抽象
中性粒细胞的寿命对中性粒细胞驱动的肺部炎症的强度和持续时间有决定性的影响。基于溶质外显素的相容性,我们的目标是防止由肺部炎症微环境触发的中性粒细胞的抗凋亡反应。
慢性阻塞性肺疾病患者和对照组的中性粒细胞暴露于有或无胞外毒素的炎症介质和外源性生物制剂中。的在活的有机体内这种方法的相关性已在外源性诱导的大鼠肺部炎症中得到验证。
细胞凋亡率的减少离体所有研究组暴露的中性粒细胞在有ectoine存在的情况下显著恢复。然而,炎症刺激未改变细胞自然凋亡率,ectoine未改变细胞自然凋亡率。机制分析表明,胞外素对抗凋亡信号的诱导具有预防作用。动物单次或多次暴露于环境颗粒引起的嗜中性粒细胞性肺部炎症,经ectoine干预后减轻。支气管肺泡灌洗液中嗜中性粒细胞的分析表明,支气管肺泡灌洗液中嗜中性粒细胞的含量较高在活的有机体内作用是由于中性粒细胞凋亡的恢复。
Ectoine是一种高顺应性溶质的化合物,在解决肺部炎症方面显示出一种可再生的、强有力的作用。
肺的中性粒细胞炎症是针对病毒和细菌病原体的先天性免疫应答[的一个重要组成部分1]。嗜中性粒细胞通过含有趋化因子CXCL8(白细胞介素(IL)-8)的免疫复合物从循环中被吸入气道,趋化因子CXCL8 (IL)-8是由炎症细胞或上皮细胞分泌的[2]。病原体受到活性氧释放和病原体破坏酶的影响,如髓过氧化物酶、弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶。然而,这些反应对肺组织也有不利影响,因此,中性粒细胞的炎症被严格控制,以便在成功防御病原体后不会持续。因此,当中性粒细胞进入肺时,细胞内信号级联被触发,导致中性粒细胞凋亡,最终通过巨噬细胞介导的吞噬作用将其清除[3]。
除了生物病原体,肺部炎症也可以由职业或环境暴露引起的外源物来或吸烟[4]。持续暴露可能导致慢性肺部炎症,最终导致严重的肺部疾病,如慢性阻塞性肺病(COPD)。因此,COPD的一些治疗方法侧重于中性粒细胞性肺部炎症的解决[五]。不幸的是,消炎药,糖皮质激素的最重要的群体,这在其他类型的炎症可靠地减少炎症细胞数量,不能有效COPD的治疗[6]。研究嗜中性粒细胞的糖皮质激素抵抗的分子机制暗示从异生素的曝光和/或炎性细胞本身对由组蛋白脱乙酰[调节糖皮质激素受体活性的影响,氧化应激7]。
因此,另一种减少慢性肺部炎症中中性粒细胞数量的方法是基于这样一个概念,即如果炎症微环境引发的抗凋亡反应被阻止,中性粒细胞的寿命可能会缩短[8]。在促炎症的情况下,炎症介质等粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或白三烯(LT)乙4抑制自然凋亡[9,10]。PI3-K(磷脂酰肌醇3-激酶)和Akt的活化(蛋白激酶B)信令降低MCL-1,嗜中性粒细胞的主要抗凋亡蛋白的蛋白水解周转,从而延迟自然调度凋亡导致增加的局部炎症反应[11]。因此,开发了针对抗凋亡信号的药物策略通过一种蛋白激酶(12]。该信令级联,但是,在不同的细胞类型,并在该水平药理学干预多效作用可具有严重的副作用[12]。
从细菌到高等脊椎动物的许多细胞都在使用相容的溶质,以对抗诸如渗透压力、高温或干燥等极端情况。13]。众所周知,这些锌离子物质不会在很大的浓度范围内干扰生理过程。通过与大分子水化层的相互作用,这些物质的存在似乎促进了热力学稳定构象。基于“优先排斥”的生物物理原理[14]这些物质对大分子有稳定作用,因此可用于其他系统,包括生物技术应用,以及对皮肤护理产品和皮肤病学应用有有益作用[15]。我们以前曾表明,四氢嘧啶,兼容溶质从盐单胞菌泡桐当它在老鼠的肺部[滴注,耐受性好16]。在这些研究中,依克多因减小的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化和IL-8表达的肺上皮细胞在体外,以及经气管内注射纳米炭(CNP)的动物[17]。环境相关模型粒子诱导这些端点被证实是由PI3-K和Akt信号事件特异性介导的[18,这表明,相容的溶质,特别是胞外毒素,可以阻止这种机制介导的分子应激反应。
