摘要
在个性化癌症治疗的时代,对患者肿瘤的分子剖面的需求稳步增加。在先进的非球细胞肺癌(NSCLC)患者中,表皮生长因子受体检测(表皮生长因子受体)突变和包血性淋巴瘤激酶(alk.)基因重排已成为临床实践的重要组成部分,以选择最有可能分别受益于EGFR和ALK酪氨酸激酶抑制剂的患者。此外,从复发或转移性肿瘤或对初始有效治疗产生耐药性的患者身上获取组织标本至关重要为了我们理解肿瘤进展和耐药性发展的分子基础。因此,具有代表性且数量和质量足以用于病理诊断和基因组分析的肿瘤组织取样至关重要。在本综述中,我们将讨论在获得d处理活检标本,以便对非小细胞肺癌患者进行常规分子分析。
摘要
个性化治疗:充分的肿瘤组织取样病理诊断和分子谱分析是至关重要的http://ow.ly/yRjDM
介绍
在过去的几十年中,广泛的努力越来越努力克服癌症的杀伤力。然而,化学治疗剂的有效性已达到高原[1.].一旦癌症转移,它们很少可固化,因为它们几乎总是在初始化学疗法后重复。最近发现司机突变及其对特定目标代理的更大反应性的关联导致癌症治疗的范式转变,从常规化学疗法到生物标志物驱动的靶向治疗。这种个性化治疗的新时代带来了越来越多的需求,对肿瘤基因型和表型表现出来。超过三分之二的患有Nonsmall细胞肺癌(NSCLC)的患者在诊断中处于先进,无法操作的阶段[1.].因此,对于大多数患者来说,小活检或细胞学标本将是唯一可用于诊断和分子谱分析的组织。此外,许多研究人员最近关注于对复发性、转移性或耐药肿瘤的分子病理学的更深入的了解。因此,作为下一代生物标本,重复活检正在发挥更大的作用。后者可定义为在病程的不同时间点或在治疗期间从患者获得的临床标本,用于进行肿瘤分析,以决定持续的治疗方案[2.].
表皮生长因子受体酪氨酸激酶结构域突变(表皮生长因子受体)及间变淋巴瘤激酶重排(alk.)基因都与高响应率相关于它们各自的目标酪氨酸激酶抑制剂(TKI)3.–5.],因此是这些TKIs治疗使用的主要决定因素[6.–10].患者肿瘤样本进行测试表皮生长因子受体突变和alk.基因重排已经成为临床肿瘤学和病理学实践的重要组成部分,目前被认为是晚期肺腺癌患者的护理标准。
分子基因分型的第一步是取样足够的肿瘤组织。分子检测的准确性不仅取决于分子分析本身,也取决于样本的质量,强调良好的样本收集和适当处理技术的重要性[11].
活检部位的选择
病变活检的选择通常是由医生,外科医生,介入放射科决定。从单个活检标本进行遗传分析可以不覆盖整个肿瘤的特征,并且可以下表示肿瘤的异质遗传图谱[12].最近的基因组研究表明,同一肿瘤的不同区域、原发性肿瘤和转移性肿瘤之间以及不同转移部位之间存在异质性和遗传进化。尽管存在这种明显的异质性,但关键驱动突变在转移性肿瘤和原发性肿瘤中都得到了很好的保留[13–15].这表明原发肿瘤的基因组图谱很可能反映了转移的基因组图谱,而原发肿瘤组织可以作为所有肿瘤基因组图谱的替代品[14].大多数表皮生长因子受体突变和alk.基因重排,作为非小细胞肺癌的驱动突变,似乎遵循这一模式。
关于性别的异质性一直存在争议表皮生长因子受体在原发性肿瘤和原发性和转移性肿瘤之间的突变[16].采用激光捕获的微量碎裂的一些系统研究报告说,24-50%的NSCLC显示出异构人群表皮生长因子受体突变及非突变肿瘤细胞[17–21].此外,肿瘤内的患者表皮生长因子受体异质性具有趋势,表明对EGFR-TKI治疗的较低反应率(表1) [18,20.].当应用高灵敏度的检测方法,如下一代测序,亚群表皮生长因子受体43%的nsclc中检测到与主型不同缺失模式的外显子19缺失,但只有4%的肿瘤显示大量缺失亚群,占基因组DNA的2% [25].然而,其他使用手工显微解剖的研究未能显示肿瘤内的异质性表皮生长因子受体突变(22–24].此外,研究比较表皮生长因子受体活检和切除标本的突变状态无差异(表2) [26–28].这表明,在一些非小细胞肺癌中表皮生长因子受体突变(17,29,30.,在原发肿瘤中显示不同突变模式的肿瘤细胞数量非常少,因此,很容易被占主导地位的人群所掩盖,通常的方法无法检测到。然而,这种肿瘤内部的异质性表皮生长因子受体突变可能部分占的临床反应的差异,以EGFR-TKI的表皮生长因子受体-突变患者和不明原发和继发耐药性病例[28,31,32].在临床环境中,总体表皮生长因子受体癌组织的状态显示更加重要,而且在大多数患者中,内tumoural突变的异质性可能不会显著影响EGFR靶向治疗的疗效[28]; 然而,还需要进一步确认。根据最近的美国病理学家学院(CAP)/国际肺癌研究协会(IASLC)/分子病理学协会(AMP)非小细胞肺癌分子检测指南,表皮生长因子受体没有必要对单个肿瘤的多个不同区域进行测试[33].相比之下,对于多发性肺腺癌患者,似乎并非源自单一肿瘤,每个肿瘤可单独检测[33].如果表皮生长因子受体同一同步肺原发肿瘤中发现突变,应根据治疗指南进行靶向治疗[34].
