文摘
过敏性哮喘的发展是一个复杂的过程,涉及免疫,神经细胞和组织细胞。在肺,克拉拉细胞代表的主要部分气道上皮的“免疫调节障碍”。
了解这些细胞的贡献哮喘炎症的结果,疾病发展评估使用adjuvant-free卵白蛋白模型。小鼠皮下注射的敏感10μg endotoxin-free卵白蛋白结合naphthalene-induced克拉拉细胞耗竭。
克拉拉在肺上皮细胞耗竭强烈嗜酸性粒细胞减少涌入,这与eotaxin水平和减少,此外,减少辅助细胞2型炎性反应,包括白介素(IL) 4, IL-5 IL-13。相比之下,增加气道高反应。进一步的调查显示克拉拉细胞在肺eotaxin的主要来源。
这些研究结果首次表明,克拉拉气道上皮细胞明显的渗透eotaxin-responsive CCR3 +免疫细胞,增强肺部过敏的免疫反应。本研究确定了克拉拉细胞作为一个潜在的治疗目标在炎症性肺部疾病,如过敏性哮喘。
过敏性哮喘是一种慢性气道炎症性疾病的特点是代答,嗜酸性粒细胞的炎症反应,血清免疫球蛋白E (Ig)水平升高和粘液生产。疾病引起的辅助2型细胞(Th)及其相应的细胞因子,如白介素(IL) 4, IL-5 IL-13。气道结构和完整性在发病机制中起着至关重要的作用,因为它可以将基因-环境相互作用。因此,尽管最初认为是主要的结构性障碍,最近的研究关注肺上皮细胞的免疫调节功能(1]。气道上皮由纤毛,分泌细胞排列在一个连续的分层结构。受疾病或损伤时,上皮细胞可以作为内分泌物介质的重要来源,趋化因子,生长因子负责修理或维持持续的炎症。小鼠气道上皮细胞衬的,克拉拉细胞构成的主要细胞类型,占70 - 90%的细胞远端航空公司(2]。在人类中,克拉拉细胞大大有助于细胞更新在正常进行气道上皮细胞(3,4]。non-ciliated,分泌克拉拉细胞表达细胞因子il - 4受体(5),可以通过分泌调节免疫反应的赞成和抗炎因子(6- - - - - -8]。这些特性识别作为一种重要的细胞间连接先天和适应性免疫反应在肺部。例如,克拉拉细胞应对Th2细胞激活通过il - 4受体(5),可以分化成食用杯状细胞(9)和分泌抗炎因子如克拉拉细胞分泌蛋白(CC10) counter-regulates Th2反应在哮喘(10]。克拉拉细胞也能够代谢和解毒外源性物质和有毒化合物,如萘(NA)出现在香烟烟雾,使他们的特定的损耗用在我们的研究11,12]。
过敏性肺部炎症包括策划招聘免疫细胞从血液组织特异性信号,如趋化因子和粘附分子(13,14]。嗜酸性粒细胞的积累是一个至关重要的事件发展的哮喘和肺中,痰及支气管肺泡灌洗的病人,和与哮喘严重程度相关15,16]。嗜酸性粒细胞分泌tissue-damaging细胞毒性颗粒阳离子蛋白,如主要碱性蛋白(MBP),嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、嗜伊红的过氧化物酶和eosinophil-derived神经毒素。此外,嗜酸性粒细胞主要水库的细胞因子,趋化因子,活性氧、花生四烯酸代谢物和其他介质,参与组织炎症17]。嗜酸性粒细胞招聘由趋化因子介导eotaxin / CCL11及其受体CCR3,也表达了对其他细胞如嗜碱粒细胞、t细胞和小胶质细胞(18- - - - - -20.]。气道上皮细胞被描述为一个著名的趋化因子和细胞来源很少有研究证明eotaxin气道上皮细胞表达在活的有机体内和在体外,虽然细胞表达eotaxin从未明确指出(21,22]。我们的研究的目的是检查气道上皮的作用克拉拉细胞炎症细胞的贩卖过敏性肺部。使用一个模型,建立NA-induced克拉拉细胞消融结合卵白蛋白(OVA)简况哮喘,目前的研究表明,克拉拉细胞生产至关重要的eotaxin和气道嗜酸性粒细胞的积累。
方法
老鼠