在本研究中,我们提出了一个问题,即兼容的溶质外毒素是否能够阻止应激诱导的调节中性粒细胞凋亡的信号通路。19]。当直接应用于动物的肺四氢嘧啶耐受性好,也可能是对中性粒细胞肺部炎症的治疗,特别是,COPD是有用的,。因此,我们评估了依克多因在健康志愿者,COPD患者和临床对照隔离中性粒细胞凋亡预防的影响。在另一组实验中,研究依克多因肺中性粒细胞凋亡及肺部炎症持续存在的影响在活的有机体内在动物与环境模型的粒子治疗。
方法
志愿者和患者
年轻健康志愿者组由6名男性和4名女性组成(年龄29.9±4.2岁)。将稳定期COPD男性患者与对照组男性患者进行比较。人口统计资料以及患者和对照组的健康状况(包括COPD标准)见下表表格1。两组都是从一组有冠状动脉疾病症状的患者中招募的。所有受试者均通过临床病史、体格检查、休息时心电图和常规化学分析进行筛选。药物在调查当天就停止了。严重慢性心力衰竭、肾功能不全(肾小球滤过率<30 mL·min)患者-1),一种恶性疾病,一种炎症性疾病,其表现为c反应蛋白>5 mg·L升高-1,脉管炎或雷诺氏综合征被排除在外。该研究通过对海因里希 - 海涅大学杜塞尔多夫(德国杜塞尔多夫)的人类研究当地的伦理委员会,并从入学前所有受试者获得书面知情同意书。
人中性粒细胞的分离和治疗
中性粒细胞分离和细胞凋亡测定如前所述[19]。有颗粒或炎症介质,依克多因(在PBS中)或PBS(假手术对照组)治疗前2个小时加入到该培养物中。然后将细胞用33微克·毫升处理过-1CNP在PBS中,300nm LTB4(Calbiochem公司/默克,诺丁汉,UK)在0.1%EtOH中,或20纳克·毫升-1GM-CSF(Cell Signaling Technology公司,贝弗利,MA,USA)的PBS。将细胞6小时(对于信号蛋白的分析)和16小时(对于细胞凋亡的测定)后收获,从相同的样本。
凋亡细胞的定量
血液中性粒细胞(4×10五300年)被暂停μL包含propidium碘低渗的解决方案。流式细胞仪检测碘化丙啶的红色荧光;BD生物科学,圣何塞,加利福尼亚州,美国)。最少10个4事件每个样品进行计数。如先前所述进行Western印迹和相应的蛋白质制剂[17,19]。
颗粒悬浮液和复合溶液
CNP(碳黑,Printex 90;Degussa,法兰克福,德国)和ectoine溶液((S)-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸,无脂溶氰,超纯99%;(bitop AG, Witten,德国)的特征和制备方法如前所述[17]。
动物实验
雌性费舍尔344只大鼠(8周龄; Charles River实验室,苏尔茨费尔德,德国)滴入-气管内用0.4毫升的颗粒悬浮液,吸入麻醉下依克多因溶液(给药量等在图中所示)或PBS(异氟烷5%,2分钟)。动物放血戊巴比妥麻醉下处死,后所示时间。肺灌洗使用4×5毫升PBS进行。差分细胞计数后,姬姆萨/月 - 格伦沃尔德染色灌洗细胞的进行。无细胞灌洗液被用于细胞因子测定。肺组织切碎,休克冷冻并储存在-80℃直至进一步使用。所有的动物实验均按照德国动物保护法相关的许可后进行。髓过氧化物酶,通过ELISA使用大鼠髓过氧化物酶试剂盒(细胞科学,广州,MA,USA)进行测定。对于凋亡的测量,从每只动物灌洗细胞悬浮于1mL的PBS中,并经受离心分离的Percoll(Biochrom,德国柏林)。 Cell pellets were washed once with PBS and resuspended in 300 μL hypotonic solution (0.1% sodium citrate, 0.1% Triton X 100) containing 50 μg·mL-1碘化丙啶和随后进行荧光测量。