当考虑原发肿瘤和相应转移之间的异质性时,不一致结果的百分比表皮生长因子受体突变状态从0%变化到38.8%(表3) [23,32,35–39].当转移发生时,转移性肿瘤的基因谱可能进化或被克隆选择,原发肿瘤和转移之间的时间间隔足够长,可以使异质亚群生长。此外,化疗或TKI治疗可能会影响表皮生长因子受体突变状态通过改变总体频率来实现表皮生长因子受体药物治疗后的突变克隆[19,29].因此,在一小部分患者中,原发肿瘤可能不具有代表性表皮生长因子受体转移性肿瘤的突变状态。CAP/IASLC/AMP准则建议表皮生长因子受体来自初级肿瘤或其转移的细胞学或小活组织检查样品的突变测试可能同样适用于肿瘤基因分型[33].事实上,以人口为基础表皮生长因子受体测试程序,shiau等[40]报告说,近80%提交的档案样本来自原发肿瘤。然而,对于其他基因组图谱研究,还没有关于原发肿瘤或转移是否适合进行分子分析的指南。遗传异质性的临床意义有待于进一步的研究充分评价。
在多个候选病变中,分子检测活检部位的选择通常是基于肿瘤大小和可及性[2.,41].影像学可用于指导活检和避免坏死区域。需要脱钙过程的骨转移不适合分子分析。
为了更好地了解靶向治疗反应和耐药性的遗传机制,并为进一步研究采购生物标本,鼓励在疾病或治疗过程中的不同时间点进行连续肿瘤活检[2.].如果需要获得额外的样本,应考虑几个临床因素,如患者的整体临床情况、病变的可及性、影像学特征、对以往治疗的反应性和最合适的时间点[2.,33].
用于分子测试的样品类型
在大多数肿瘤细胞较少的小活检和细胞学标本中,主要依靠对肿瘤细胞形态学(定性)特征的识别,病理诊断和分类较为准确。相比之下,分子测试往往需要更多的组织,因为检测灵敏度可能需要最少数量的材料(例如DNA, RNA或肿瘤细胞)。更多的肿瘤组织也提供更大的区域,以丰富肿瘤细胞内容物的宏观或微观解剖[33].
不到30%的NSCLC在出现时可切除[1.].因此,来自可用于分子检测的晚期肺癌患者的大多数临床样本是小型,福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)活组织检查或细胞学标本。矛盾的是,虽然每样本的测试的生物标志物的数量增加,但肿瘤采样已经朝向有利于较少的侵入性手术,这通常产生较少量的样品。小标本可能含有有限量的肿瘤细胞和可变比例的非肿瘤细胞,这可能影响结果的准确性(无花果。1.).因此,限制辅助诊断免疫组化标志物的使用和分子检测的临床优先级是重要的[42].对更大且多个活检样本的要求需要与程序性发病率(如气胸或咯血)的风险相平衡[43].可以从一个损伤可以获得关于活检或核的数量的数据被限制[43–45],尽管指导方针强调获得尽可能多的肿瘤组织的好处[41].
