文摘
最近,他汀类药物已被证明对肺部炎症有抗炎作用。然而,病毒性肺炎的辛伐他汀的作用机制尚未阐明,尽管病毒感染仍然是一个相当大的健康威胁。在这项研究中,我们提出,辛伐他汀抑制polyinosinic-polycytidylic酸(多聚肌苷酸)全身的气道炎症,如咆哮(激活规范,正常t细胞表达和分泌)表达和炎性细胞的招募。
在支气管细胞,辛伐他汀对聚的影响我:C-induced咆哮表达和信号传感器和转录激活(STAT) 3-mediated信号转导决心使用ELISA和短发卡RNA (sh)系统。保利我:C-induced肺炎小鼠模型,免疫变化辛伐他汀吸入肺部后,如炎症细胞招聘和细胞因子/趋化因子释放,被检查。
在聚我:C-stimulated支气管细胞,咆哮分泌增加了STAT3激活,和辛伐他汀抑制聚我:C-induced STAT3激活,导致抑制咆哮的表情。在BALB / c小鼠刺激吸入聚我:c,咆哮表达式和中性粒细胞浸润到气道升高。然而,辛伐他汀治疗减毒STAT3激活,咆哮释放和随后的肺部嗜中性。
这些发现表明,辛伐他汀抑制气道炎症,但还有其他机制,需要充分阐明。
他汀类药物的抑制剂3-hydroxy-3-methylglutaryl辅酶A还原酶(β),催化作用转换的β-甲羟戊酸;这是胆固醇生物合成途径中的病原反应步骤(1]。他汀类药物,广泛用于降低胆固醇的代理,有很多有益的多效性的抗炎和免疫调节作用与潜在临床应用除了降低(2]。最近,他汀类药物已被证明的危险的患者感染某些类型的肺部炎性疾病(3,4]。F罗斯特等。(5)报道,他汀类药物的风险大大降低死于慢性阻塞性肺疾病(COPD)和显著降低死于流感的风险。此外,临床研究表明,他汀类药物使用与降低患者住院死亡率相关肺炎(6]。
肺炎死亡的主要原因是由于传染病在工业化国家。尽管细菌是肺炎的最常见的原因在成人中,有趣的是,在儿童,高速率的病毒与病毒如流感a或B和呼吸道合胞病毒(RSV)是观察在肺炎球菌肺炎7]。此外,近年来,呼吸道病毒也被认为是一个潜在的成人肺炎的常见原因,发病率的2 - 35% (8]。
尽管越来越多的临床证据作用的呼吸道病毒感染肺炎的发病机理,呼吸道病毒诱导气道炎症的精确机制知之甚少(9]。双链RNA (ds),承认toll样受体(TLR) 3 endocytoplasmic隔间内,是呼吸道病毒复制和代表的副产品炎症刺激。Polyinosinic-polycytidylic酸(多聚肌苷酸),合成病毒dsRNA模拟,也被TLR3,据说参与许多病毒的识别10]。
咆哮(激活规范,正常t细胞表达和分泌),碳碳趋化因子,对t淋巴球chemotatic,单核细胞和嗜酸性粒细胞11]。已知病毒感染的支气管上皮细胞诱导咆哮咆哮与病毒性疾病,分泌诱导气道炎症引起的一些病毒感染在人类和动物模型12,13]。然而,诱导咆哮基因表达的机制在气道上皮细胞尚未完全证明,尽管咆哮表达可能是一个主要元素在病毒感染的发病机制14]。
信号传感器和激活的转录(STAT) 3发挥着潜在的作用在调节炎症反应诱导基因表达的趋化因子、细胞因子和炎症酶(15]。在肺部炎性疾病,STAT3作为上皮调节器的过敏反应在哮喘小鼠模型(16]。然而,很少有研究STAT3在肺部炎症的作用,尤其是viral-induced肺炎。
在目前的研究中,我们假设,保利我:C诱导咆哮通过STAT3表达人类支气管上皮细胞活化。此外,我们调查是否辛伐他汀抑制dsRNA-induced咆哮的表达式,并分析了辛伐他汀的抗炎效果通过的咆哮分泌抑制dsRNA-induced小鼠肺炎模型。
方法
细胞培养
基本正常的人类支气管上皮细胞(NHBE)细胞获得Cambrex(查尔斯城,新泽西,美国)。刺激之前,NHBE在支气管上皮细胞生长培养基培养细胞没有氢化可的松至少2天,因为糖皮质激素的抗炎作用。人类的肺上皮细胞系A549从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。额外的实验细节在网上提供的补充材料。
ELISA
咆哮在浮在表面的游离浓度测量使用特定的酶联免疫试剂盒(研发系统,阿宾顿,英国),根据制造商的指示。
