胞的促炎反应,这与患者血浆TNF-α水平降低有关mrp14−−/内毒素刺激小鼠[13].为了研究MRP14缺失对葡萄球菌肺炎炎症反应的影响,我们在BALF野生型和BALF野生型中测量了细胞因子(TNF-α, IL-6和IL-1β)和趋化因子(MIP-2和KC)mrp14−−/小鼠感染后不同时间点金黄色葡萄球菌呼吸道(图3a e)。在感染后6小时检测到细胞因子和趋化因子的最高水平,并在疾病过程中下降。令人惊讶的是,mrp14−−/在感染后6和24小时,小鼠显示所有测量的细胞因子和趋化因子水平升高(6小时时TNF-α和KC不显著)。
MRP14缺乏增强金黄色葡萄球菌肺炎的肺部病理
接下来,我们分析了HE染色的肺组织切片,以研究MRP8/14在肺病理中的作用金黄色葡萄球菌肺炎(图4a - c)。根据方法部分描述的评分系统对总组织学评分进行半定量评分。6小时后,所有小鼠都显示出严重的肺部炎症迹象。在这个早期时间点,MRP8/14缺失导致肺病理加重,间质炎症和支气管炎的症状更严重。肺病理评分仍然较高mrp14−−/小鼠感染48 h后,内皮炎、支气管炎及水肿增多。该模型的组织病理学分析与细胞因子数据一致,提示MRP14缺乏增强小鼠肺部炎症金黄色葡萄球菌肺炎
为了进一步了解组织水平的炎症反应,我们测量了全肺匀浆中e -选择素的水平;所使用的检测方法不区分细胞结合型和可溶性e -选择素,当对全肺裂解物进行检测时,可作为内皮细胞激活的读数[31].感染金黄色葡萄球菌导致全肺e -选择素浓度急剧上升,在6小时后达到峰值,随后急剧下降(图4d).值得注意的是,肺e -选择素水平在mrp14−−/与野生型小鼠相比,MRP14缺乏与肺部内皮细胞活化增强有关。
MRP14缺失对中性粒细胞内流和脱颗粒的影响
葡萄球菌性肺炎与中性粒细胞的大量涌入有关,中性粒细胞被认为在先天防御中发挥重要作用[8,9,23].MRP8/14被认为是包括肺炎在内的各种炎症情况下中性粒细胞募集的重要中介因子[14,15].我们用不同的方法研究了中性粒细胞进入肺部的招募。从制备的肺组织切片中Ly-6G阳性细胞数量显示,全肺中性粒细胞数量相似mrp14−−/野生型小鼠在感染后6至72小时(图5而且b).值得注意的是,肺MPO浓度,反映了组织中中性粒细胞的数量和脱肉芽化,在mrp14−−/小鼠直到感染后48小时(图5度).在BALF中,感染后6和24小时,两种小鼠的中性粒细胞数量也相似。然而,在48和72小时,当大部分细菌已经被清除时,mrp14−−/小鼠BALF中中性粒细胞数量明显降低(图5 d).这些数据表明MRP14缺乏对不同肺室中性粒细胞募集和肺过程中脱颗粒的不同影响金黄色葡萄球菌肺炎
MRP14缺失在金黄色葡萄球菌肺炎NETs形成中的作用
早期的调查表明金黄色葡萄球菌是NET发布的强有力的诱导剂在体外而且在活的有机体内[32,33].测定肺中net的释放金黄色葡萄球菌肺炎,我们从野生型和mrp14−−/葡萄球菌感染后的小鼠H3Cit, net的标记物[34].H3Cit染色显示,两种小鼠在肺炎葡萄球菌中均能释放NETs。接下来,我们量化了核小体水平(NET降解产物和NET生物标志物[35])在BALF (图6 b).尽管6小时时细菌和中性粒细胞大量存在,但在两种小鼠品系中几乎没有检测到核小体。24小时,mrp14−−/与野生型小鼠相比,小鼠的核小体水平略高,而在稍后的时间点mrp14−−/与野生型小鼠相比,小鼠的核小体水平降低。
讨论