尽管使用组织标本是分子检测的金标准,但相当一部分晚期NSCLC患者仅通过细胞学诊断[46].以前的研究已经表明,如果FFPE样品是不可用时,细胞学样品可以是适合于准确的诊断,以及用于分子检测[46,47].的检出率表皮生长因子受体细胞学标本的突变似乎与组织样本一样高[40,47].然而,当细胞学样本肿瘤细胞含量较低时,应采用更敏感的突变检测方法[28].诊断细针抽吸(FNA)标本通常具有固有的高比例肿瘤细胞[48],作为肿瘤细胞是内聚力较小的,因此,更容易被吸出。归档时间长FNA样品已经显示出,以产生适合于分子谱丰富的基因组DNA [49].最近的一项研究表明,从涂片上选择性地刮取的肿瘤细胞可产生高质量的核酸用于分子分析[49,显示出比细胞阻断标本更高的肿瘤细胞总数和肿瘤细胞数量[50].然而,细胞块标本通常优于涂片,因为细胞块切片中的肿瘤细胞数量可以很容易地评估,原始诊断切片可以存档,必要时可以进行额外的辅助检查[51].
在无法获得活检或细胞学样本的情况下,患者的血浆可能成为一种选择。血浆样本可能含有从肿瘤细胞或循环肿瘤细胞释放的游离DNA。根据研究设计、检测方法和符合条件的患者群体,血浆和肿瘤样本突变状态的一致性在33%到87%之间[52–54].尽管技术进步使得血液中癌症相关等位基因的检测更加准确,但在常规临床应用之前仍需克服许多障碍[52].然而,血浆可以提供关于克服遗传异质性的肿瘤遗传景观的信息,并提供评估肿瘤动态的机会,如检测微小残留疾病、早期检测复发和预测晚期肺癌治疗的反应[12].它表明了提供最不侵入性和最方便的和最方便的和经济有效的方法,以便将来获得分子测试的样品。
用于分子检测的肿瘤细胞数量
通常,使用冷冻样品的大多数突变分析中,细胞的量和提取的DNA的浓度较少[55].细胞学标本,以及小活检样品,其产生DNA的非常低的量,可使用更灵敏的检测方法时,[检测突变40,42,56–58].然而,对于300细胞,由于福尔马林固定标本中的造成令人难以突变的可能性较高,因此结果的风险增加了[55].成功突变试验所需的细胞数未明确,但已经提出了一系列标本中的100-400颗肿瘤细胞[41,45,59].另一项研究报告,细胞学标本满足以下三个标准中的任何一个:DNA浓度>25 ng·μL−1., >30肿瘤细胞或>30%肿瘤细胞;在使用焦磷酸测序方法时,与相应组织样本的一致性达到100% [50].以人口为基础表皮生长因子受体2293例Shiau等[40据报道,在检查手术活检标本中,初级肺病灶的核心活检具有最高的试验失效率(〜10%)。最高的测试成功率与宏观分子区域内的肿瘤细胞≥30%相关,≥2mm肿瘤区域标记为宏观发射。对于细胞学样品,只有细胞嵌段的总细胞含量,但不是肿瘤细胞性与试验成功率相关,其细胞内容病例最小的细胞内容病例报告显着降低测试成功率,而不是小细胞含量小簇的病例。
标本质量:肿瘤细胞的数量和肿瘤细胞的富集程度
可扩增DNA的保存和质量似乎比其在样本中的数量更为重要[41,60].如果多个样本可用于分子测试,则选择哪种样品是最佳的分子测定应基于样本的质量,肿瘤细胞百分比和每个实验室的验证标本类型[34].当只有小样本可用于分子检测时,假阴性结果可能会有问题,因为分析前的组织学或细胞学因素可能会进一步降低检测灵敏度。
肿瘤细胞的相对比例对非赘生性细胞是确定分子测试的灵敏度的重要参数之一[42,60]然而,对于最佳肿瘤细胞数或如何评估它还没有明确的共识。一些研究小组已经为综合基因组分析设定了肿瘤细胞数>60%和坏死率<20%的阈值[61–63].对于Sanger测序,如果考虑杂合度和二体肿瘤细胞,估计肿瘤细胞数量时可靠结果的阈值为40-50%,更准确计数时为30% [41,56].然而,突变也可能检测到小于40%的肿瘤细胞。突变等位基因频率与肿瘤细胞数量之间的相关性受到基因拷贝数变化的高度影响,如表皮生长因子受体-突变的等位基因优先被放大[64–66].
