文摘
慢性血栓栓塞肺动脉高压(CTEPH)与慢性炎症有关,但病理机制在很大程度上是未知的。我们的研究旨在同时概要范围广泛的肺部动脉内膜切除术的上层清液中细胞因子(豌豆)手术材料,以及患者的前瞻性CTEPH调查是否循环细胞因子与CTEPH病人的血流动力学和物理特征。
在这里,我们表明,豌豆标本显示的重要upregulation白介素(IL) 6、单核细胞化学引诱物蛋白1,interferon-γ-induced protein-10 (IP) -10年,巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1α和咆哮而从健康对照组肺组织。
在前瞻性收集血清,il - 6的水平,引发,IP-10, monokine诱导interferon-γ(MIG)和MIP1α显著升高CTEPH患者年龄,sex-matched健康对照组相比。血清中特发性肺动脉高压(IPAH)病人,只有IP-10和米格显著增加。在IPAH CTEPH但不是IP-10与心脏指数负相关,6分钟步行距离和一氧化碳扩散能力。在体外,IP-10显著增加新鲜孤立的外膜成纤维细胞的迁移。
我们的研究首次表明,IP-10分泌与CTEPH肺血液动力学和物理能力差、可能参与豌豆组织形成的病理机制。
文摘
增加循环IP-10与贫穷有关肺血液动力学和物理能力CTEPH病人http://ow.ly/yDX7U
介绍
慢性血栓栓塞肺动脉高压(CTEPH)是一种疾病与高发病率和死亡率[1]。CTEPH是由近端梗阻引起的肺动脉由于急性复发和/或肺栓塞,原位更大的近端和节段性肺动脉血栓形成和/或小血管肺部动脉病(2]。结果肺动脉高压导致右心室扩张,收缩末期和舒张末期压力的提升,右心衰。虽然典型的风险因素参与血栓形成的发展,如抗凝血酶的突变,蛋白质,蛋白质C因子II或因子V莱顿,与CTEPH没有显著相关,高浓度的antiphospholipid抗体与狼疮抗凝相关检测(3]。此外,纤维蛋白β-chain n端从患者似乎更耐溶栓,表明发展的一个重要的角色CTEPH但也可能肺动脉高血压(PAH) [4]。此外,最近的一项研究表明,间充质祖细胞的分化出现在neointima CTEPH血管堵塞的患者可能引发的因素包括容器的微环境中,导致进步的咬合5]。
机制导致的坚持和发展,阻碍CTEPH fibrothrombotic材料需要进一步说明。越来越多的兴趣炎症的作用,甚至感染,疾病的进展。Bondermanet al。(6)所描述的葡萄球菌感染CTEPH血栓。另外,他们发现葡萄球菌感染延迟血栓决议在小鼠模型(6]。在CTEPH,炎症细胞(如。CD45+)和collagen-secreting细胞发现了丰富的血管壁(7,8]。此外,循环水平炎症因素如肿瘤坏死factor-α,单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP)和c反应蛋白被证明在CTEPH升高,与肺血管阻力MCP-1显示正相关(9- - - - - -12]。
我们最近报道,CXCL10,也称为interferon-γ-induced protein-10 (IP-10),导致内皮功能障碍主要从人类肺动脉内皮细胞13]。我们的工作假说是细胞因子如IP-10调解的肺动脉阻塞性改造CTEPH。除了IP-10,我们调查了一个广泛的炎性因子(白介素(IL) 8、IL - 6、MCP-1 monokine引起interferon-γ(MIG),咆哮,CX3CL1,巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1α和CXCL12)可能参与炎症反应,并可能引起细胞迁移。研究了这些因素在肺部动脉内膜切除术(豌豆)组织,豌豆上层清液和新诊断的血清CTEPH和特发性肺动脉高压(IPAH)患者。我们发现在CTEPH患者中,IP-10与心脏指数负相关,6分钟步行距离(6随钻测量)和扩散能力的肺一氧化碳(DLCO)。此外,IP-10增加新鲜孤立的人类外膜成纤维细胞的迁移在体外。这表明一个重要的角色在CTEPH IP-10的肺血管重塑。
材料和方法
