摘要
虽然众所周知,吸烟者易患严重肺炎球菌疾病可能是由于局部宿主防御功能受损,但人们对烟雾暴露对气道病原体或其毒力因素的直接影响知之甚少。在本研究中,我们研究了卷烟烟气冷凝物(CSC)对生物膜形成的影响链球菌引起的肺炎以及其主要毒素溶血素的成孔活性。
肺炎球菌暴露于CSC (20-160 μg·mL)后形成生物膜−1)采用结晶紫分光光度法测定,重组溶肺素的成孔活性采用呋喃-2/乙酰氧基甲酯分光光度法测定,以监测细胞外钙的摄取2+通过分离的人类中性粒细胞。
在80和160 μg·mL时,暴露于CSC的肺炎球菌或溶肺素可显著增加生物膜的形成(p≤0.05)−1)和溶血素成孔相互作用的实质性衰减。
吸烟导致的生物膜形成增强和溶肺素失活可能有利于微生物定植和持续存在,这两者都是肺炎球菌疾病的基本前体。
有机体链球菌引起的肺炎是全世界发病率和死亡率的主要原因。它通常引起中耳炎、脑膜炎和肺炎,年轻人和老年人特别容易受到伤害,而在感染艾滋病毒的人中,所有年龄组都受到影响。尽管新出现的抗生素耐药性构成威胁,但接受适当抗菌化疗的严重肺炎球菌疾病患者仍有很大比例死亡[1].重要的是,吸烟是侵袭性肺炎球菌肺炎的最强独立风险因素,影响免疫能力强的非老年人,并造成一半的疾病负担,显然是通过促进定植,而定植是侵袭性疾病的先决条件[2].
虽然吸烟习惯诱发严重肺炎球菌疾病的确切原因尚不完全清楚,但吸烟介导的气道宿主防御损伤已被认为是有关联的。然而,人们对吸烟对肺炎球菌的直接影响知之甚少。在目前的研究中,我们研究了暴露于香烟烟雾冷凝物对肺炎球菌生物膜形成的影响,以及对其成孔、促炎毒素、溶肺素的生物活性的影响。生物膜是一种自行生成的聚合物基质,可使肺炎球菌和其他微生物病原体免受宿主防御和抗生素的侵害,促进细菌的存活[3.].相反,被许多人认为是肺炎球菌最重要的毒力因子之一的溶血素,通过它与气道上皮细胞相互作用,这是一种早期炎症反应,主要涉及控制定植的中性粒细胞[4].
材料与方法
菌株
一种对抗生素敏感的临床分离物肺炎链球菌菌株172(血清型23F,多位点序列型(MLST) 81)由南非约翰内斯堡国家传染病研究所(NICD)提供。该菌株在37°C、5% CO的气氛中生长至对数中期2色氨酸豆汤(TSB);默克公司,达姆施塔特,德国),然后对培养物进行浊度定量标准化,代表6.14×106菌落形成单位(cfu)·mL−1使用或不使用香烟烟雾冷凝水(CSC)进行治疗。对菌株3328(血清型14,MLST ST230)也进行了有限数量的实验嗯表达大环内酯的肺炎球菌耐药菌株。
化学品和试剂
除非另有说明,所有化学品和试剂均从Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA)获得。
香烟烟雾冷凝水
CSC购自Murty Pharmaceuticals (Lexington, KY, USA),最终浓度分别为20、40、80和160 μg·mL−1。所有实验均采用溶剂对照(二甲基亚砜(DMSO))。一根香烟燃烧时产生的冷凝水总量为26.3 mg [5];因此,本研究中使用的CSC浓度与吸烟习惯有关。
CSC对紫花苜蓿生长的影响肺炎链球菌
肺炎链球菌接触CSC (20-160 μg·mL−1)或在5% CO的气氛中,在37℃下进行16小时的溶剂控制2。浮游细菌的生长是通过标准活细胞计数程序来确定的。
CSC对生物膜形成的影响肺炎链球菌
培养培养基中的细菌暴露于CSC (20 ~ 160 μg·mL)−1)或溶剂控制在37℃,5% CO下16小时2,在六孔组织培养板中促进粘附和生物膜的形成。孵育后,去除不粘附的细菌和培养基,用PBS (0.15 M;Beckton Dickinson and Co., Sparks, MD, USA)。去除所有未结合的细菌后,用0.1%结晶紫对生物膜进行染色,去除多余的染料,用PBS洗涤5次。通过添加96%乙醇将结晶紫从贴壁细菌中释放出来,并使用PowerwaveX (Bio-Tec Instruments Inc., Winooski, VT, USA)读板仪在波长570nm处分光光度法测定所形成的生物膜的数量。
中性粒细胞
这项研究得到了南非比勒陀利亚大学健康科学学院研究伦理委员会的批准(议定书号S1/2011)。
纯化中性粒细胞由肝素化(5 U·mL)制备−1健康成人志愿者的无防腐剂肝素静脉血。这些细胞通常具有高纯度(>90%)和活力(>95%)[6].