由于样本之间的肿瘤细胞数量可能存在相当大的差异,因此对每个样本进行组织学评估以确认诊断和评估肿瘤细胞数量是至关重要的[2.].然而,对肿瘤细胞数量的估计在病理学家之间存在显著差异[56,67–69],而目视评估与细胞计数相比,可能有高估肿瘤细胞数量的倾向[56,68]对病理学家进行金标准校准样本的培训可能有助于更一致地估计肿瘤细胞数量[33,67].发展精确计算细胞含量的计算图像分析系统,可能是估计肿瘤细胞数量的另一种无偏倚选择[70].
理想的分子检测样本应该有很高比例的肿瘤细胞和最少数量的粘蛋白或坏死细胞。为了获得质量最好的标本,可以应用肿瘤细胞富集技术。病理学家在对病例进行组织学检查时,可以在切片上指定肿瘤细胞丰富的区域,然后从未染色的切片上刮掉这些区域,或者从石蜡块上挖出标记区域。流式细胞分选或激光捕获显微解剖技术也可以使用,但它们在临床实践中不实用或不适合。
随着检测方法的快速发展和灵敏度的提高,肿瘤细胞数量的分析局限性降低,可以对肿瘤细胞数量较低的样品进行分子谱分析。CAP/IASLC/AMP指南建议,对于egfr靶向治疗,应提供敏感的分子方法,可以检测样本中仅10%的肿瘤细胞的突变[33].每个实验室还应验证每种检测方法和每种标本类型的灵敏度阈值。然而,由于人工突变的几率增加,敏感性低于1%的超灵敏分子检测结果应该仔细解释。样本的肿瘤细胞数目及分子化验的检出限度应一并考虑[28,69].此外,频率的重要性很低表皮生长因子受体用超灵敏方法检测到的突变也应该得到验证。
样品的分析前处理
标本的质量主要受固定前时间、固定物类型和固定时间的影响。在取样或切除后10分钟内,组织开始发生显著的生化变化。预固定时间应尽量缩短,以减少RNA和蛋白质的降解。应尽快对切除的标本进行大体检查,并将其切片,以方便固定剂渗入[71].
新鲜、冷冻、福尔马林固定或酒精固定的标本可用于分子分析。通常使用10%中性缓冲福尔马林固定来保存临床组织标本。然而,福尔马林固定不是分子分析的最佳选择,因为它会导致蛋白质的化学交联,以及核酸的碎片化和化学修饰[72,73].可发生产生人工突变的随机碱基改变,通常在低DNA浓度的FFPE样品中[55,74]尽管如此,福尔马林固定保留了形态学细节,并允许以极低的成本长期保存样品。此外,大多数辅助测试,包括免疫组织化学和分子分析,现在已经优化并验证用于FFPE样本,许多高通量技术正在优化以应用于这些样本[75,76].临床试验的表皮生长因子受体突变和alk.利用FFPE样品可以可靠地进行基因重排。
冷冻标本提供高质量的核酸和蛋白质,并且已被认为是最佳的样品用于大多数分子分析。然而,冷冻不保留组织的形态细节,并且冻结样品的处理和储存需要高度控制的条件和昂贵的基础设施。与福尔马林相比,醇固定产生优异的核酸产率,因为它不会导致福尔马林固定标本中发现的化学变化[71,77].由于细胞学制备的大多数固定剂是醇基,细胞学标本适合于基于dna的分子测定[42].然而,它们可能会改变细胞核的形态学细节,因此不建议用于仍然依赖形态学评价的测试,包括荧光检测原位杂交(鱼类)[78].重金属固定剂不适合大多数分子分析,因为它们会导致DNA片段,固定剂中的金属与镁竞争,并与分子分析中至关重要的其他酶相互作用[79–81].骨是肺癌转移扩散的常见部位。应避免从骨转移瘤获得的标本进行脱钙,且不应使用脱钙溶液处理的组织进行分子测试,因为脱钙溶液会广泛降解DNA [34].这可以通过使用含edta的非酸性脱钙溶液来克服。
用于分子分析的最佳固定时间为6-12小时,对于小型活组织检查样品和8-19小时,适用于较大的手术标本[41].最近的指南建议6-48小时的固定时间在临床分子试验中是可以接受的[33,82].不推荐固定时间<6小时,因为苏木精和伊红染色、免疫组化和FISH分析都受到不利影响。如果固定时间超过48 h, DNA质量变差[72, FISH分析中的信号变弱[78].