外科豌豆组织
豌豆组织获得八CTEPH病人接受豌豆。病人特点提出了表1。豌豆组织直接从手术室被流放至内皮细胞实验室的培养基(VascuLife VEGF细胞培养基;生命线技术,Walkersville,医学博士,美国)并立即处理。在这项研究中,近端和远端豌豆组织评估。研究协议组织捐赠的机构审查委员会批准的维也纳医科大学(奥地利维也纳)依照国家法律。从每个病人书面知情同意了。
此外,样本供体肺,而不是用于肺移植,用于基因表达研究。本研究机构审查委员会批准的维也纳医科大学按照国家法律。
血清样本CTEPH IPAH患者和健康对照组
血样预期从一个单独的队列的患者在格拉茨医科大学(奥地利格拉茨)进行诊断或随访心脏catheterisation。16 CTEPH 11 IPAH病人登记,以及16名健康对照组性别和年龄与CTEPH患者和健康对照组11 IPAH患者的性别和年龄。样品从健康对照组(n = 98)前瞻性收集的生物之间的格拉茨医科大学的2011年和2013年。
所有样品进行了同样的过程。血样在室温下了30分钟,然后在1500×g离心10分钟。血清是存储在分离器管(Vacuette溢价管;他一一Bio-One GmbH是一家,Kremsmunster,奥地利)。所有样品都能整除和存储在-80°C的格拉茨医科大学的生物。书面知情同意了所有科目。该研究机构审查委员会批准的格拉茨医科大学的符合国家法律。
从供体肺隔离外膜成纤维细胞
外膜成纤维细胞分离从肺动脉non-transplantable供体肺的外膜层。外膜成纤维细胞组织被切断和碎片resuspended外膜成纤维细胞中(FibroLife介质,ls - 1038补充剂;生命线)和培养T75培养瓶血压得到较好的控制。
免疫组织化学
新鲜手术豌豆材料和人力供体肺固定在4%甲醛24 h和嵌入在石蜡块。切片石蜡组织(2-μm厚)放置在毛细管显微镜载玻片的差距(Dako真实;Dako、伊利、英国),在室温下保持进一步使用。ab9807 IP-10免疫组织化学染色(摘要;Abcam,剑桥,英国),引发(1:10 0;ab7747;Abcam)、MCP-1 (1:10 0, ab73680;Abcam)和il - 6 (1:10 0, ab6672;Abcam)进行3 3′-diaminobenzidine过氧化物酶底物从研发系统工具包(明尼阿波利斯,美国)。haematoxylin-eosin染色,吉尔使用的协议。 The staining was analysed by an experienced pathologist who was blinded to the patient characteristics. For the collagen fibre staining, the Masson’s Trichrome staining protocol was used according to the manufacturer’s instructions. The stainings for vimentin (1:100, ab11256; Abcam), α-actin (1:500; Everest Biotech Ltd, Upper Heyford, UK), fibronectin (1:250, ab23750; Abcam), CD45 (1:200, ab10558; Abcam), CD68 (1:250, sc-20060; Santa-Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA), MIP1α (1:50, PA5-32496; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) and CXCL12 (1:100, sc-28876; Santa-Cruz Biotechnology Inc.) were performed with the Vektor ImmPRESS reagent kit (Vector Laboratories Ltd, Peterborough, UK).