Doxycycline-inducible STAT3短发卡RNA系统
强力霉素(阿霉素)诱导短发卡RNA (sh)系统就是这样设计的,STAT3的表达shRNA当强力霉素诱导添加到培养基中。建立稳定的细胞系表达相反的四环素、强力霉素反应转录激活因子(rtTA),使用Effectene A549细胞转染试剂(试剂盒、阿拉米达、钙、美国)40μg pTet-On (Clontech实验室Inc .,首尔,韩国)编码rtTA。后选择μg·400毫升−1G418 28天,耐药克隆选择。这时,一个阻止诱导H1 RNAi输入向量(美国纽约表达载体,大岛)编码STAT3 shRNA是转染克隆。后选择μg·400毫升−1zeocin 28天,耐药克隆选择和讲究的。最后克隆是稳定转染rtTA和STAT3成分结构。阿霉素用于STAT3基因沉默。
由保利我建立肺炎动物模型:C
辛伐他汀的抗炎效果测试聚我:C-induced肺炎小鼠模型,我们开发了一个实验小鼠模型。6周大BALB / c小鼠(特定的无菌雌性)分成四组:那些鼻内注射30μL PBS (PBS组),100年μg聚我:c在30μL PBS(多聚肌苷酸组),100年μg聚我:c和30μg辛伐他汀在30μL PBS(多聚肌苷酸+ SIM集团),和100年μg聚我:c和2μg中和咆哮抗体在30μL PBS(多聚肌苷酸+α-RAN集团)。所有老鼠敏感天1、2、3和4。2周第一次注射后,老鼠再次挑战(天15、16、17和18)与相同条件下的主要治疗,除了剂量的保利我:C;这是减少从100年μg 50μg。所有的老鼠都牺牲了第二天(19天)。综述了所有实验程序和批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)医学院,首尔国立大学首尔,韩国。
支气管肺泡灌洗液集合
支气管肺泡灌洗液(BALF)收集改编自前面描述的方法(16]。几个BALF中细胞因子水平测量Bio-Plex 200系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国),根据制造商的指示。额外的实验细节在网上提供的补充材料。
免疫组织化学
老鼠都牺牲了,他们的肺灌注与PBS。肺膨胀,甲醛固定在4%。组织中被削减mid-sagittally和嵌入式石蜡固定后24小时。串行部分得到进行组织学分析。额外的实验提供了一个在线数据补充细节。
统计分析
组之间的差异决定使用一个单向方差分析测试。数据表示为±扫描电镜。统计使用t进行了比较。
结果
辛伐他汀抑制咆哮分泌的保利我:C-stimulated肺上皮细胞
我们检查是否聚我:C,一个合成dsRNA病毒组件,会诱发咆哮人类肺泡上皮细胞分泌(A549)和初级NHBE细胞。我们对A549和NHBE细胞聚我:C剂量指示(图1 a和b*表示)或(图1 c和d)。咆哮分泌明显诱导剂量依赖性的方式,大大增加了时间依赖的方式在这两种类型的细胞。这些发现表明,聚我:C诱导咆哮在支气管和肺泡上皮细胞分泌。
接下来,我们决定的影响辛伐他汀在dsRNA-induced咆哮对A549和NHBE细胞分泌。辛伐他汀抑制聚我:C-induced咆哮分泌两种细胞类型(图1 e)和降低聚我:C-induced咆哮转录水平A549细胞(图1 f)。因此,我们得出的结论是,辛伐他汀抑制咆哮mRNA和蛋白表达聚我:C-stimulated支气管和肺泡上皮细胞。
STAT3介导聚我:C-induced咆哮在肺上皮细胞分泌
STAT3参与多种炎症性疾病,其中包括肺。因此,试图定义的角色STAT3在病毒性肺炎,我们检查是否STAT3介导聚我:C-induced咆哮在支气管和肺泡上皮细胞分泌。我们首先开发了一个Tet-On inducible-shRNA表达式,系统显示的方法。前检查STAT3-mediated咆哮表达式,我们检查STAT3阿霉素诱导的转录水平rtTA稳定和rtTA / shSTAT3稳定细胞系(图2 a和b)。rtTA稳定细胞,STAT3成绩单是既定的表达在基础层面上独立于阿霉素剂量。rtTA / shSTAT3稳定细胞,然而,STAT3转录水平下降了强力霉素剂量依赖性的方式。然后,我们调查是否STAT3介导咆哮在保利我分泌:C-stimulated上皮细胞。强力霉素治疗后,保利我:C-induced咆哮rtTA稳定细胞分泌并没有减少,但减少剂量依赖性的方式在rtTA / shSTAT3稳定细胞(图2 c和d)。这些结果表明STAT3基因表达是由聚我:C-induced咆哮在肺上皮细胞分泌。