病理学家的作用
在个性化治疗的时代,病理学家扮演着分子检测和临床肿瘤学家之间的桥梁的重要角色。病理学家和临床医生之间的沟通是非常重要的,以确定测试的优先为个别患者。当获得标本时,临床数据如肿瘤分期和治疗计划往往是不容易获得的。因此,谨慎处理小的诊断样本是明智的,要记住它们可能是分子检测的唯一可用样本。病理学家应参与样本取样的所有步骤,以确保获得足够数量的样本,并保持样本处于良好状态,以便进行分子分析(表4).
恶性肿瘤诊断确定后,肺癌的进一步组织学分型与确定分子检测策略有关。大多数肿瘤窝藏表皮生长因子受体突变以及alk.基因重排是腺癌或带有腺癌成分的非小细胞肺癌[33].示出比其他腺癌组织学亚型小活检或细胞学样品不排除在非病变活组织检查腺癌成分的存在。此外,腺癌和鳞状细胞癌之间的区分可以小活检样品中具有挑战性。因此,指南建议,如果病理类型为不确定或当鳞状或小细胞癌患者的临床特点有利于表皮生长因子受体mutation-positive子集(例如非吸烟者),最好是发送所述样品分子检测[33].
因为表皮生长因子受体和alk.检测是确定腺癌诊断后做出治疗决定的最重要步骤,CAP/IASLC/AMP指南建议保留最大数量的标本用于潜在的分子检测,限制组织亚型的免疫组化染色的数量[33].对于模棱两可的形态特征的肿瘤,例如没有另外指定特征的NSCLC,已经建议应用每个亚型的一个或两个辅助污渍:用于腺癌的甲状腺转录因子-1 /哒嗪-A /粘蛋白,P63 / p40或细胞角蛋白5/6用于鳞状分化[83,84].如果免疫组化研究未能得出更具体的诊断,则应将剩余组织提交分子检测,而不是进一步耗尽标本进行分型[34].所有可从病人处获得的样本,包括细胞学样本,均应考虑作化验,病理学家应根据样本的品质,决定哪种样本最适合作化验[33,46,47].
当初步诊断时,病理学家订购的反射分子检测将提供一种更容易获得的分子谱,当肿瘤学家看到患者时,但病理学家应与机构临床医生密切沟通,根据个人患者的需要,应优先考虑测试。反射块的制备,涉及当样品最初在预期额外免疫组织化或分子检测中加工样品时切割多个额外的未染色部分,可以防止通过避免块的再切割来浪费组织[34].临床肿瘤学家、病理学家和分子病理学家应共享基本信息。这可以提高诊断的准确性,避免在分子分析中使用的材料的浪费。
结论
对于将受益于有针对性疗法的肺癌患者的基因组分析,肿瘤组织的取样可以被视为恶性肿瘤的代表,并且数量和质量充足至关重要。应在活组织检查时尽可能地获得肿瘤标本。通过病理学家或训练有素的技术人员快速现场评估系统,以确保样品的充分性是在细胞学吸入活组织检查中的一种。诸如肿瘤细胞性以及保存和固定状态的标本质量对于最佳分子分析至关重要。肿瘤遗传异质性的重要性需要进一步调查,并且目前在许多中心进行多重突变分析或下一代测序的意义和临床应用。临床肿瘤学家,病理学家和分子病理学家之间的密切沟通至关重要,以确保获得足够的肿瘤组织以准确组织病理学诊断和分子测试的最佳方式,以及个性化癌症治疗的适当指导。
脚注
胸肿瘤多学科团队管理:不仅仅是一个概念?欧元和J2014;43:1776-1786。第2号:施洛米d,奔阿维R,Balmor GR,等.肺癌筛查:胸部计算机断层扫描大规模筛查的时间。欧元和J2014;44: 217 - 238。No. 3: De Ruysscher D, Nakagawa K, Asamura H.小尺寸非小细胞肺癌的外科和非外科方法。欧元和J2014;44: 483 - 494。第四名:Van Schil PE, Opitz I, Weder W等.恶性胸膜间皮瘤的多峰管理:我们今天在哪里?欧元和J2014;44: 754 - 764。
支持声明:L. Kim获得了特里·福克斯基金会癌症分子病理学培训项目(STP53912)的部分资助。M.S. Tsao是M. Qasim Choksi肺癌转化研究主席。这项工作得到了安大略省卫生和长期照护部的部分支持。
利益冲突:可以在本文的在线版本旁找到披露www.qdcxjkg.com.
- 已收到2013年11月12日。
- 认可的2014年6月22日。
- ©2014人队