统计
由于数据的对数正态分布,对数转换后进行统计分析。ANOVA在整个使用(PROC MIXED,SAS 9.2; SAS Institute公司,卡里,NC,USA)。如果使用适当,重复方差分析的措施(PROC GLM,SAS 9.2; SAS Institute公司)。主要影响和相互作用进行了测试。变化相对于相应的对照估计并与他们的95%置信区间(95%CI)中给出。一个结果被认为是统计学上显著当p值<0.05。避免了多次测试。每个实验的主要假说进行了测试。在每个实验两种试验的假设的罕见的情况下,Bonferroni校正施加(p值= 0.025)。每个实验以图形由一个图中表示。 Data are depicted as mean±sd。
结果
依克多因在分离的人中性粒恢复自发凋亡
从年轻的健康志愿者中分离出外周血中性粒细胞,然后进行模拟肺部炎症情况的治疗(图。图1A和1B)。除炎性介质GM-CSF外(20 ng·mL)-1)和LTB4(300纳米),CNP(33微克·毫升-1),被认为是超细粒子空气污染的代表[20.,用于细胞治疗。所有这些促炎刺激物均可显著降低暴露16小时后凋亡中性粒细胞的百分比(95% CI 0.53-0.69) 0.61倍(95% CI 0.53-0.69) (图。图1A和1B)。这种效果是相等使用的三个兴奋剂。炎性介质或颗粒预处理嗜中性粒细胞的具有四氢嘧啶2小时1mM的前几乎完全恢复凋亡率(0.82,95%CI 0.82-0.99),独立于抗凋亡剂和皆呈显著(重复测量ANOVA,F检验p <0.0001)。
一般来说,中性粒细胞不能很好的消炎疗法,如糖皮质激素治疗反应[6而且,就慢性阻塞性肺病而言,甚至可能对这种治疗产生耐药性[7]。因此,我们对慢性阻塞性肺病患者和临床对照个体(图1c和d)。虽然在这些组中观察到较高的本底凋亡率,但所有三种炎症刺激均减少了来自临床对照组和COPD患者的凋亡细胞数量(分别为0.49、95% CI 0.42-0.59和0.58,95% CI 0.50-0.67)。同样,在两组细胞中使用ectoine预处理后,这一降低值要小得多(0.87,95% CI 0.80-0.95, COPD患者,95% CI 0.79-0.90,对照组,0.84,95% CI 0.79-0.90)。结果证明,这些效应是显著的(p<0.0001),且与炎症刺激物和COPD状态无关(重复测量方差分析,f检验)。
四氢嘧啶用作预防在膜 - 耦合信令的电平
的细胞和分子机制ectoine对细胞凋亡的影响进一步研究在中性粒细胞从健康志愿者接受碳颗粒(33μg·毫升-1)。增加ectoine浓度逐渐恢复细胞凋亡率(图2一个)。ectoine效应显著(重复测量方差分析,f检验,p<0.001)。为了研究外突素本身是否具有促凋亡活性,来自三名男性和两名女性供者的人类中性粒细胞暴露于大剂量的外突素(0.01 - 10mm) (图2 b)。与假手术对照组相比,未检测到ectoine效应(p=0.3024)。
作为下一个步骤,四氢嘧啶的抗凋亡信号的影响进行了调查。为此,从健康志愿者分离嗜中性粒细胞进行了分析的Ser Akt磷酸化473作为PI3-K信令的特定下游事件。相比于在Western印迹分析总Akt的量的磷酸化水平呈显著(重复测量ANOVA,F检验,p <0.0001 Bonferroni校正后)该途径通过CNP,GM-CSF和LTB的活化4(图2 c),表明所有的抗凋亡刺激触发相同的抗凋亡途径。重要的是,在所有的三种情况下,预孵育四氢甲基嘧啶羧酸防止该途径的活化人中性粒细胞的。在这些细胞中,磷酸化水平并没有从这些抗凋亡刺激的应用程序之前显著不同。的四氢嘧啶效果显著(重复测量ANOVA,F检验,p = 0.012 Bonferroni校正后)。由于Akt活化的结果,量的抗凋亡Mcl-1的用CNP,GM-CSF和LTB治疗后增加4(3.0倍,95% CI 2.0-4.4)。ectoine预处理在很大程度上阻止了这一关键的抗凋亡事件(1.6倍,95% CI 1.0-2.4) (图2 d)。同样,四氢嘧啶效果显著(重复测量ANOVA,F检验,p = 0.0173)。
