文摘
年代-Nitrosoglutathione内生气管平滑肌松弛剂。增加气道年代-nitrosoglutathione故障发生在一些哮喘患者。我们要求增加患者气道分解代谢的分子是否从其他哮喘患者临床特征,区分他们。
我们测量年代-nitrosoglutathione还原酶表达和活动在支气管镜检查样本66例严重哮喘研究项目。我们也分析了表型和基因型数据取自该项目作为一个整体。
气道年代-nitrosoglutathione还原酶活性增加哮喘患者(p = 0.032)。然而,只有一个族群的影响并不是这群定义为“严重哮喘的诊断。主题与活动增加年轻,有更高的IgE和早期出现症状。符合之间的联系年代-nitrosoglutathione生物化学和特异反应性:1)白介素13增加年代-nitrosoglutathione还原酶表达和2)科目年代-nitrosoglutathione还原酶单核苷酸多态性以前与哮喘有关的IgE高于那些没有这单核苷酸多态性。气道上皮的表达高于在平滑肌和增加哮喘肺与降低气流的地区。
早发性、过敏性哮喘表型特征,人口增加年代-nitrosoglutathione还原酶的活动。
文摘
哮喘患者增加年代-nitrosoglutathione还原酶活性有早发性哮喘+高度过敏http://ow.ly/AuJ9z
介绍
年代-Nitrosoglutathione (GSNO)是一种内源性硫一氧化氮bond-containing物种(年代-nitrosothiols)作为信号分子和气管平滑肌松弛剂(1- - - - - -5]。Nitrosylating和denitrosylating酶调节的形成和破裂年代-nitrosothiols [4- - - - - -8]。在细胞环境中,年代-nitrosylated蛋白质transnitrosation平衡,减少谷胱甘肽(GSH) (4- - - - - -8]。因此,酶denitrosylation GSNO耗尽年代-nitrosylated蛋白质在一个特定的细胞或隔间。在肺最广泛研究denitrosylating酶GSNO还原酶,也被称为酒精脱氢酶5 (ADH5) [4- - - - - -6,9,10]。
谷胱甘肽,其氧化还原循环伙伴,有助于维持蛋白质硫醇的状态,可通过清除氧化剂或共价可逆结合的谷胱甘肽蛋白硫醇。后者发生在生理条件下,诱导在轻微的氧化应激和被称为年代-glutathionylation (PSSG) [11]。谷胱甘肽可以从蛋白质glutaredoxins (Grx),恢复功能的蛋白质的目标PSSG [11]。它已被证明Kuiperset al。(12)在哮喘患者的痰有增加Grx-1和减少蛋白质年代-glutathionylation。
GSNO和其他的水平年代-nitrosothiols也减少许多轻度哮喘患者的气道粘膜液,和气管内的水平非常低在儿童急性哮喘呼吸衰竭(10,13]。的GSNO reductase-deficient老鼠免受methacholine-induced支气管狭窄(9)和内源性年代β-nitrosothiols防止急速免疫法2肾上腺素能受体激动剂(3]。此外,吸入GSNO减少气道白介素(IL) 4、5、6和-13年,以及其他介质与过敏性气道炎症(5]。事实上,GSNO还原酶基因单核苷酸多态性(snp)与哮喘发病率增加相关特定人类哮喘亚种群(14- - - - - -16]。因此,建议GSNO替代,和/或GSNO还原酶的抑制作用,可以减弱人类哮喘症状(17]。
然而,担心的是,长期的治疗,旨在大幅增加气道的水平年代-nitrosothiols患者中已经正常水平,可以从理论上讲,极易不良后果(18- - - - - -20.]或可能,矛盾的是,增加在高剂量(气道高反应5]。此外,大多数患者有轻度哮喘有正常的气道上皮GSNO还原酶活动的水平(10]。因此,并不是所有哮喘患者应该接受年代-nitrosothiol饱满或GSNO还原酶抑制。在这里,我们的目标是识别GSNO增加还原酶活动的决定因素和哮喘患者的表型特征的族群。根据这些信息,个性化治疗可能设想对于那些最有可能回应。