豌豆的浮层组织的决心
移除后,豌豆样本8 CTEPH患者立即投入内皮细胞基础培养基补充5%胎牛血清(FCS)和抗生素(VascuLife VEGF细胞培养基;生命线技术)(14]。组织切成小块,孵化了18 h在37°C DMEM-F12介质(Gibco) 0.3% FCS、谷氨酰胺、青霉素和链霉素(1%)。
上层清液进行了一个类似的过程集合从主要的人类细胞供体肺(肺动脉内皮细胞,平滑肌细胞和成纤维细胞)。浮在表面的收集和储存在-80°C。
细胞因子的测定
IP-10、引发、咆哮、米格和MCP-1测量与人类趋化因子工具包仪珠阵列(美国新泽西州,正欲富兰克林湖),而il - 6, fractalkine和MIP1α内容在上层清液和血清测定使用il - 6, fractalkine和MIP1αFlex集(558276;560265;558325;正欲)。流式细胞仪的测量进行了第二章流式细胞分析仪(正)。CXCL12上层清液和血清的测定通过ELISA(人类CXCL12 / SDF1αQuantikine酶联免疫试剂盒;研发系统)。
RNA隔离,c-DNA合成和实时PCR
试剂盒协议从豌豆申请总RNA隔离材料的八个病人和控制样本用于肺移植供体肺不健康。Nanodrop 2000 c分光光度计(PeQlab Sarisbury绿色,英国)被用来量化的浓度和纯度孤立的总RNA。总RNA被转换为互补使用RevertAid H -合成第一链cDNA工具包(Fermentas;热费希尔科学,Schwerte,德国)。实时PCR分析是由一个Lightcycler 480(罗氏诊断国际AG Rotkreuz,瑞士)。作为一个人类使用B2M看家基因。引物用表S6中列出。
迁移分析
外膜成纤维细胞在基底介质(serum-starved一夜FibroLife介质;生命线细胞技术,弗雷德里克,医学博士,美国)。Sub-confluent细胞收获trypsin-EDTA和8.0×105细胞在细胞培养中被插入(PIEP12R48;默克密理博,达姆施塔特,德国)。井的底部满心μg·2毫升−1同形像控制或同形像控制IP-10 (10 ng·毫升−1)。额外井满心IP-10 (10 ng·毫升−1)和CXCR3抑制性抗体(2μg·毫升−1(2)或IP-10中和抗体μg·毫升−1)。后6 h与甲醇细胞被固定并与苏木精染色。20的照片5随机区域为每个过滤器是用光学显微镜(20 x LCPlanFl客观;奥林巴斯光学有限公司,日本东京)。细胞的数量,迁移到过滤器的底部。
扩散分析
调查IP-10人类外膜成纤维细胞增殖的影响以下协议应用:10 000个细胞(从三个不同的捐助者)被播种在96 -孔板。之前刺激外膜成纤维细胞被保存在静止介质(VascuLife基础培养基与青霉素、链霉素和0.1% FCS 1%;生命线技术)24 h。细胞治疗24小时,10和100 ng·毫升−1IP-10或被保持在控制条件下。外膜成纤维细胞的增殖是由(3H]胸苷(Biotrend Chemikalien GmbH是一家,科隆,德国)合并的索引DNA合成和测量放射性的闪烁计数器(1450年Wallac MicroBeta TriLux液体闪烁计数器和光度计;PerkinElmer生命和分析科学,图尔库,芬兰)。实验一式五份,重复4到7次。
统计分析
数据提出了中位数(四分位范围(差)),除非另有说明。组间差异被析因方差分析与评估事后Bonferroni测试或Mann-Whitney紫外线测试。斯皮尔曼组间的相关性进行了测试。一个假定值< 0.05被认为是显著的。
结果
炎症因子分泌豌豆组织
CTEPH患者报告的临床特征表1。细胞因子释放的居民的近端和远端豌豆组织细胞8个病人在浮在表面的测量。CXCL12,引发,il - 6、MCP-1 IP-10 MIP1α、咆哮、米格出席高浓度相比CX3CL1 / fractalkine (图1)。低水平的细胞因子被发现的上层清液中主要人类肺动脉内皮细胞,平滑肌细胞和成纤维细胞(表S1)。在豌豆材料本身,mRNA水平测定。IP-10, il - 6、MCP-1 MIP1α和咆哮mRNA相比显著调节健康的人类肺组织(图2 -ⅰ)。豌豆组织的免疫组织化学染色显示IP-10,引发,il - 6, MCP-1, CXCL12和MIP1α(图2 j-o)。染色的因素也在供体肺(图S1)。所有这些因素的受体也出现在豌豆组织(图S2)。