胞外素可恢复细胞凋亡率在活的有机体内并降低预先存在的中性粒细胞炎症
接下来我们研究了外吐素是否也有预防作用在活的有机体内探讨气管内注射异种生物模型颗粒致菲舍尔344大鼠肺中性粒细胞炎症反应。中所描绘的一样图3a,炎症首先由2.5毫克单次滴眼诱导·公斤-1CNP接着在第1天和第2天给予在第3天两个连续四氢嘧啶的应用程序,进行支气管肺泡灌洗(BAL)和标本进行分析的中性粒细胞凋亡,以及炎症参数。如图3b显示,单独CNP曝光显著降低凋亡细胞(0.59,95%CI 0.45-0.78),表明抗凋亡机制已被CNP和/或CNP-触发炎性介质引发的百分比。在CNP-暴露动物随后用0.1mM或1mM四氢嘧啶处理两次,观察到中性粒细胞凋亡的改进(0.64,95%CI 0.48-0.84或0.82,95%CI 0.62-1.07,分别地)。被证明是统计学显著的依克多因作用(p = 0.0215,ANOVA,F检验)。
重要的是,晚期中性粒细胞凋亡与肺炎症的显著减少相关(以中性粒细胞百分比和BAL中cinc1(中性粒细胞招募IL-8同源物)的数量来衡量)(图3c和d)。在CNP暴露后,与未暴露CNP相比,BAL中5cj -1浓度升高4.4倍(95% CI 3.2-5.6),升高3.1倍(95% CI 2.4-4.0)。在额外应用1 mM胞外素后,5j -1的浓度升高到2.1倍(95% CI 1.6-2.6),中性粒细胞数量升高到3.1倍(95% CI 2.2-4.4)。ectoine效应对两种结果均有显著性意义(方差分析,f检验,p=0.0005)。通过测量髓过氧化物酶(图3 e)。髓过氧化物酶水平升高19.6倍(95% CI 11.6-41.8)。在额外使用ectoine(方差分析,f检验,p=0.0633)后,这一增加降低到10.3倍(95% CI 5.3-60.8)。我们之前报道过CNP激活肺上皮细胞中MAPK细胞外信号调节蛋白激酶1和2 (Erk1/2) [21]。对动物肺匀浆中Erk1/2磷酸化的评估显示,ectoine也显著降低了这种组织反应(p=0.0166,方差分析,f检验)(图3 e)。总而言之,这些观察结果有力地表明,胞外素可以减少业已存在的嗜中性肺炎症。
重复外源性曝光期间四氢嘧啶影响在活的有机体内
在真实的生活场景,然而,慢性炎症会导致连续曝光,而不是从单一暴露于外源性化学物质。为了模拟这种情况,我们给予依克多因(1毫摩尔)后两次一个,两个或CNP三个滴注(图4)。在这些实验中,每次CNP应用均可显著降低中性粒细胞的凋亡率至66.0% (95% CI 53.9-80.9%),每次应用1 mM胞外素两次后均可恢复中性粒细胞的凋亡率(85.8,95% CI 69.6-105.9%)。在所有三种暴露场景中,恢复效果都是一样明显的,暴露场景和ectoine效应之间没有显著的相互作用。ectoine效应显著(方差分析,f检验,p=0.0091) (图4 b)。
在炎症水平上也观察到胞外素治疗的预防作用。在所有实验条件下,ectoine显著降低了cnp处理的大鼠BAL中的中性粒细胞数量和5j -1水平(图。4c和d)。这些效果显著(P <0.0001,ANOVA,F检验)对于两个端点及效果的尺寸同等地在所有的三个暴露情景明显。四氢嘧啶的治疗效果也通过从动物BAL中炎性细胞因子与现有的预炎症的比较测量使用膜耦合的细胞因子阵列证实。图4e表明,除了cinc-1之外,其他一些炎性因子(肿瘤坏死factor-α,gm - csf, IL-1αIL-1β,il - 4、il - 6和cinc-2),高架由于异型生物质颗粒治疗,在ectoine治疗显著降低41.2% (95% CI 31.4 -54.1%,重复测量方差分析,野生p < 0.0001)的价值没有ectoine,而interferon-γ和抗炎il - 10只更改为81% (95% CI 48.0 - -137%)的价值在治疗之前,这并不重要。