MRSA肺炎与免疫功能低下患者的高发病率和高死亡率相关[6]以及先前健康、无已知危险因素的个体[4,5].葡萄球菌在下气道感染时可引起过度炎症,这可由警报器延续[11],从而导致肺损伤和疾病严重程度[7].在目前的研究中,我们旨在确定MRP8/14在前列腺癌中的作用金黄色葡萄球菌引起肺炎。虽然MRP8/14已被证明有助于消除金黄色葡萄球菌体外培养[16]以及全身性感染后在活的有机体内[17,18),mrp14−−/令人惊讶的是,老鼠的清除能力几乎没有改变金黄色葡萄球菌从他们的呼吸道。值得注意的是,与我们的假设相反,MRP14缺乏增强了鼻内注射后肺部的炎症金黄色葡萄球菌感染。
人类肺炎与局部和全身MRP8/14释放有关[36,37],这与小鼠肺炎的发现有关肺炎克雷伯菌[20.]或肺炎球菌[14,37].按照目前的模式金黄色葡萄球菌肺炎,血浆和肺部MRP8/14水平也升高。6小时时,MRP8/14在肺匀浆中的快速上升可能是高鼻内剂量的MRP8/14诱导的强促炎刺激的反映金黄色葡萄球菌。支气管肺泡MRP8/14逐渐升高,至少比对照组高20倍克雷伯氏菌肺炎(20.],可能是由于早期大量活化的中性粒细胞涌入后释放的MRP8/14的积累,中性粒细胞是该蛋白的主要来源[38,39].我们之前的研究表明MRP8和中性粒细胞标记物Ly-6G在肺炎球菌感染的肺中有相似的表达[37].
尽管MRP8/14在原发感染部位浓度较高,但在局部细菌控制中似乎作用不大,因为葡萄球菌负荷在很大程度上相似mrp14−−/野生型小鼠。考虑到MRP8/14已被确定为一种抗微生物蛋白,这一发现是值得注意的在体外实验证明葡萄球菌的生长和毒性降低通过锌和锰的螯合作用[16,17];此外,在活的有机体内这些数据的相关性显示在mrp14−−/小鼠表现出增强的细菌生长时,挑战金黄色葡萄球菌静脉注射(17,18].先前已证实MRP8/14在脓肿中大量存在[40]在这些感染环境中具有最大的抗菌潜力[17,18].在我们的肺炎模型中未发生远处脓肿形成。MRP8/14也可能抑制细菌生长通过网络的形成[19,20.].我们之前证明了MRP8/14是net中用于减少的重要抗菌成分金黄色葡萄球菌增长在体外[20.].我们在这里展示了net是在金黄色葡萄球菌感染了两种小鼠的肺部尽管wildtype和mrp14−−/中性粒细胞也有类似的释放net的能力[19,我们观察到核小体(NET生物标志物)水平的增强[35],在BALF的mrp14−−/感染24小时后的小鼠,这可能反映了这些小鼠在这个时间点的促炎状态增强。野生型小鼠在48和72小时核小体水平的增强很可能反映了支气管肺泡间隙中性粒细胞数量的增加。有趣的是,只有当大部分细菌被清除时,核小体水平才会出现。先前的研究已经表明NETosis可能发生在活的有机体内在…面前金黄色葡萄球菌[33].然而,并不是所有的中性粒细胞都能形成net,只有当细菌太大而无法被吞噬时,如。大葡萄球菌聚集物形成后[41].我们推测,接种细菌的很大一部分很容易被中性粒细胞吞噬,因此,中性粒细胞在这个早期时间点没有形成net [41].核小体在晚期疾病中高度存在的事实可能是由于NETosis对不易被吞噬的剩余细菌的反应,以及由于NET降解产物的积累。这些数据表明MRP8/14 (NETs内或外)在葡萄球菌肺炎中具有有限的抗菌作用。