对严重哮喘个性化哮喘治疗尤为重要。病人应对标准疗法,包括白三烯受体拮抗剂和吸入糖皮质激素,在许多严重哮喘患者(次优21,22]。针对最可能的反应可能会降低成本和毒性的治疗。此外,严重哮喘患者被定义为那些高度尽管有这些症状的治疗;这些病人可能特别受益于医学方法的响应能力怀疑基于临床表型诊断测试和有针对性的治疗。例如,具体建议使用痰嗜酸性粒细胞计数和呼出一氧化氮来指导治疗,以及治疗与ige抗体,甲氨蝶呤、大环内酯物抗生素、抗真菌剂和支气管热成型术提供了国际欧洲呼吸协会/美国胸科学会(ATS)准则定义,评估和治疗的严重哮喘188bet官网地址23]。在这里,我们已经开始接近这种范式通过研究哮喘的表型分组人口增加气道GSNO还原酶的活动。
方法
主题
无烟受试者患有严重哮喘者,以及健康对照组,曾参与严重哮喘的研究项目(SARP)接受先前描述描述程序(21]窗格使用at共识的定义[22]。一个族群接受hyperpolarised氦(HHe-3)磁共振成像(MRI) [24]。并不是所有的受试者接受了所有的测试。机构审查委员会批准的所有程序都在SARP中心,和参与者提供知情同意。
支气管镜检查
成人受试者接受灵活的支气管镜检查BAL和节段船底座沿支气管活检、用我们的方法发表(25]。患有严重哮喘的儿童进行支气管镜检查的临床适应症根据共享样本协议埃默里大学(亚特兰大,乔治亚州,美国)26]。活检石蜡包埋,进行免疫组织化学和苏木精伊红染色。埃默里大学,灌洗液吸气在初始和终端阶段分数(26]。识别——和通风不良的肺部区域,三个主体安排在支气管镜检查接受HHe-3核磁共振;在12 h,活检是在航空公司使用和不通气的缺陷。
细胞培养
主要人类气管平滑肌细胞(对比),隔离在雷诺a . Jr Panettieri实验室是培养如前所述29日]。正常的人类支气管上皮细胞(NHBE) (Lonza Walkersville,医学博士,美国)成长为单层膜,和初级人类支气管上皮细胞种植在气液界面如前所述30.]。囊性纤维化支气管上皮(CFBE41o−)和A549细胞株生长如前所述[19,30.]。
免疫印迹
GSNO还原酶AB (1:1000) (# 11051 - 1 - ap;美国Proteintech集团,芝加哥,IL)和第二合1:10 000用于应用对比,和CFBE细胞。此外,气道的表情证实了使用一个单独的多克隆兔anti-GSNO还原酶AB请捐赠的l .,(美国杜克大学、数控)山羊anti-rabbit二级AB (# 172 - 1019;Bio-Rad Inc .)、大力神、钙、美国)。
免疫组织化学
组织部分与GSNO还原酶免疫印迹AB (1:1000) (# 11051 - 1 - ap;使用二次山羊anti-rabbit Proteintech集团)(1:10 000)在室温下30分钟(# 11051 - 1 - ap;Proteintech集团)和ABC试剂(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)在室温下30分钟,如前所述[19,得分从0(缺席)到4(强烈的染色)由两个观察者对诊断也不清楚。
SNP基因分型和评估
的ADH5DNA的基因型是Human1M-Duo BeadChip (Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。哈迪温伯格平衡测试的质量控制。
统计分析
通过单变量分析,我们研究了GSNO还原酶活性和危险因素之间的关系。界或非参数秩和检验是用于连续变量的两个示例比较,Fisher精确检验是分类变量,用于两个示例比较和方差分析被用于分类变量超过两类。p < 0.05被认为是具有统计学意义。在SAS统计分析进行了9.2 (SAS研究所Inc .卡里,数控,美国)。
结果
主题