胞外毒素持续降低大鼠肺中性粒细胞数目
接下来,我们研究了胞外素的预防作用是否在炎症过程中持续存在。为此,2.5 mg·kg-1CNP的注射一次,有或没有依克多因,在动物的肺。动物在不同时间点曝光后处死,从12小时到1周(168小时),得到BAL。有趣的是,四氢甲基嘧啶羧酸的效果随时间变化显著(ANOVA,相互作用时间×依克多因的效果,F检验p <0.0001)。12小时和CNP的应用后24小时,依克多因没有显著减少颗粒 - 处理的大鼠的肺嗜中性粒细胞的数量(图。5A)。在显着对比,从48小时到168ħ嗜中性粒细胞的由四氢嘧啶的减少显著(P = 0.002)。未经治疗四氢嘧啶中性粒细胞数为1.2倍(95%CI 1.1-1.4)比用随时间没有进一步的变化治疗更高。类似地,从48小时起,CINC-1浓度在BAL分别为2.5(95%CI 2.0-3.08)倍更高CNP治疗比附加依克多因治疗(P <0.0001)后后(图。5B)。
讨论
胞外素治疗可防止人中性粒细胞的抗凋亡反应
长期暴露于可吸入外源性物质引起嗜中性粒细胞肺部炎症导致肺气肿和慢性阻塞性肺病[22]。在这种情况下,外源性生物制剂会触发促炎细胞因子和趋化因子的释放,从而导致中性粒细胞的流入和激活[23]。在这种情况下,无论诱发因素如何,慢性中性粒细胞炎症是坏死组织损伤、中性粒细胞募集和活化增加的恶性循环的主要致病机制[24]。中性粒细胞的炎症仍然存在,或者由于持续的组织破坏而加剧,即使当诱导因子被移除,如。戒烟后[4]。在这种情况下炎性嗜中性粒细胞成与炎性介质,并且还与正在进行的曝光期间存在的生物异源物质接触。嗜中性粒细胞的寿命不仅可以通过细胞因子的同时也得到了外源性物质自身进行扩展。
在这一理念,我们的数据清楚地表明,人类的中性粒细胞自发性凋亡不仅是由GM-CSF和LTB抵消4还有超细碳颗粒,它们是大气颗粒物污染的主要组成部分[20.]。一些细胞中的CNP能够诱导氧化应激,从而触发膜信号通路[25]。氧化应激已经被描述为抗细胞凋亡途径的嗜中性粒细胞中[触发26]。我们的数据表明对可能正在进行的曝光期间有助于炎症的持久性人中性粒细胞环境有关的可吸入颗粒物的直接抗凋亡作用。
此外,本研究提供了令人信服的证据,所述相容性溶质四氢嘧啶能够防止由炎性刺激物诱导的嗜中性粒细胞的抗细胞凋亡反应。这一结论是基于以下意见。1)从诱导的CNP为环境有关的模型颗粒年轻健康志愿者分离嗜中性粒细胞的或由炎症介质抗凋亡反应是完全防止。2)调查从男性COPD患者,以及来自临床对照个体的中性粒细胞时,观察由四氢嘧啶一个突出的预防抗凋亡反应。3)抗细胞凋亡膜偶联的信号传导途径的炎症刺激嗜中性粒细胞活化是防止四氢嘧啶的存在。
Ectoine起预防作用,而不是促凋亡作用
由于ectoine没有改变未受CNP或炎症因子刺激的中性粒细胞的凋亡率,我们认为ectoine没有促凋亡作用。相反,我们的数据与ectoine有能力阻止已知在炎性微环境中激活的抗凋亡机制的假设是一致的。
涉及PI3-K和Akt的细胞信号传导级联已被描述为用于LTB的抗凋亡作用的关键机制4和gm - csf (9,10]。同样的途径确认得到的CNP诱导的氧化应激触发[25,27]。有趣的是,在一些系统中,胞外素已经被证明可以防止应力诱导的膜依赖性信号级联。在人角质形成细胞中,通过防止细胞膜脂筏中的第二信使神经酰胺产生的机制,ectoine预处理可以减少紫外线A辐射应激反应[28]。此外,相容性溶质四氢嘧啶和羟基最近发现作用于脂质单层和双层并影响细胞膜流动性[29]。Akt信号的减少导致了Mcl-1水平的降低,这表明这一膜耦合通路是ectoine在中性粒细胞和上皮细胞中发挥预防作用的靶点。