接下来,我们调查是否STAT3失活,但不是STAT3基因击倒,会抑制聚我:C-induced咆哮分泌。我们使用了STAT3抑制剂s31 - 201,抑制STAT3磷酸化后易位。STAT3失活s31 - 201降低聚我:C-induced咆哮在肺上皮细胞分泌(图2 e)。这不仅表明STAT3基因沉默也STAT3失活抑制聚我:C-induced咆哮生产。
辛伐他汀抑制聚我:C-induced STAT3在肺上皮细胞活化
我们发现,聚我:C-induced咆哮表达式被辛伐他汀抑制和由活跃的STAT3肺上皮细胞。因此,我们测试了辛伐他汀抑制STAT3在保利我激活:C-stimulated上皮细胞。辛伐他汀显著抑制磷酸化STAT3的表达引起聚我:C在A549的剂量依赖性的方式(图3)和NHBE细胞(图3 b)。这些结果表明,辛伐他汀抑制聚我:C-induced咆哮表达式通过STAT3在肺上皮细胞失活。
此外,我们假设STAT3在保利我超表达:C-treated细胞可以恢复的辛伐他汀抑制作用polyI: C-induced咆哮分泌。因此,我们模拟转染或转染野生型STAT3质粒到A549细胞,然后添加聚我:C的媒体的存在与否辛伐他汀(图3 c)。STAT3过度增强聚我咆哮分泌:C-treated细胞。此外,咆哮分泌减少引起的恢复了辛伐他汀STAT3过度聚下我:C-treated条件。这些数据表明,STAT3的表达调节咆哮表达式,这辛伐他汀可能抑制聚我:C-induced咆哮分泌通过STAT3失活。
辛伐他汀抑制咆哮分泌通过失活的一种蛋白激酶和STAT3在肺上皮细胞
可以由多个激酶磷酸化STAT3在细胞质17,18]。因此,我们调查的激酶磷酸化STAT3在保利我:C-stimulated上皮细胞。我们使用AG490 Janus激酶(激酶)2抑制剂,LY294002作为一种蛋白激酶抑制剂,PD098059作为细胞外signal-regulated激酶抑制剂,和PP2 Src抑制剂,治疗NHBE和A549细胞。AG490 (图4)和LY294002 (图4 b)抑制聚我:C-induced咆哮分泌剂量依赖性的方式在这两种类型的细胞,但PD098059 (图4摄氏度)和PP2 (图4 d)没有。因为JAK2激活STAT3在细胞因子或生长因子,我们感兴趣的AKT-activated STAT3表达聚我:C-stimulated上皮细胞。因此,我们量化phospho-AKT水平通过免疫印迹(active AKT形式)。多聚肌苷酸诱导AKT激活3 h后聚我:在A549 C治疗(图4 e)和1 h(保利:C治疗NHBE细胞(图4 f)。AKT激活相对早期相比,STAT3在保利我:C-stimulated上皮细胞,如预期。此外,我们调查是否AKT介导STAT3激活。Phospho-STAT3表达式是剂量依赖性的方式减少了LY294002 (图4 g)。这表明积极AKT介导STAT3在保利我激活:C-stimulated上皮细胞。此外,辛伐他汀抑制聚我:C-induced phospho-AKT表达式剂量依赖性的方式(图4 h)。这些发现表明,辛伐他汀可能通过AKT激活抑制STAT3在保利我脱磷酸化:C-stimulated上皮细胞。
辛伐他汀减轻肺组织病理学改变组织和抑制STAT3激活和保利我咆哮分泌:C在气道上皮细胞