雌性BALB / c小鼠年龄在6 - 8周内获得从哈伦温克尔曼(Borchen,德国)。实验过程都是由当地的动物伦理委员会批准,德国与国际准则。至少8 - 10每实验组动物使用。
研究设计和动物治疗
小鼠皮下注射10μg要么敏感endotoxin-free卵子(第六年级;Sigma-Aldrich,汉堡,德国)200年μL PBS或虚假的注射PBS天0,7和14。敏化作用阶段之后,20分钟1%卵子(V级;σ)或虚假的PBS气溶胶疗法在天26日27和28。另外两组老鼠卵子收到上述敏化作用,连同一个腹腔内注射(200μL)的NA (200 mg·公斤−1;丙烯酰胺、德国汉堡)溶解在玉米油(Sigma-Aldrich,) 3(气道高反应性的分析)或天16其次是卵子挑战如上表示。另外两组老鼠敏感与卵子和进一步处理NA (200 mg·公斤−1)收到一个鼻内剂量的小鼠eotaxin重组(4μg CCL11;PeproTech,落基山,新泽西,美国)在26天的挑战。四个额外的PBS对照组接受假注射天0,7和14、玉米油或钠溶解在玉米油在每天3 - 16 (表1)。
TUNEL分析
检测凋亡细胞在肺组织的部分中,我们利用TUNEL技术(无出路™荧光TUNEL系统;Promega,麦迪逊,美国WI)。部分是deparaffinised和水化,其次是预处理μg·20毫升−1蛋白酶K(美国纽约Intergen公司购买)在室温下10分钟。幻灯片被浸泡在4%甲醛溶液固定在PBS 5分钟。其次是聚合的fluorescence-labelled尿苷三磷酸在割进DNA结束按照制造商的说明书。荧光显微镜下的部分都被立即分析。
肺组织学和免疫组织化学
肺通过气管与10%福尔马林固定,孤立和存储在10%福尔马林。肺组织被嵌入到石蜡和3-μm部分与苏木精和伊红染色())或周期性acid-Schiff光学显微镜(PAS),所述其他地方(23]。Immuno-histochemical染色进行石蜡包埋的肺部组织。补液分级酒精后,组织切片(3μm)柠檬酸处理抗原检索解决方案根据制造商的指示。部分与抗体识别CC10孵化、CCR3 (Abcam,剑桥,英国)和CCL11(研发系统、Wiesbaden-Nordenstadt德国)一夜之间在4°C。Peroxidase-conjugated anti-rabbit、抗体和anti-rabbit二级抗体(向量实验室、Loerrach、德国)被用于绑定CC10的检测,分别CCR3和eotaxin。Diaminobenzidine (DAB)被用作染色粒的衬底(向量实验室)。免疫荧光分析,anti-CC10 anti-eotaxin抗体检测和Alexa萤石555或Alexa萤石488共轭二次抗体(表达载体,达姆施塔特,德国),分别。部分分析了使用光学显微镜(奥林巴斯欧罗巴GmbH,汉堡,德国)。
克拉拉细胞和CCR3 +细胞的形态学分析
老鼠的肺被固定通过气道滴剂使用6%磷酸盐多聚甲醛在20厘米液柱的压力。肺容积是由流体位移,系统性的肺组织被均匀随机抽样和根据标准处理方法。肺Immuno-histochemical染色进行石蜡包埋组织,如上所述。简而言之,部分与抗体识别CC10孵化(北部;微孔,Billerica,妈,美国)一夜之间在4°C。Peroxidase-conjugated anti-rabbit二级抗体(向量实验室)是用于检测CC10绑定。民建联是用作染色粒的衬底(向量实验室)。形态学分析的CC10阳性细胞使用修改后的版本执行先前描述的方法(24]。近端和远端航空公司被蒙蔽的方式计算。CC10阳性细胞含有核资料统计。
气道反应性
(AHR)都使用了无创性气道高反应出海身体体积描记法方法,24小时后气溶胶的挑战。的支气管反应mid-expiratory气流β-methacholine测量如前所述[25]。
评估白细胞分布在支气管肺泡灌洗液
