文摘
中性粒细胞弹性蛋白酶在肺纤维化的发病机制中扮演着关键的角色。中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂、sivelestat可以减轻肺纤维化;然而,antifibrotic机制尚未阐明。我们检查了antifibrotic机制,主要关注关键纤维化细胞因子、转化生长因子(TGF) -β1,在这项研究中。
阐明antifibrotic sivelestat机制,我们研究了bleomycin-induced早期肺纤维化小鼠模型。博来霉素气管内的安装后,sivelestat是腹腔内接种一次7天或14天。支气管肺泡灌洗液和肺样本检查后7天或14天博来霉素灌肠。
在bleomycin-induced早期肺纤维化模型中,中性粒细胞弹性蛋白酶水平增加肺部。Sivelestat显著地抑制肺胶原含量的增加,纤维的变化,总细胞的数量(包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞)的水平的活性形式TGF-β1和phospho-Smad2 bleomycin-induced早期肺纤维化。总TGF-β1 TGF-β1 mRNA的表达水平和相对变化,然而,并非由sivelestat显著降低。
这些结果表明,sivelestat缓解bleomycin-induced肺纤维化通过TGF-β激活和抑制炎症细胞招聘肺。
肺纤维化是由多种肺损伤,如急性肺损伤、辐射和药物(1]。纤维化的程度是一个主要的决定因素的纤维化肺疾病患者的临床结果,因为目前的治疗无效或略微有效。
急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)与急性弥漫性肺泡损伤,noncardiogenic肺部水肿和随后的肺纤维化。根据最近的一份报告(2),ARDS的死亡率是40 - 45%患者在观察性研究和35 - 40%的随机对照试验。一个重要的问题对于ARDS患者的长期生存是实质纤维化的程度和肺功能损失(1]。
ALI / ARDS的fibroproliferative阶段一直被视为一个事件。然而,最近的研究表明,胶原蛋白增加营业额是一个早期事件,发生在24 h(诊断(3]。广泛的薄片计算层析异常,包括牵引bronchiolectasis,表明fibroproliferative变化ARDS患者的不良预后的独立预测因素发病7天内(4]。转化生长因子(TGF) -β,尤其是其异构体TGF-β1是profibrotic细胞因子过表达患者的纤维化和直接与多个人工设置和纤维化动物模型(5]。高浓度的活性TGF-β1记录不仅在支气管肺泡灌洗液(BALF)也在组织样本后24小时内ARDS的诊断(6]。
的存在在ARDS的早期纤维化改变有关死亡率的风险增加(3,4,7]。Fibroproliferation回应早期肺损伤可能是一个重要的治疗目标。特发性肺纤维化(IPF)也是一个进步和致命的纤维化肺病没有有效的疗法。
博来霉素(BLM)全身炎症和纤维化IPF代表一个实验模型以及ALI / ARDS。最近的研究表明,胶原蛋白增加营业额和纤维化的变化是在14天内事件早些时候BLM-induced纤维化(8- - - - - -11),这些变化通常被用来作为一个肺纤维化模型。纤维化的迹象后观察7天BLM管理(8]。观察显著增加总胶原蛋白沉积早在第8天,继续增加到16天(9]。因此,我们使用这个14天内BLM-induced模型作为一个早期肝纤维化模型。
中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)是一种丝氨酸蛋白酶激活中性粒细胞释放和具有广泛的底物特异性。不被认为在变性和炎症性疾病中发挥作用的细胞外基质的蛋白水解作用12,13),导致肺损伤(14]。不引起肺上皮细胞凋亡通过proteinase-activated受体(PAR) 114),PAR-1可以发挥重要作用在炎症和fibroproliferative响应ALI / ARDS [10,15]。血清NE水平升高的患者的肺纤维化(16,17),一些证据也表明,抑制其活性可能减弱疾病的发展13,18,19]。
在这项研究中,我们调查了antifibrotic特定NE抑制剂的影响,sivelestat,主要在BLM-induced TGF-β1激活早期肺纤维化模型。我们发现sivelestat缓解BLM-induced肺纤维化通过TGF-β1激活和抑制炎症细胞招聘在肺部。我们的研究结果表明,我们不仅可以减轻炎症,还在IPF fibroproliferative过程以及ALI / ARDS。
方法
有关详细信息,请参阅在线补充材料的方法。
动物治疗
雄性C57BL / 6小鼠(8 - 10周的年龄;日本克丽,东京,日本)被分配给一个四个组:1)气管内的生理盐水+生理盐水腹腔内(对照组);2)气管内的BLM +生理盐水i.p。(BLM组);3)气管内的BLM + 100 mg·公斤−1sivelestat(小野制药、日本大阪)在盐水中i.p。(BLM + sivelestat集团);4)气管内的生理盐水+ 100毫克公斤−1sivelestat的盐水i.p。(sivelestat组)。BLM(5毫克公斤−1;日本Kayaku、东京、日本)仅在75μL盐水或生理盐水是0天小鼠气管内的管理。Sivelestat或盐水i.p。后3小时以内BLM滴剂0天,然后一天一次7 - 14天。牺牲后7天,14天,支气管肺泡灌洗进行和肺部移除在集团。一些肺样本用于组织病理学检查,胶原蛋白测定和定量实时PCR。其余的被用作匀浆样品与声波降解法。所有实验进行按照美国国立卫生研究院的指导方针。批准的协议是Dokkyo医科大学医学院的小组委员会研究动物保健(日本枥木)。