我们研究了52个成年人(健康对照组(n = 12,哮喘者n = 25日和严重哮喘n = 15)和14个孩子(健康对照组(n = 2,哮喘者n = 6,和严重的哮喘n = 6) (表1)。这些受试者参与SARP进入五个不同的网站。通过特定场地协议子集的受试者进行了具体的程序(活检,支气管肺泡灌洗(BAL)和/或MRI)。巴尔斯进行正确的中部叶或海豆芽。除了由核磁共振,活检是主支气管,第三或第四代船底座侧球的网站。基因分析是另外914名哮喘受试者和344名对照上执行从网站获得参与SARP。
GSNO还原酶活性
我们测量GSNO还原酶活性在54 BAL细胞溶解产物(严重哮喘患者n = 16,哮喘者n = 25日和控制n = 13)。总体平均值没有三组之间的差异;假定值是不重要的(ns)。有一个分组人口44%的哮喘患者> 7.5 nmol·最小水平−1·μg−1蛋白(比控制在哮喘,p = 0.032) (图1一个)。我们进行免疫印迹九BAL GSNO还原酶在群样本(n = 1,控制严重的n = 1,和n = 7)者。之间存在弱一致性在气道GSNO还原酶活动的措施与肺泡灌洗样品(n = 11, r2= 0.61)(图1 bBAL GSNO之间和c)和还原酶表达和活动(r2= 0.54)(图1 c与以前的报告(),它是一致的10]。活动没有随BAL细胞计数,微分或其他参数。
组织GSNO还原酶的表达
接下来,我们研究了GSNO还原酶组织表达随机支气管活检(即。不是由HHe3成像;n = 18个,其中包括:严重哮喘n = 6,哮喘者n = 4和控制n = 8)。有少GSNO还原酶的表达在平滑肌细胞上皮细胞(p < 0.05) (图2)。然而,GSNO还原酶免疫反应性哮喘没有差异和控制患者上皮,平滑肌或炎性细胞。免疫反应性局部主要气道上皮细胞顶端区域的健康的肺。这不是从哮喘受试者在上皮细胞,在免疫反应性局部基底细胞(图2)。符合这些数据,对比细胞表达GSNO还原酶少,相对于蛋白质负荷控制,比NHBE单层细胞培养,NHBE细胞成长为pseudostratified在因此界面和建立气道上皮细胞系CFBE (图3)。值得注意的是,白介素(IL) 13增加上皮GSNO还原酶表达严重哮喘原生BAL细胞球体外,在培养的上皮细胞在体外,而il - 4不是有效(图3 bc和d)。
符合之前的报道(24,27),HHe-3成像显示区域焦点主题的肺通气的缺陷严重哮喘(n = 3) (图4)。在图4(冠状图像)和图4b(横向图像)通风缺陷显示在基线稳定,严重哮喘病人。在图4c之后获得的第二个图像沙丁胺醇政府只显示左侧上部叶温和改善通风缺陷。导航下支气管活检做的节段航空公司支持肺通风良好的区域(绿色箭头,图4显示相对保存上皮完整性、少GSNOR免疫反应性,减少炎症(图4胃肠道)活检从航空公司支持地区焦通气的缺陷(红色箭头,图4和d-f)。总体而言,上皮出现时,它是应用更多GSNOR(3-4/4阻塞气道与4在nonobstructed航空公司)。
表型分析患者GSNO还原酶活性增加
我们下一个分析的临床表型特征SARP患者气道GSNO还原酶活动增加的证据。哮喘受试者BAL GSNO还原酶活动措施,31完全SARP数据库中的特征(表2)。那些GSNO还原酶活性> 7.5 nmol·分钟−1·μg−1蛋白质IgE较高(p = 0.01),被诊断出患有哮喘和过敏症在年轻的年龄(p = 0.02)。同时,他们年轻,有一个较低的身体质量指数(BMI)、较低的白天嗜睡鼾声在阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)筛查和不太可能有运动性症状(p < 0.05)。哮喘受试者增加GSNO还原酶活性没有显著降低乙酰甲胆碱的电脑20.(挑衅造成下降20%浓度在1 s (FEV用力呼气量1)±sd(1.02±0.92)比GSNO还原酶活性较低(4.32±6.79,p = 0.22)。
从SARP GWAS数据