48 h后最后的挑战,老鼠牺牲和支气管肺泡灌洗液(BALF)生成如前所述[23]。白细胞的总数确定使用卡西TT细胞计数器(Scharfe系统GmbH, Reutlingen,德国)。BALF细胞不同沾Diff-Quick(戴德贝林,马尔堡,德国)和数字的淋巴细胞,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞被标准形态标准,每cytospin 100细胞数。洗胃游离液体储存在-20°C细胞因子进行进一步分析。
BALF中细胞因子水平的测量
细胞因子包括IL-1α、2、il - 4、IL-5 il - 10, IL-13,干扰素(IFN) -γ和集落刺激因子(gm - csf)测量的上层清液游离BALF根据制造商的指示(Th1 / Th2 10丛Flowcytomix包和鼠标趋化因子6丛Flowcytomix多路复用;本德MedSystems,维也纳,奥地利)。Eotaxin (CCL11)和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)检测到使用Quantkine免疫测定(研发系统)根据制造商的指示。
流式细胞术
Fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)进行细胞分离BALF测量CD45 +白细胞的总数使用小鼠CD45抗体(克隆104;BD生物科学,德国海德堡)。白细胞的总数计算,推断CD45 +细胞的比例绝对数字,通过流式细胞仪分析计算的电子凯西TT细胞计数器(Scharfe系统GmbH)。流式细胞仪也执行检测活和死巨噬细胞使用F4/80抗原(克隆6 f12;BD生物科学)一起propidium碘。CCR3 +细胞被歧视通过CCR3表面抗体染色(克隆83103;BD生物科学)在CD45 +细胞。
统计数据
统计学意义的正态分布样本进行了分析使用一个未配对t检验。非正态数据或数据与不平等的方差是使用Mann-Whitney等级和测试检测意义。被认为具有统计显著性p值< 0.05。结果意味着±扫描电镜。组包括至少八个老鼠或六个独立样本(在体外)和实验至少重复三次。计算进行了使用GraphPad棱镜软件,版本3.02 (www.graphpad.com)。
结果
NA治疗选择性耗尽克拉拉细胞
评估支气管上皮的作用克拉拉细胞在过敏性哮喘、BALB / c小鼠接受卵子实验性哮喘协议有或没有钠治疗(表1)。NA治疗导致的支气管上皮细胞凋亡检查8 h后使用TUNEL分析(图1一个)。NA诱导克拉拉特异性死亡没有任何其他细胞改变或非特异性细胞死亡在肺部之前报道(26- - - - - -28]。在24 h,广泛的超然的克拉拉细胞上皮的基底膜和几乎完全裸露在观察一些航空公司(图1一个)。量化的克拉拉细胞使用CC10-specific染色显示∼65%克拉拉细胞消耗1天;在第十天进一步量化显示更新的克拉拉细胞∼50% (图1 b)。潜在NA毒性在其他细胞类型进一步调查,测试肺泡巨噬细胞和脾脏单核细胞(跨国公司)与小鼠治疗后48 h。使用macrophage-specific落下帷幕细胞流式细胞仪分析细胞表面糖蛋白F4/80标志显示没有区别生活的频率(F4/80 +π-)和凋亡(F4/80 +π+)细胞之间的控制和NA-treated组(图1 c)。此外,没有观察到不同的跨国公司的可行性NA-treated与未经处理的动物(图1 d)。这些结果表明,钠是克拉拉细胞选择性毒性肺没有细胞毒性影响其他细胞类型。
克拉拉细胞耗竭抑制过敏性肺部炎症