循环CTEPH和IPAH患者的炎性细胞因子
我们前瞻性的CTEPH和IPAH患者性别,年龄健康对照调查循环炎性细胞因子。在右心catheterisation进行血液取样。病人的临床特征和血液动力学的参数和控制所示表1。流式细胞术和ELISA检测血清样本显示上执行引发的水平显著升高,血清il - 6, IP-10,米格和MIP1αCTEPH患者与健康对照组相比(图3和表S2),而血清水平的咆哮明显减少。阐明如果CTEPH观察到的特定细胞因子配置文件,我们评估了相同的血清炎性细胞因子IPAH病人和他们的年龄,sex-matched控制。的人口和肺血液动力学IPAH病人中列出表1。IPAH IP-10和米格但不是il - 6,引发和MIP1α明显升高(图4)。
IP-10和il - 6与血液动力学在CTEPH显著相关
接下来我们进行了斯皮尔曼分析之间的显著的细胞因子水平升高,血液动力学。详细分析见表S3。在CTEPH IP-10之间有显著负相关,心输出量(ρ= -0.71)和心脏指数(ρ= -0.54)(图5)。此外,il - 6之间有显著的正相关和肺血管阻力(ρ= 0.52),右心房压力(ρ= 0.62)和n端pro-brain利钠肽(中位数水平以上病人;ρ= 0.51)(图5)。没有其他的炎性细胞因子证明任何重大相关性血流动力学参数。此外,IP-10血清水平负相关DLCO为单身呼吸(ρ= -0.57DLCO和ρ= -0.62DLCO/肺泡体积)。
IPAH患者il - 6,但不是IP-10明显与血液动力学的相关参数(表S4和S5)。il - 6与心输出量显著负相关(ρ= -0.63)和心脏指数(ρ= -0.86)。有显著的正相关关系与纽约心脏协会功能类(ρ= 0.66),c反应蛋白(ρ= 0.67),尿酸(ρ= 0.71)和中位数水平以上病人(ρ= 0.85)。总的来说,这些结果表明,il - 6在IPAH与预后密切相关的标记,但IP-10只是与CTEPH血液动力学有关。
与6随钻测量细胞因子水平的相关性
在CTEPH病人,只有IP-10和il - 6与运动能力显著相关,如评估6随钻测量(ρ= -0.66和ρ= -0.64,分别)(图5和表S3)。
讨论
这项研究是第一个同时概要范围广泛的细胞因子在豌豆手术材料,其上层清液和CTEPH患者的一个独立的群体。此外,我们比较了循环细胞因子水平获得CTEPH IPAH患者和对照组患者。我们的研究结果表明循环的一个重要调节异常CTEPH和IPAH患者的炎性细胞因子。IPAH患者因素显示右心室的代谢失调,如6随钻测量、尿酸,中位数水平以上病人,等。是与il - 6水平密切相关。这同意之前的发现咖啡匙et al。(15)和Humbertet al。(16]。我们发现在CTEPH患者这种联系也存在IP-10水平。IP-10可能是特别重要的,因为它导致成纤维细胞迁移,一个因素可能导致的高细胞性远端豌豆材料胶原生成细胞,观察到Ogawaet al。(17]。我们表明,血清细胞因子的调节异常CTEPH不仅包括IP-10、il - 6和引发,但也米格和MIP1α。相应地,在豌豆组织我们检测到显著增加的il - 6水平,MCP-1, IP-10,咆哮和MIP1α我们表明,豌豆蛋白质存在于组织中。
CTEPH静脉血栓是一种罕见的和晚期的后果,它与著名的障碍物在较大的肺动脉(18]。尽管一些证据的特异表达溶栓,CTEPH的病理机制仍知之甚少,可能涉及炎症,原位血栓形成和内皮功能障碍。慢性炎症的有害影响CTEPH病人建议通过研究表明,炎症不仅有助于CTEPH的发病机制,但也的发展疾病(19]。慢性炎性疾病的患病率增加CTEPH患者被发现(20.),的存在葡萄球菌的抗原在大多数患者ventriculoatrial分流或pacemaker-related CTEPH [6]。另一个回顾性研究报道,炎症标志物c反应蛋白明显升高患者CTEPH [12]。在后续的研究中,基于他们的在体外数据,Wynantset al。(21]假定c反应蛋白可能导致阻碍材料的持久性在CTEPH肺动脉。
促炎细胞因子激活,包括il - 6,患者被描述IPAH [15,16,最近在孤立的右心室功能障碍患者由于CTEPH [22]。此外,豌豆后血液动力学的不稳定性与更高的术后血浆il - 6的浓度有关,引发15),这表明这些细胞因子可以作为生物标志物识别病人的风险发展豌豆手术后残余肺动脉高压。我们的研究证实了这一发现的CTEPH血清il - 6水平上升,延伸与标记的右心室功能显著相关。此外,它表明,引发不仅是在术前患者术后也升高。IPAH和CTEPH军团,il - 6与血液动力学显著相关,尽管平均水平没有显著增加相比,IPAH匹配控制。