保利我:C-induced肺炎小鼠模型、辛伐他汀减轻肺组织病理学改变组织和抑制STAT3激活和保利我咆哮分泌:C在气道上皮细胞。基于上述数据,我们调查是否在肺辛伐他汀的抗炎效果在活的有机体内。我们首先开发了一个聚我:C-induced肺炎小鼠模型,表示在方法部分(图5)。老鼠牺牲后,我们发现,肺组织部分聚我:C组显示炎症细胞的浸润peri-bronchial(大或小航空公司)和peri-vascular地区(图5 b)通过苏木精和伊红染色。然而,辛伐他汀或咆哮抗体治疗显著地抑制炎性细胞浸润。因此,我们得出的结论是,辛伐他汀抑制炎性细胞招聘到航空公司由保利我:C。
接下来,我们试图确定是否聚我:C诱导STAT3激活和咆哮在肺上皮细胞分泌在活的有机体内,如发现在体外。识别的细胞类型聚我:C-mediated STAT3激活,免疫组织化学(执行图5度)。在PBS组,只有基线STAT3激活中检测出的肺部组织。多聚肌苷酸,然而,导致重大STAT3在气道上皮细胞和免疫细胞激活周围的气道。然而,正如所料,STAT3在气道上皮细胞激活是simvastatin-injected组明显减少。此外,BALF咆哮分泌也增加了保利我:C,但减少了辛伐他汀(图5 d)。这些结果表明,辛伐他汀抑制聚我:C-induced STAT3激活和咆哮气道上皮细胞分泌在活的有机体内,因为它在体外。
进一步检测炎症效果,我们决定是否辛伐他汀几个主要的炎性细胞因子的影响,其中包括相关的辅助细胞(Th) 1型和Th2反应(图S1)。保利我:C小鼠,辛伐他汀显著降低肿瘤坏死因子(TNF) -α,白介素6 (IL)集落刺激因子(gm - csf)、白介素(p70), IL - 4和IL-5分泌。因此,辛伐他汀抑制炎性细胞招聘通过抑制多种促炎细胞因子的生产。
保利我:C-induced肺炎小鼠模型、辛伐他汀抑制中性粒细胞在肺组织招聘
概要聚我:C-induced免疫细胞浸润,BALF微分Diff-Quik染色进行细胞计数。总细胞数的10倍大聚我:C组比PBS组;然而,总细胞和淋巴细胞的数量在辛伐他汀或中和咆哮抗体治疗显示下降趋势(数据未显示)。特别是,中性粒细胞浸润细胞类型主要,辛伐他汀和咆哮的封锁明显减少了聚我:C-induced嗜中性粒细胞(涌入图6)。确认辛伐他汀抑制作用的中性粒细胞招募,我们对肺组织进行了免疫组织化学部分(图6 b)。这些结果也表明,政府的辛伐他汀或中和咆哮抗体浸润在肺组织中性粒细胞的数量减少50% (p < 0.001) (图6 c)。
讨论
在目前的研究中,我们首次证明辛伐他汀抑制一种蛋白激酶/ STAT3-mediated咆哮分泌针对聚我:C在肺泡和支气管上皮细胞在体外。当地辛伐他汀治疗在保利我:C-inhaled老鼠减毒炎性反应,所表示的中性粒细胞减少招聘、促炎细胞因子分泌,咆哮生产和STAT3激活在活的有机体内。这些结果意味着辛伐他汀改善聚我:C-induced肺部炎症通过抑制聚我:C / AKT / STAT3咆哮信号在气道上皮细胞和随后的中性粒细胞浸润。此外,这些结果表明,辛伐他汀能抑制病毒性肺炎的发展在发病的早期步骤因为呼吸道上皮细胞的主要网站呼吸道病毒感染。
近年来,有相当数量的审查论文表明他汀类药物在预防肺炎可能有作用,在患者住院肺炎或改善预后[19),他们的使用可能改善肺炎的不利影响20.]。然而,很少有报道simvastain在病毒诱导的抗炎效果的肺部炎症,如病毒性肺炎。因此,我们希望评估辛伐他汀能否在保利工作我:C-induced肺炎小鼠模型。我们已经表明,辛伐他汀抑制嗜中性,从而抑制STAT3激活和咆哮的分泌在保利我:C-inhaled老鼠(无花果5和6)。除了辛伐他汀的抗病毒效果演示了在这项研究中,还有其他报告表明辛伐他汀有抗菌活性。例如,辛伐他汀是保护期间金黄色葡萄球菌肺炎(21和改善急性肺损伤在链球菌感染22]。最近的一项研究表明,口服辛伐他汀相关生理剂量仅略有预防肺炎球菌病(23]。然而,这些抗炎作用并不仅限于辛伐他汀。伐治疗可能小幅降低肺炎的发生率[24]。接触atrovastatin与降低肺炎的风险(25]。的亲脂性的pitavastatin亲水性普伐他汀也抑制炎性细胞因子的生产在lipopolysaccharide-stimulated人类支气管上皮细胞(26]。因此,这些报告显示,不同的他汀类药物,包括辛伐他汀,可能对炎性疾病起到抗炎作用,如病毒性和细菌性肺炎,虽然还需要进一步的研究来证实这一点。