克拉拉细胞剥蚀的NA模型被用来评估克拉拉细胞在过敏性气道炎症的作用使用adjuvant-free哮喘模型。分析BALF中炎症细胞的总数OVA-sensitised和NA-treated小鼠有明显减少CD45 +细胞与OVA-sensitised老鼠处理溶剂(玉米油)独自一人(图2一个)。考试差的细胞类型显示一个特定数量的减少嗜酸性粒细胞(图2 b),这是这个模型的主要炎性细胞浸润(23]。相比之下,适度增加在淋巴细胞和中性粒细胞的数量在过敏原后的BALF挑战并不影响钠治疗(图2 c和d)。支气管旁嗜酸性粒细胞招募当时检查使用)和anti-CCR3染色。肺组织学OVA-sensitised小鼠治疗玉米油显示典型的支气管旁炎症由CCR3 +细胞确认BALF结果(图2 f)。克拉拉cell-denuded, OVA-sensitised小鼠有明显减少专门CCR3 +细胞周围的炎性浸润航空公司(图2 f和g)。Non-sensitised对照组有或没有后续NA没有表现出任何的治疗肺组织炎症(图2 e)。此外,在卵巢敏化作用和挑战之后,杯状细胞增生引起的支气管上皮细胞;然而,更少的不是(粘液产生细胞)阳性细胞在卵巢/ NA-treated组由于剥蚀的克拉拉细胞(数据没有显示)。
此外,我们感兴趣的水平克拉拉细胞相关标记CC10和表面活性剂蛋白(SP - d)。诱导过敏性哮喘导致的增加CC10和SP-D mRNA水平相比,接受pbs控制老鼠(图B S1的在线补充材料)。然而,NA治疗OVA-sensitised老鼠表现出减少水平的克拉拉细胞相关因素,类似于控制老鼠(图B S1的在线补充材料)。
总之,这些结果表明,克拉拉细胞是一个重要的免疫调节细胞类型肺癌和负责招聘的嗜酸性粒细胞,但不是其他免疫细胞,在过敏性哮喘气道。
损耗的克拉拉细胞气道高反应性的增加
接下来,我们认为克拉拉细胞耗竭对肺功能的影响在过敏性哮喘气道高反应性和测量控制和敏感的老鼠有或没有克拉拉细胞耗竭后3天或一天16敏化作用。正如所料,敏化作用卵子强烈气道高反应性增加,损耗的克拉拉细胞没有明显影响的第三天(图3)。有趣的是,消耗在16天进一步增加相比敏感和CO-treated小鼠气道高反应性。这些数据表明,气道上皮细胞的破坏使其更适应醋甲胆碱等活性物质。
在过敏性哮喘Th2细胞因子和eotaxin生产取决于克拉拉细胞
Th2-associated细胞因子il - 4, IL-5 IL-13过敏性哮喘的发展至关重要。调查的基础上,克拉拉细胞影响炎症细胞的招募,BALF中细胞因子测定(图4)。OVA-sensitised老鼠表现出高水平的il - 4, IL-5 IL-13。相比之下,这些细胞因子在克拉拉cell-depleted老鼠背景水平降低(图4 a - c)。在IFN-γ没有显著差异,2、il - 10或IL-1α之间观察组(图4 d)。gm - csf的分析,报告在哮喘和参与调节感应的嗜酸性粒细胞(29日),还显示组之间没有显著差异在我们的模型中(图4 h),而其他炎症因素像咆哮和TSLP没有可检测(数据未显示)。强烈水平升高eotaxin观察OVA-sensitised组与完整的上皮细胞(卵子/ CO),而水平相对较低的背景后克拉拉细胞耗竭(图4我)。这些数据表明,Th2细胞因子的生产和eotaxin过敏性哮喘是依赖于完整的克拉拉细胞。
克拉拉细胞在肺部eotaxin的主要来源
调查的来源eotaxin航空公司,从串行肺部免疫组织学部分执行。克拉拉细胞也被CC10 eotaxin呈阳性(图5和b)。相比之下,很少,如果有的话,CC10 - eotaxin细胞阳性。接受pbs的染色模式是类似的控制动物以及OVA-sensitised动物。为了确定eotaxin水平减少损耗的克拉拉细胞负责嗜酸性粒细胞数量的减少,我们补充OVA-sensitised老鼠与一剂eotaxin给定的第一天过敏原的挑战。管理eotaxini.n。诱导显著增加CCR3 +细胞在肺部OVA-sensitised以及克拉拉cell-depleted老鼠(图5度和d)。这些结果表明,克拉拉细胞衍生eotaxin过敏性肺部炎症的嗜酸性粒细胞积累是至关重要的。