Ectoine作为一种治疗策略,以减少正在进行的中性粒细胞肺炎症
对四氢嘧啶的肺部炎症的治疗效用的关键问题是,防止延迟中性粒细胞凋亡是否有可能减少炎症持续的过程中,中性粒细胞浸润的潜力。在这方面,我们已经清楚地表明,在在活的有机体内碳颗粒诱导的肺部炎症的模型中,依克多因恢复中性粒细胞凋亡率,并在同一时间减少肺部炎症。
然而,在人类中,情况可能更复杂。治疗或预防策略必须处理这样一个事实,即这些干预措施可能被炎症本身的自我延续机制和/或持续暴露于空气污染中而抵消。在本研究中,我们发现,在重复暴露于CNP的动物中,ectoine可重复地预防延迟凋亡和减少炎症反应。因此,我们认为,在可能代表人类现实生活情况的条件下,ectoine可以减少中性粒细胞性肺部炎症。
我们还表明,在整个期间的影响外毒素引起的肺部炎症由一个单一的颗粒暴露。有趣的是,在BAL中,中性粒细胞募集5j -1的一般释放模式与双相反应一致。这种动力学可以用产生这种趋化因子的不同细胞类型来解释。在招募早期,5j -1可能主要由上皮细胞和巨噬细胞产生,而在随后的时间点,逐渐增长并最终主导中性粒细胞数量的可能是5j -1释放的原因。这意味着外突素不仅影响肺上皮细胞,如前所述[17,尤其是中性粒细胞。不管cinc1表达模式如何,这些在活的有机体内数据证明四氢嘧啶对中性粒细胞数和CINC-1水平的高度可再现的,坚固的和持久的效果,导致肺部炎症的加速分辨率。
中性粒细胞的补充似乎不直接受外突素的影响。在炎症诱导后的早期时间点(12小时和24小时),当中性粒细胞数量被趋化因子介导的内流控制时,在暴露的动物中观察不到外显素效应。然而,当考虑到细胞凋亡率的差异影响嗜中性肺炎症时,ectoine的作用变得明显。这些数据证实了早期研究的发现,我们观察到,在脂多糖应用的4小时内,中性粒细胞迅速补充不受胞外毒素的影响[17]。这两种结果表明,四氢嘧啶不抑制中性粒细胞大量涌入所必需的病原体的辩护。
在最近的实验中选择的CNP暴露方案主要是为了快速诱导严重的炎症反应。它使用了高剂量的CNP,在人的肺中,这很可能是一个需要多年环境暴露的累积过程的结果。因此,我们认为本研究采用的暴露方案高估而非低估了人类暴露场景。因此,持续暴露于环境空气污染的病人也可能受益于定期使用兼容的溶质,这些溶质被描述为一组非常顺从的天然物质,目前对人体没有已知的副作用[三十]。到目前为止,关于人类吸入ectoine的吸入研究尚未发表。作为治疗慢性嗜中性粒细胞性肺部炎症的首选方法,其可行性和有效性有待进一步研究。
综上所述,本研究的数据表明,在环境模型颗粒诱导的中性粒细胞炎症动物肺内灌注相容溶质外毒素具有显著的治疗作用。Ectoine的作用似乎是通过防止抗凋亡反应和减少肺浸润中性粒细胞的寿命。不论外源性药物或促炎因子是否延缓中性粒细胞的凋亡,也不论研究碳颗粒暴露后从患者、对照者或志愿者中分离的人血液中性粒细胞或吸入的肺中性粒细胞,均观察到外周效应。因此,我们提出,兼容的溶质,如胞外素,可能在临床环境中有效地用于治疗中性粒细胞性肺部炎症。
致谢
R.维尔特和W.布鲁克的优秀的技术援助,以及专业人士的帮助与S.马丁和P.GROβ的动物饲养(所有IUF - 环境医学,杜塞尔多夫,德国莱布尼茨研究院)表示诚挚的谢意。
脚注
支持声明
这项研究是由来自Ministerium项目资金献给UMWELT Naturschutz UND Reaktorsicherheit(BMU),德意志研究联合会(GRK 1427和SFB 728),Zukunftswettbewerb NRW和bitop AG支持。
感兴趣的语句
针对KRAMER U.,A的Bilstein,J. Krutmann和K.非油炸和研究本身的兴趣报表,可以发现www.www.qdcxjkg.com/site/misc/statements.xhtml
- 收到2011年8月2日。
- 公认2012年7月16日。
- ©2013人队