而之前的研究发现MRP8/14在各种病理条件下具有促炎作用[13],我们无法证明MRP8/14在该研究中的作用金黄色葡萄球菌肺炎相反,我们意外地在肺中观察到更高的细胞因子和趋化因子水平和更先进的组织病理学迹象mrp14−−/老鼠。这种促炎表型mrp14−−/考虑到感染后6小时(当所有细菌计数相似时)已经存在许多差异,并且考虑到肺部细菌负荷在24小时时只有非常温和的差异,不太可能用细菌负荷的差异来解释小鼠。这也不能用不同的基线细胞因子和趋化因子水平来解释,因为这些在BALF中与朴素野生型和野生型相似mrp14−−/老鼠(42].最近的研究表明,mrp14−−/小鼠的树突细胞成熟状态增强[43,44],这些成熟的树突细胞会释放更多的细胞因子[44].值得注意的是,树突状细胞有助于细胞因子的产生金黄色葡萄球菌肺炎(45].需要进一步的研究来确定这些免疫细胞在高炎症表型中的可能作用mrp14−−/这个模型中的老鼠。
一些动物研究表明MRP8/14是中性粒细胞募集的中介物[14,15].在目前的研究中,我们发现在感染后6和24小时BALF和野生型和肺组织中中性粒细胞数量相似mrp14−−/老鼠。但在感染后48和72 h;当肺部的大部分细菌被清除后,mrp14−−/小鼠BALF中中性粒细胞数量明显减少,这表明MRP8/14可能在支气管肺泡腔室中发挥吸引中性粒细胞的作用,但在支气管肺泡腔室中缺乏趋化作用mrp14−−/小鼠可能在早期时间点由活菌诱导的其他机制进行补偿。值得注意的是,Ly-6G染色显示,MRP8/14不影响肺组织中中性粒细胞的数量,提示后期BALF中MRP8/14的高水平影响中性粒细胞向支气管肺泡间隙的转运。事实上,考虑到BAL过程引入的稀释因子,BALF MRP8/14水平在感染后48和72小时高于肺组织。尽管全肺中性粒细胞数量相似,肺MPO水平在年增加mrp14−−/小鼠,提示中性粒细胞脱颗粒增强,这可能是继发于炎症状态增强。值得注意的是,在先前的研究中,MRP14缺乏不影响中性粒细胞的活力,也不影响黏附受体的中性粒细胞表达或呼吸爆发[21,22].
先前的研究表明,MRP8/14可增强内皮细胞的激活,如e -选择素水平所示[15,46].因此,我们推断总肺匀浆中e -选择素水平升高mrp14−−/小鼠也可能由于炎症状态的增强。
我们研究的一个局限性是老鼠对金黄色葡萄球菌与人类感染相比,至少部分原因是由于这种细菌无法从小鼠血红蛋白中释放铁[47].为了建立临床肺炎模型,小鼠必须鼻内接种高剂量葡萄球菌[7].因此,将我们的研究结果外推到人类的情况上应该谨慎。此外,我们的研究并没有提供洞察哪种细胞类型驱动的表型mrp14−−/老鼠。虽然中性粒细胞可能是最重要的,但需要进行过继转移和/或骨髓移植研究来获得这方面的证据。虽然前一种方法在小鼠中具有技术挑战性,但考虑到肺泡巨噬细胞的不完全替换,后一种方法可能不太可行[48].
总之,我们在这里记录它金黄色葡萄球菌肺炎与MRP8/14在肺部积聚有关,它促进中性粒细胞转移到支气管肺泡间隙,但在清除气道细菌方面作用有限。MRP14缺乏与肺炎症增强、中性粒细胞脱颗粒和内皮细胞活化有关金黄色葡萄球菌这表明MRP8/14可能在严重肺炎中发挥意想不到的肺保护作用金黄色葡萄球菌肺炎
确认
我们感谢Timothy J. Foster(爱尔兰都柏林三一学院微生物系)金黄色葡萄球菌这些实验中的应变。
脚注
支持声明:这项工作得到了兰德斯坦纳输血研究基金会(项目LSBR 0706)的资助。
利益冲突:没有声明。
- 收到了2014年10月5日。
- 接受2015年1月4日。
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