先前的研究调查趋化因子在肺动脉高压的作用主要集中在多环芳烃。肺匀浆IPAH病人(原前毛细管的肺动脉高压),CC趋化因子mRNA水平增加MlP1α[23据报道[],随后咆哮,24]。我们检测到显著增加MlP1α和咆哮的豌豆组织;然而,在CTEPH患者的血清,只有MlP1α升高,咆哮下降。Kimuraet al。(11]报道相关的肺血管阻力升高CCL2趋化因子的表达的等离子体和大肺动脉MCP-1 CTEPH病人。然而,他们没有比较他们的发现CTEPH人口与健康对照组。我们的研究包括性别和年龄对CTEPH和IPAH病人健康对照组。这表明MCP-1血清水平并没有显著变化。在我们CTEPH人口,米格与健康对照组相比显著升高。最后,按照以前的观测在多环芳烃25),我们发现CXCL10 / IP-10 CTEPH患者明显升高。趋化因子是由细胞分泌的豌豆组织和可能引起成纤维细胞到血栓栓塞材料。因此,它可能是一个持久性的妨碍fibrothrombotic材料之间的联系和血液动力学的恶化。
我们的研究的主要力量是血液动力学的综合循环细胞因子的相关分析,气体交换和物理参数CTEPH患者。IP-10 mRNA和蛋白水平提高豌豆组织,以及CTEPH患者的血清。我们观察到显著的负相关,与经典IP-10索引的心脏功能(心输出量和心脏指数),以及6随钻测量。一致的IP-10 upregulation豌豆组织连同其效果作为诱导物的成纤维细胞迁移和血液动力学的相关点发展的一个重要的病理功能CTEPH。
这一研究是探索性的,包括数量相对较低的豌豆材料。我们使用多个测试循环水平的细胞因子和患者血液动力学的相关性分析和比较少量的病人和他们的匹配控制。然而,我们包括临床特征明显CTEPH和IPAH患者性别,年龄健康对照组,独立和前瞻性的格拉茨医科大学的生物。确认炎症标志物的诊断价值,这样的调查应该扩展到更多的病人的前瞻性研究。
我们只能推测机制进步妨碍CTEPH肺动脉。然而,的重要性IP-10内皮功能障碍的肺循环最近显示(13]。在当前的研究中我们发现IP-10专门促进外膜成纤维细胞迁移。因此,当地IP-10可能吸引从动脉外膜成纤维细胞或者循环纤维细胞的血栓栓塞材料导致持续的积累这些细胞分泌胶原蛋白,可能导致增长和加强血管内的材料。也MCP-1 MlP1α和il - 6所示促进单核细胞迁移、巨噬细胞和成纤维细胞26,27]。此外,MCP-1-induced炎症可以导致血管内膜增生(28,29日)也刺激成纤维细胞增殖和胶原蛋白分泌(30.]。最后,根据我们的观察,观察炎性细胞浸润在远端血管的豌豆材料(8]。这些发现构成进一步证明细胞渗透和扩散以及胶原蛋白生产的诸多因素导致进步的阻塞肺动脉CTEPH IP-10可能发挥核心作用。
总之,我们证明IP-10 mRNA和蛋白水平的升高豌豆组织,以及在CTEPH患者的血清。的病理生理相关性upregulation支持这一事实循环IP-10水平与血流动力学和物理参数。此外,IP-10促进纤维母细胞迁移,这可能导致疾病的进展。进一步的研究来定义IP-10在疾病进展的时间变化和治疗是必要的。
确认
我们要感谢埃尔韦拉止住血(格拉茨医科大学的病理学研究所,格拉茨,奥地利)在豌豆的分析帮助组织染色,和亚历山大禽流感(医学信息研究所统计数据和文档,格拉茨医科大学的)的分析数据,以及玛蒂娜探讨(实验和临床药理研究所格拉茨医科大学的),Sabine Halsegger(麻醉和重症监护医学部门,实验麻醉学,格拉茨医科大学的)为他们的优秀的技术支持。
脚注
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可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:d . Zabini和诉市中心被格拉茨医科大学的资助(项目分子医学博士)。
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本www.qdcxjkg.com
- 收到了2013年8月19日。
- 接受2014年5月22日。
- ©2014人队