支气管肺泡灌洗和肺匀浆样本
后计算BALF中细胞数量、细胞cytospun和沾Diff-Quick细胞分类。单一化肺样本和BALF上层清液是使用lyophiliser冻干。lyophilised样本测定溶解在盐水的不活动,活动形式的TGF-β1,总TGF-β1和phospho-Smad2。
不活动
不活动决心使用NE-specific衬底N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val p-nitroanilide (Calbiochem、圣地亚哥、钙、美国)。荧光测量在360纳米波长的激发和发射460海里。
活性和总TGF-β1的定量测定
小鼠活跃的浓度和总TGF-β1测定使用ELISA试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。
组织病理学评价
正确的肺缓冲福尔马林固定在10%,和彩色hematoxylin-eosin,马森的三色的。组织病理学分级纤维化是由三个经验histopathologists使用盲法半定量的评分系统(20.]。
胶原蛋白测定
胶原蛋白含量在左肺匀浆的样品确定使用Sircol胶原蛋白分析工具包(英国贝尔法斯特Biocolor有限公司)20.]。
实时聚合酶链反应分析
量化TGF-β1 mRNA的表达是由ABI棱镜7700序列实时PCR检测系统(PE应用生物系统公司,福斯特城、钙、美国),通过使用SYBR绿色(美国罗氏诊断,萨默维尔市,MA)作为一个双链DNA-specific绑定染料。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶作为内部控制。
Phospho-Smad2测量
免疫印迹和phospho-Smad2照常进行光密度分析(Ser465/467)(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)和肌动蛋白抗体(sc - 8432;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。三明治ELISA PathScan®Phospho-Smad2 (Ser465/467)工具包(细胞信号技术)是用来测量Phospho-Smad2的浓度。
统计分析
数据表示为±扫描电镜。统计学意义是由单向方差分析或成对t- - - - - -测试。假定值< 0.05被认为是重要的。
结果
讨论
东北是一个elastolytic酶广泛的底物范围,最能消化蛋白质。它被认为在变性和炎症性疾病中发挥作用(12,13]。参与炎性肺损伤(1,细胞凋亡14)和fibroproliferative响应通过PAR-1信号转导(10,14,15),不可能导致各种肺部疾病的发病机理。
在目前的研究中,阐明可能不参与肺纤维化,我们研究了一个特定的NE抑制剂,sivelestat BLM-induced早期肺纤维化。Sivelestat显著抑制BLM-induced纤维化的变化以及炎性细胞积聚在肺部。
人们早就认识到东北活动在血清和BALF显著升高IPF等肺纤维化患者,和不可以在肺纤维化的过程中起着重要的作用[16,17]。矛盾机制分解细胞外基质,即它可以促进多余的基质沉积,尚未完全定义。肺纤维化是中央病理端点的各种原因,如进行性炎症、细胞死亡和无序修复(1]。已经提出,纤维化的变化是连续的炎症和损伤的结果与无效的重建正常的肺泡膜上皮细胞(22]。这个假说的核心是肺泡上皮细胞导致无法修复受损上皮组织修复过度导致间质纤维化的变化和疤痕。基于这一假设,抑制肺损伤可以减轻肺纤维化。
在目前的研究中,sivelestat抑制炎性细胞招聘在肺部,这与先前的报道是一致的(13]。据报道,NE能增强中性粒细胞积聚。不提高neutrophil-dependent通过消除炎症的局部抗炎活动progranulin [23]。也不刺激支气管上皮细胞和巨噬细胞产生中性粒细胞化学引诱物如白介素8 (IL) (12]。因此,抑制不活动sivelestat可以减弱中性粒细胞积聚。
一些以往的研究报道,不活动的抑制可能减弱肺纤维化的发展13,18,19],sivelestat可以减轻纤维化的变化(13]。一个假设的机制抑制sivelestat对纤维化的影响发展主要集中在对损伤和炎症反应的反应。动物实验表明,sivelestat的抑制效果观察药物时管理在急性期发病14天内的纤维化13]。可能因此sivelestat可以减弱纤维化在neutrophil-dominant急性肺纤维化阶段。