荧光光谱法测定细胞质钙2+
本实验用重组溶血素(20 μg·mL)−1) [620或40 μg·mL−1CSC或DMSO在室温下控制10分钟。然后根据细胞外钙的摄取量评估CSC对溶肺素成孔活性的影响2+使用荧光Ca2+-敏感染料fura-2/乙酰氧基甲酯[6].中性粒细胞(1×107每mL)预载fura-2/AM (2 μM, final), 37℃下PBS中30分钟,洗涤两次,重悬于无指标的Hanks平衡盐溶液(HBSS;Highveld Biological,约翰内斯堡,南非)。fura-2/ am负载的中性粒细胞(2×106(每mL)在37°C下预孵育10分钟后,转移到一次性比色皿中,在日立650 10S荧光分光光度计(日立高技术公司,东京,日本)中于37°C下保持,激发波长为340 nm,发射波长为500 nm。在获得稳定的基线(~ 1分钟)后,将中性粒细胞暴露于3 μL csc处理或未处理的(对照)溶血素和细胞质Ca的改变2+在7分钟的时间内监测浓度。每个比色皿中的最终体积为3ml,总共含有6×106溶气血素和CSC终浓度均为20 ng·mL−120或40 ng·mL−1,分别。在这些浓度下(20和40 ng·mL)−1), CSC对中性粒细胞没有影响(数据未显示)。
统计分析
分别进行了5次和6次实验,测定了CSC对菌株172的生长和生物膜形成的影响,以及对溶肺素生物活性的影响,并对菌株3328进行了3次实验。结果分别以95%置信限的中值或生物膜和溶肺素实验的fura-2/AM荧光示踪表示。采用Mann-Whitney u检验(双尾)计算统计学显著性;p值≤0.05为显著性。
结果
CSC对植物生长和活力的影响肺炎链球菌
CSC (20 ~ 160 μg·mL)的作用−1)浮游生物的生长肺炎链球菌菌株172显示在图1一个。凝析液对菌株172的生存能力没有显著影响,菌株3328的情况也是如此(数据未显示)。
CSC对生物膜形成的影响肺炎链球菌
CSC (20 ~ 160 μg·mL)的作用−1)对菌株172形成生物膜的影响肺炎链球菌都显示在图1 b。肺炎球菌暴露于CSC后,生物膜形成呈剂量依赖性增加,在80和160 μg·mL时达到统计学意义−1。以菌株3328为例,暴露于CSC 80和160 μg·mL−1导致生物膜形成显著(p<0.001)增加,对照组的光密度中位数(OD)值(95%置信上限)为80和160 μg·mL−1csc处理体系分别为0.074(0.0778)、0.092(0.0982)和0.117(0.1595)。
CSC对溶血素生物活性的影响
中性粒细胞暴露于未经处理和csc处理的溶血素对毒素成孔活性的影响,根据细胞外钙的流入来测量2+都显示在图2。暴露中性粒细胞控制溶血素20 ng·mL−1随后是滞后期约20 s,此后由于细胞外钙离子的流入,荧光强度突然增加2+在中性粒细胞中加入csc处理过的溶气素与滞后期延长(1.5-2.5分钟)相关,随后是胞质钙内流的显著(p<0.0028 - <0.0002)衰减2+,与成孔活性的丧失相适应。
讨论
本研究的结果清楚地表明,将肺炎球菌以代表吸烟习惯的浓度暴露于CSC 16小时,不仅会在没有可检测到的生长水平的情况下增加生物膜的形成,而且还会使其主要毒素溶肺素的成孔和促炎活性大量失活。CSC可能作为应激源,激活群体感应机制,进而启动生物膜的形成,使肺炎球菌进入一个静止、持久的阶段,当宿主防御暂时受损时,它可以重新出现[4].我们不能排除长期暴露于比当前研究中使用的浓度更高的CSC可能影响肺炎球菌生长的可能性。
然而,我们确实承认,短暂暴露于CSC的肺炎球菌在体外不能完全代表呼吸道吸入的香烟烟雾。尽管如此,其他几个小组最近报告了接触香烟烟雾对各种微生物病原体形成生物膜的影响。Baboni等。[7报告了两者的暴露变形链球菌和白色念珠菌在生物膜形成增加的情况下,增加了这些口腔病原体对正畸材料的粘附性[7选项B。agaitkar等。[8也观察到接触另一种口腔病原体后生物膜形成增加,Porphyromonas gingivalis,到CSC。最近,Goldstein -Daruach等。[9]有报道称,从吸烟者的鼻腔中分离出的一系列细菌病原体暴露于五种参考香烟燃烧产生的烟雾中,导致生物膜形成的激活[9].
据我们所知,香烟烟雾对肺炎球菌毒素溶肺素生物活性的影响以前没有描述过。当在严重肺炎球菌疾病期间高浓度释放时,溶肺素由于其细胞溶解和促炎活性,在肺炎球菌细胞外传播后引起急性肺损伤[1].然而,在定植的早期阶段,当肺炎球菌的数量很低时,溶血素,通过其与气道上皮细胞形成孔的相互作用,促进白细胞介素-8的产生和中性粒细胞的早期涌入,有助于早期控制定植[4,10].在目前的研究中,暴露于极低浓度的CSC会导致溶血素成孔活性的衰减,这可能是由于氧化失活,这可能有利于定植。
总之,香烟烟雾对生物膜形成和溶肺素生物活性的影响可能促进定植和持久性,这是侵袭性肺炎球菌疾病的重要前体。
脚注
支持声明
C. Feldman和R. Cockeran得到了南非国家研究基金会的支持。
利益声明书
没有宣布。
- 收到了2011年12月5日。
- 接受2012年5月6日。
- ©2013人队