咆哮是诱发多种免疫细胞的招募发炎组织(27]。同意我们的数据(图5),辛伐他汀显著抑制免疫细胞进入肺组织的渗透,并封锁咆哮显示相同的结果。这些结果可以解释的数据显示,辛伐他汀减弱咆哮分泌通过STAT3失活,我们检测到在体外,导致浸润的中性粒细胞减少。此外,辛伐他汀和中和咆哮抗体减少促炎细胞因子的生产(图S1)。因此,诱导表达的一些细胞因子(il - 6, TNF-αgm - csf和il - 4)的聚我:C是由咆哮,和辛伐他汀更有可能抑制这些细胞因子的分泌抑制咆哮。的一个主要细胞表达咆哮是气道上皮细胞。最近咆哮占据基因表达的机制。RSV引起咆哮生产通过核因子(NF) -κB信号通路在人类支气管上皮细胞(28]。内源性干扰素诱导的人类直接咆哮基因转录调节因子(IRF) 3 (29日]。dsRNA也激活基因转录咆哮通过NF-κB和irf30.]。这些先前的报道表明,呼吸道病毒感染和病毒成分诱导咆哮的表情通过irf和NF -κB信号通路。在这项研究中,我们关注STAT3转录因子识别咆哮的辛伐他汀抑制分泌的机制,因为它激活介导炎症基因表达(15]。我们提供了第一个证据表明一种蛋白激酶/ STAT3激活聚我:C诱导咆哮分泌,而辛伐他汀抑制STAT3灭活AKT激活(图4 gydF4y2Ba)。因此,辛伐他汀抑制一种蛋白激酶/ STAT3信号通路咆哮在保利我:C-stimulated上皮细胞。然而,还需要进一步的研究来全面阐明dsRNA-activated AKT / STAT3信号通路/咆哮,因为很少有报道表明dsRNA-activated AKT介导STAT3激活。我们假设,积极AKT诱发干扰素基因的表达通过NF-κB和/或IRF信号通路,然后激活JAK2-STAT3信号通过自分泌或旁分泌途径。我们有更多问题的机制辛伐他汀抑制聚我:C-induced AKT激活。这些未知的机制表明,辛伐他汀应更详细地研究它的实用性作为药物治疗与病毒感染如肺炎。
在这项研究中,辛伐他汀是老鼠通过鼻路线管理。在动物中,腹腔内注射主要用于动物实验管理的系统性药物。然而,鼻药物管理局已经作为替代路线系统可用性的药物。该方法用于管理药物作用于肺,比如抗哮喘药物,因为药物由吸入可以通过气管进入肺部。此外,鼻粘膜一类药物传输系统提供了一个理想的网站,和药物管理通过这条路线一般工作迅速(17]。最近,Xuet al。(18)报道,辛伐他汀由吸入和气管内的注入了更有力的影响比腹腔内注射和填喂法。他们的研究结果还表明,吸入运送路线导致了更高的地方肺组织中的药物浓度和血浆中药物浓度低于填喂法获得的。因此,他们建议辛伐他汀是一个潜在的抗炎药对气道炎症与属性适合交付通过吸入,这可能会减少副作用,提高临床疗效,如我们预期。然而,我们使用聚我:C在本研究模拟病毒性肺炎。应该注意的是,我们的研究集中在聚我辛伐他汀的抗炎机制:C-induced肺炎模型,这限制了潜在的结论对辛伐他汀的作用在呼吸道病毒感染肺炎模型。
总之,辛伐他汀和中和咆哮抗体显著抑制聚我:C-induced中性粒细胞招聘在肺部。此外,我们发现辛伐他汀能抑制STAT3-mediated咆哮分泌,导致抑制嗜中性聚我:C-induced肺炎。重要的是要了解病毒性肺炎的发病机理和开发一个特定的和有用的抗病毒或抗炎药对个人炎症条件。因此,基于本研究中的数据,我们建议辛伐他汀应该考虑一种新药候选病毒性肺炎,尤其是中性粒细胞炎症由病毒组件,尽管细节的机制抑制气道炎症的辛伐他汀会完全阐明。
脚注
社论评论看1010页。
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这项工作是支持的韩国国家研究基金会(NRF)资助的赠款朝鲜政府格兰特(MESF)(编号2010 - 0027827,2011 - 0010571和2011 - 0010571)。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2012年3月24日。
- 接受2012年7月7日。
- ©2013人队