在目前的研究中,我们不仅表明sivelestat抑制炎性细胞招聘,而且TGF-β1激活在肺部。基于这一事实标志着中性观察牙槽炎和纤维化改变减毒BLM-treated NE-deficient老鼠,C华et al。(19)得出结论,不可以诱导TGF-β激活,NE-deficient老鼠通过TGF-β激活减值准备减少肺纤维化。在目前的研究中,我们发现sivelestat显著降低的水平的活性形式TGF-β1 BALF和肺匀浆,但不是总TGF-β水平。Sivelestat并不影响BLM-induced增加TGF-β1 mRNA的表达。此外,磷酸化Smad2 BLM + sivelestat组显著降低。这些发现表明,sivelestat抑制NE-mediated激活TGF-β1和随后的肺纤维化。这是一个新发现的机制sivelestat抑制NE-mediated纤维化,并支持使用NE - / -小鼠(以前的报告19]。
虽然有些因素可以通过TGF-β-independent通路(21],盘根错节的机制与纤维化相关证据TGF-β1隆起的纤维化是实质性的。在纤维发生,TGF-β诱使myofibroblast分化和细胞外基质合成,抑制矩阵退化(24]。TGF-β存在于三个亚型,TGF-β1 TGF-β2 TGF-β3。TGF-β受体的亚型的亲和力不同,和生成TGF-β1最大的富足后组织损伤。以前的研究已经表明BLM诱发胶原沉积,TGF-β1调停这个过程中起着重要的作用[25]。
TGF-β1是由多种细胞产生,包括上皮细胞、肺泡巨噬细胞,成纤维细胞和内皮细胞(26]。肺泡巨噬细胞被认为是TGF-β1的主要来源之一,因为据报道,巨噬细胞释放大量TGF-β1 IPF患者,TGF-β1存在于成纤维细胞的焦点在IPF患者活检24]。TGF-β最有效分泌大量潜在的复杂和最TGF-β激活之前存储在细胞外基质(19]。IPF的一个关键特性是存在高水平的活性前体形式TGF-β1在肺实质27]。积累的主要来源可能是TGF-β1肺实质,特别是在最初的纤维化改变。因此,高浓度的TGF-β1 TGF-β-inducible蛋白质、胶原类型III等被证实的肺ARDS患者早在24小时后开始(6,7]。
的潜在形式TGF-β1可以激活的刺激(6,19),包括蛋白酶如血纤维蛋白溶酶、金属蛋白酶,辐射,活性氧(ROS),血小板反应蛋白- 1的,整合素αvβ6,CD44和IL-13。C华et al。(19)提出了概念,不可以支持矩阵生产和组织修复通过TGF-β激活。目前的证据表明,激活proteinase-activated受体(PARs),一个亚科的七个跨膜域G-protein-coupled受体,可能是特别重要的在影响炎症和fibroproliferative ALI / ARDS的反应。PAR的家庭是由四个成员(PAR1-PAR4)和延续凝结之间的相互作用,炎症和纤维化的变化(15]。年代棉花et al。(10)报道,PAR1-dependent信号有能力开车纤维化反应通过激活TGF-β和影响fibroblast-to-myofibroblast分化。因为不可以激活PAR1 [14),NE ARDS患者的高水平可能激活TGF-β不相上下。
虽然确切机制有待阐明和进一步检查会更好,有理论由NE TGF-β1激活的机制,其中包括直接激活机制,间接的通过帕尔斯和其他未知的途径。
而抑制TGF-β1激活并不总是有效的治疗肺纤维化,sivelestat不仅可以减轻炎症还TGF-β1-dependent纤维化早期阶段过度活动可能涉及。针对炎症刺激,中性粒细胞迁移到炎症组织,在那里他们有效地结合,吞噬和灭活致病性代理。这被称为炎症与中性粒细胞肺微血管构筑封存。中性粒细胞隔离病变并交付一个高当地的蛋白水解酶和ROS浓度(28]。它是由许多内源性蛋白酶抑制剂,如α1抗胰蛋白酶的分子量∼52 kDa。然而,这些大分子蛋白酶抑制剂有困难通过隔离肺组织的间隙空间。另外,抑制函数可以执行的低分子量(528.51 Da) sivelestat [12]。内源性蛋白酶抑制剂相比,sivelestat结构抗活性氧失活,并有效地抑制tissue-bound NE (12]。此外,sivelestat不仅可以减轻炎症反应,而且TGF-β1激活导致肺纤维化。
因为sivelestat可以缓解NE-induced肺上皮细胞凋亡(14],aerosolised管理药物的患者受益。然而,aerosolised sivelestat可能不足以废除NE-induced肺纤维化,因为只有通过交付航空公司,它可能不会充分包含高水平的TGF-β1到达肺实质。词义的sivelestat气管内的静脉注射可以提供添加剂或协同效应与单一静脉通路。因此,气管内的政府是一个有吸引力的策略,需要进一步调查。
总之,我们的结果表明,抑制NE sivelestat抑制中性粒细胞炎症和TGF-β激活,导致BLM-induced肺纤维化的抑制。这些数据可能导致新的治疗方法在ARDS更具针对性的抑制纤维化。重点突出,fibroproliferation ARDS发生的求和过程深深交织在一起,并且很有可能在损伤的发病后立即开始。Sivelestat施加其影响在纤维化的早期阶段,过度的不活动可能涉及。在这个阶段,sivelestat不仅可以减轻炎症反应,还TGF-β1激活导致肺纤维化。如果sivelestat尽早实施,我们不仅能减轻炎症还在ALI / ARDS fibroproliferative过程以及IPF的发展。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
本研究在一定程度上支持格兰特弥漫性肺疾病研究小组来自卫生部、劳动和福利,日本。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2011年7月25日。
- 接受2012年2月25日。
- ©2012人队