一个研究SNP GSNO还原酶启动子与良好的响应性β相关联2肾上腺素治疗(rs1154400) [15)是在Human1M-Duo DNA BeadChip用于SARP。这个SNP在一个地区从哮喘在高加索人群与保护15- - - - - -17)和C / C基因型与改善哮喘成果和β2反应在一个非裔美国人的人口(15];然而,作者并没有测量气道GSNOR活动。rs1154400基因型是在哈代温伯格平衡SARP人口。的受试者都落下帷幕GSNO还原酶分析和GWAS,没有高GSNO还原酶活动落下帷幕的C / C基因型,但由于样本量差异没有达到意义。SARP人口作为一个整体,哮喘病患者C / T, T / T基因型更有过敏比C / C基因型(IgE 362±846 IU·毫升−1与245±374 IU·毫升−1分别,n = 838和n = 76, p = 0.028);那些积极的皮试,鞭痕直径更大Dermatophagoyetes farinae(10.8±6.0毫米(n = 449)与8.8±4.5毫米(n = 42),分别p = 0.009)。注意,C / T)和C / T)基因型患者呼出气息冷凝(EBC) pH值低于C / C (7.7±0.8 (n = 449)与分别为8.0±0.5 (n = 45), p = 0.0004),符合EBC甲酸含量高的数据可能与气道GSNO还原酶活性增加有关(31日]。与数据一致ooreet al。(25),尽管C / C没有不同于C / T T / T关于基线FEV1(p =ns),FEV1经过四和六个泡芙的沙丁胺醇在C / C组高于C / T T / T组(四个泡芙91.7±17.3% pred (n = 81)与86.0±20.0% pred (n = 697),分别p = 0.013;和六个泡芙92.7±17.1% pred (n = 72)与87.4±20.2% pred (n = 697),分别p = 0.034)。基因型组没有不同的年龄、性别或体质指数。
讨论
GSNO和其他年代-nitrosothiols引起气道平滑肌放松在人类和其他物种(2,4,32- - - - - -34]。水平的年代-nitrosothiols很低,和GSNO还原酶活性高,患有严重哮喘的儿童的航空公司正在经历一种急性恶化与呼吸衰竭(13]。在这里,我们研究了气道GSNO还原酶表达和活动稳定的严重、不重的哮喘门诊病人。
GSNO还原酶活性增加球细胞的稳定与哮喘门诊病人。然而,它是正常的在许多严重哮喘患者;增加活动不是一个定义严重哮喘的病理生理特征。一致的工作问题et al。(10),活动也落下帷幕的大部分的正常稳定,哮喘病患者者。我们的数据扩展严重哮喘病例的观察。在一定程度上,这可能因为人口异质性GSNO还原酶的表达是由基因决定的。之前有研究表明,增加气道GSNO还原酶活动,和相关的单核苷酸多态性,目前只在少数患者哮喘(10,14- - - - - -16]。
GSNO还原酶已经越来越感兴趣目标的哮喘治疗(23]。表明,痰二硫化谷胱甘肽水平降低哮喘患者,特别是在两个炎性表型。但是,没有相关性与嗜酸性粒细胞的百分比或观察中性粒细胞(12]。
有兴趣与GSNO还原酶抑制治疗哮喘患者。因为大量的长期过度年代-nitrosothiols nitrosative上下文中的压力有可能与不良反应(5,18- - - - - -20.),重要的是目标nitrosothiol饱满只有那些患者气道年代-nitrosothiol不足和/或过度GSNO分解代谢与哮喘有关。SARP数据显示一个特定的表型。增加表达更有过敏,患者早期出现哮喘和过敏。他们年轻,小,减少了阻塞性睡眠呼吸暂停综合症。然而,他们没有更多的“严重”(22]。这个提议表型需要验证。