此外,分析il - 4、IL-5 IL-13和克拉拉IFN-γcell-depleted OVA-sensitised动物显示增加Th2细胞因子后eotaxin补充(图6)。il - 4和IL-13水平增加独立于eotaxin补充(图6和c),而IL-5产量增加后才在克拉拉cell-depleted eotaxin应用小鼠(图6 b)。IFN-γ水平较低,没有显示显著变化(图6 d)。此外,管理局eotaxin OVA-sensitised老鼠并不影响CC10或SP-D表达式(无花果。印地的在线补充材料)。
这些结果表明,克拉拉细胞的主要生产商eotaxin肺部在稳态和炎症条件下,嗜酸性粒细胞,因此负责招聘的过敏性炎症。
讨论
我们已经表明,克拉拉细胞衍生eotaxin来说是至关重要的积累中嗜酸性粒细胞过敏性肺部炎症。克拉拉细胞以前报道分泌各种因素参与肺的保护和防御机制。例如,CC10和SP-D由克拉拉细胞分泌发挥保护作用,通过抑制哮喘Th2反应(10,30.]。炎性介质,如酸性哺乳动物几丁质酶,调节在克拉拉细胞Th2炎症和它们的抑制改善炎症(31日]。趋化因子,如角化细胞化学引诱物和巨噬细胞炎症protein-1α,克拉拉细胞及其分泌释放后脂多糖应用于克拉拉细胞消融已发现显著降低(7]。此外,模式识别受体的表达,比如toll样受体4,在肺上皮细胞有重要作用活化的树突状细胞(DC)在过敏性肺部炎症,强调肺组织微环境的重要性,有效激活t细胞(32]。此外,一些报告描述了克拉拉细胞中基因表达的调制Th2细胞因子il - 4和IL-13 [33,34]。烧蚀核factor-κB信号在克拉拉细胞减少支气管旁纤维化,CD4 +细胞浸润,气道粘液、CCL17和eotaxin释放和嗜酸性粒细胞allergen-challenged老鼠(34,35]。这些和其他的研究表明,肺上皮细胞有反应能力和编排免疫反应。然而,知识的具体贡献上皮细胞细胞子集这些过程仍然是不完整的。
在人类中,克拉拉细胞的数量在终端和呼吸细支气管据说∼11和22%,分别为(3]。克拉拉细胞重要的再生和分化成其它类型的上皮细胞(36),如。杯状细胞,负责生产和组成部分CC10排斥性的支气管粘液细胞(3]。调查吸烟显示显著减少细支气管克拉拉细胞的比例,与不吸烟的患者相比,表明克拉拉细胞数量可以影响吸入的物质(37]。然而,克拉拉细胞没有专门研究肺部疾病如哮喘、气道上皮的无害的特工在敏化作用中起着关键作用。事实上,进步上皮损伤被描述在人类哮喘和慢性病例虽然通常被认为是一种疾病的大航空公司,小远航空,克拉拉细胞突出,越来越牵连在过敏性哮喘的发病机制38,39]。
调查克拉拉细胞的作用,我们用钠选择性耗尽这些细胞从老鼠的航空公司。钠是一种多环芳烃在香烟烟雾和柴油废气能够诱导的高摄入量有关,细胞类型,site-selective毒性(40]。毒性代谢需要激活,催化了细胞色素P450 mono-oxygenases。NA已报道有选择地伤害nonciliated克拉拉细胞,因为它们的主要表达网站细胞色素P450单氧酶2 f2, NA的同种型高催化活性(41]。
本文提供的实验支持先前的调查结果,NA-treatment有效大多数克拉拉细胞凋亡无明显细胞毒性副作用在其他细胞类型(26- - - - - -28]。重要的是,老鼠与克拉拉细胞受损时气溶胶挑战显示强烈嗜酸性粒细胞减少航空和BALF中积累。Eotaxin是一个重要的嗜酸性粒细胞的导航和生存因素,并强烈Eotaxin水平降低BALF中发现了克拉拉cell-depleted老鼠,这表明克拉拉细胞参与Eotaxin生产。相比之下,gm - csf,嗜酸性粒细胞的另一个生存因素,影响了克拉拉细胞耗竭。事实上,我们可以首次显示,克拉拉细胞eotaxin的主要来源,占中等水平在稳态条件下以及强烈增加炎症期间释放。