在小鼠模型中,GSNO吸入适度抑制两个辅助细胞类型(Th) 1和Th2细胞因子反应,包括IL-13生产、抗原(5]。我们还发现,SARP科目GSNO reductase-associated SNP,和与β受损有关2反应在米ooreet al。(15)的研究,更有过敏。预测的W海伦et al。(3从C),数据houdhryet al。(16)表明,哮喘和β受损2响应性与功能基因型导致GSNO还原酶有关。这里,我们已经证实发现支气管扩张剂反应的受试者与C / C比这大的主题与CT / T / T [14]。这个过程可能在哮喘前馈。增加Th2激活和IL-13生产将进一步增加GSNO还原酶表达和活动(当前的研究数据)5),特别是有利于增加GSNO还原酶表达过敏患者(图5)。我们已经表明,它是IL-13,而不是增加GSNOR il - 4的表达。可能的机制之一是IL-13可以刺激内皮一氧化氮合酶的活动,即使是在炎症细胞。这种效应可能涉及一个前馈机制涉及β1转化生长因子。反过来,这些影响可能刺激GSNOR反调节的方式。然而,将需要更多的详细的细胞分析来证实这个假说。
哮喘患者的支气管镜的结果可能是有缺陷的。在这里,我们表明,GSNO还原酶活动水平的病人可能反映了肺地区采样,不仅整体表型。在我们的初步研究,表达不统一整个气道。一个可能的解释是,表达式结果的地区差异治疗:吸入激素可能访问通风良好的单位,抑制炎症和GSNO还原酶的表达。先前HHe-3研究显示,大约50%的通风不良的肺单位有持久的缺陷24),或许反映出长期缺乏治疗。也有可能一些航空公司,如皮肤,有固有的不同模式的炎症。不管怎样,重要的是要认识到,可能会有大量intra-subject气道异质性。SARP和其他正在进行的研究项目正在调查这一地区变化更多的前瞻性。
此外,支气管镜检查并不是没有费用和潜在的风险。因此,非侵入性诊断的生物标志物可能有用的严重的哮喘。可能符合低pH值非/ C基因型人群,我们之前的数据表明,EBC甲酸含量增加可能是一个非侵入性标记增加GSNO还原酶活性(31日]。我们曾表明,吸入GSNO增加呼出一氧化氮,紧随其后的是时间衰变(35]。因此,与GSNO吸入的挑战可能会测试的存在和/或抑制解除GSNO还原酶活动在人类哮喘患者:GSNO还原酶的活性越大,分数越高呼出一氧化氮(F伊诺)的挑战。气道同质性,反过来,可以使用不同的F化验伊诺流率。我们相信这种挑战测试和/或EBC甲酸测试,可能在临床上有用的识别严重哮喘患者可能的候选人年代-nitrosothiol替换和/或GSNO还原酶的抑制作用。
值得注意的是,我们发现GSNO还原酶活动增加与醋甲胆碱PC哮喘病患者没有明显关联20.在这个方向上,尽管有一个趋势。这可以解释为皮质类固醇治疗。在我们的研究中,83%的患者和100%的严重哮喘患者者收到吸入类固醇。在这项研究中,Q问题et al。(10),包括只有科目有轻度哮喘,和他们不接受大剂量吸入或口服糖皮质激素。
总之,我们发现明显异质性GSNO还原酶活动主题严重和哮喘者。GSNO还原酶活动增加不是,一般来说,严重哮喘的原因。我们还提供证据,增加患者气道GSNO还原酶活性可能有更多的过敏表型。如果验证,这个高GSNO还原酶表型可能是临床上怀疑基于历史和体格检查和确认与基因分析和/或生物标志物检测肺功能的实验室。反过来,这些信息可用于个性化治疗。我们相信,这种模式将增加价值的附属专业哮喘管理。
确认
我们要感谢所有的严重哮喘研究项目协调员。
脚注
这个版本的这篇文章已经修改。勘误表中概述的修正案是发表在2015年6月出版的欧洲呼吸杂志(DOI:10.1183/09031936.50042414]。
支持声明:b·加斯顿收到资助这项研究:NIH严重哮喘研究项目拨款# 5 u10hl109250-02;国家卫生研究院计划项目资助# 5 p01hl101871-02;和NIH R01格兰特ro1-hl059337-12 # 5。R.A. Panettieri已经收到NIH资助这项研究R01款项# HL097796和NIEHS P30 ES013508。一些德朗已经接到NIH RO1 HL66479资助这项研究。
利益冲突:披露与本文的网络版可以找到:www.qdcxjkg.com
- 收到了2014年3月4日。
- 接受2014年8月12日。
- 版权©2015人队