虽然在克拉拉cell-depleted小鼠嗜酸性粒细胞强烈降低,t细胞和中性粒细胞的数量保持不变,表明这些细胞获得足够的启动。不过可以推测,肺DC可能没有被适当地招募或引发了上皮细胞的影响,提出了最近发表的结果(32]。t细胞和嗜中性粒细胞聚集被克拉拉细胞耗竭影响表明,这些细胞可以利用导航路径独立于克拉拉细胞。特别是从组织细胞迁移到BALF的克拉拉细胞上皮。类似炎症概要文件组织和BALF,再次表明,嗜酸性粒细胞的迁移是安静的在这两个隔间在克拉拉细胞消耗,但这从血液中嗜酸性粒细胞招募或他们没有克拉拉细胞生存的影响。虽然早期Th2细胞招聘被报道在一定程度上依赖于eotaxin [42),我们没有观察到不同的t细胞数量在克拉拉细胞耗竭。
此外,克拉拉细胞耗竭气道高反应性增加,特别是当克拉拉细胞耗尽在稍后的时间点;10天前卵子肺挑战(16天)而不是23天前(第三天)卵子肺挑战,建议改善肺功能和在克拉拉细胞的再生。事实上,克拉拉细胞耗竭没有敏化作用突显出气道高反应性卵子已经诱导上皮屏障对肺功能的重要性和可能相关的哮喘患者暴露于可能影响克拉拉细胞的物质,如香烟烟雾和其他磨料污染物在环境中。
我们还发现强烈减少大量的il - 4, IL-13和eosinophil-promoting IL-5 BALF的克拉拉cell-depleted老鼠。补充eotaxin OVA-sensitised和CC-depleted肺恢复这些细胞因子以及嗜酸性粒细胞数。有趣的是,eotaxin也能够促进Th2细胞因子较高生产完整的航空公司,这是符合嗜酸性粒细胞数目的增加卵子敏感/挑战的动物。嗜酸性粒细胞是Th2细胞因子的主要来源(43),减少Th2细胞因子在克拉拉细胞消耗和恢复后eotaxin应用程序可以解释为嗜酸性粒细胞数目的变化对克拉拉细胞耗竭和eotaxin补充,分别。尽管克拉拉细胞表达il - 4, IL-13受体(5),生产相应的Th2细胞因子的气道上皮是未知的。
CC10表达的和SP-D克拉拉细胞和已报告在过敏性哮喘中发挥作用;因此,我们发现他们在OVA-sensitisation RNA水平增加。克拉拉细胞消耗降低的水平CC10和SP-D虽然eotaxin补充没有影响(图印地和C在线补充材料)。以来,这是预期响应eotaxin受体CCR3不知道在肺上皮细胞表达。我们可以通过补充恢复嗜酸性粒细胞数量和Th2细胞因子与克拉拉eotaxin cell-depleted老鼠,低CC10和SP-D水平不太可能强烈影响我们的实验结果。
总之,我们已经表明,克拉拉细胞eotaxin在气道上皮细胞的主要来源和编排过敏性哮喘反应是至关重要的。根据结构室中发挥的重要作用对疾病发病机理,最近越来越侧重于治疗的临床研究,妨碍组织导航路径。这里给出的结果提供进一步的知识对未来战略参与针对肺上皮细胞过敏性哮喘的治疗。
确认
我们感谢a . Kılıc有价值的反馈和讨论,和a的间谍(这两个部门的临床化学和分子诊断,马尔堡大学医院,马尔堡,德国)技术援助。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
编辑注:克拉拉细胞仍在使用这个词欧洲呼吸杂志(收获)和其他出版物。然而,这个术语的使用和可能的替代一直是讨论的主题,作为讨论的收获文章“克拉拉细胞:一个“第三帝国”齐名的人吗?“通过a·温克尔曼和t . Noak (欧元和J2010;36:722 - 727)。
支持声明
这项工作是支持部分由德意志Forschungsgemeinschaft (Transregio 22日项目A9)和Stiftung毛皮Pathobiochemie和Molekulare Diagnostik, DGKL。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2011年12月21日。
- 接受2011年7月7日。
- ©2012人队