摘要GydF4y2Ba
慢性炎症是肺动脉高压血管病变的纤维增生性改变的重要组成部分。纤维细胞有助于慢性炎症环境下的组织重塑,包括肺动脉高压(PH)动物模型。我们试图确定患有酸碱度的儿童和年轻人的循环纤维细胞是否增加。GydF4y2Ba
对26例PH患者和10例心脏解剖正常的患者进行了研究。用流式细胞仪检测新鲜血液中表达CD45和前胶原的纤维细胞。纤维细胞数量与临床和血流动力学参数、循环CC趋化因子配体(CCL)2和CXC趋化因子配体(CXCL)12水平相关。GydF4y2Ba
我们发现PH患者的循环纤维细胞丰富。特发性PH患者的纤维细胞无差异GydF4y2Ba对GydF4y2Ba继发性肺动脉高压。较高的纤维细胞与平均肺动脉压的增加和年龄相关,但与治疗的长度或类型无关。免疫荧光分析证实了血流分类的特异性。未发现血浆中CCL2或CXCL12水平的差异,这两种水平可从骨髓中动员纤维细胞。GydF4y2Ba
我们得出结论,与对照组相比,PH患者的循环纤维细胞显著增加。我们推测这些细胞可能在患有肺动脉高压的儿童和青年人的血管重塑中发挥重要作用。GydF4y2Ba
慢性肺动脉高压(PH)以肺动脉壁的细胞和结构改变为特征。内膜增厚和纤维化、内膜肥厚和外膜的纤维增生性改变是常见的[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba]在成人和儿童中,几乎所有这些变化的特点都是表达平滑肌α-肌动蛋白的细胞数量增加[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba]以及血管周围炎性细胞的积聚[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba].这些细胞的来源尚不清楚,但已假定来自循环祖细胞[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba].在成人中,已经检测了内皮祖细胞(EPCs)的数量和分化能力,但对于这些细胞在疾病发病机制中的作用尚未达成共识[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].关于患有PH的儿童和年轻成人中任何类型的循环细胞的可用数据较少。最近,有报道称,虽然可逆性PH和不可逆性PH之间早期或晚期EPC内皮集落形成单位没有显著差异[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba研究发现,与使用内皮素受体拮抗剂或磷酸二酯酶抑制剂的儿童相比,接受曲前列替尼的儿童晚期内皮祖细胞增多[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]这些细胞具有增加血管生成和过度增殖的潜能,这被认为部分解释了前列腺素类药物在肺动脉高压(PAH)中的临床益处。然而,严重的肺动脉高压与周围血管的修剪密切相关,同时伴有较大支气管血管结构的炎症、肥大和增生[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba].在PH设置下,已记录巨噬细胞和T淋巴细胞的动脉周围浸润[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba].在缺氧动物的类似炎症浸润中,c-kit+祖细胞也已被鉴定[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba,GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]炎症/祖细胞的起源,以及它们促进肺血管重塑和炎症的机制,在患有PH的儿童和年轻成人中观察到,尚未进行彻底的研究。GydF4y2Ba
新的实验证据表明,循环中的间充质前体可能对血管重塑过程有重要作用[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba].血管重塑的发展可能需要肺内单核吞噬细胞的浸润。在大小动物模型中,使用含氯膦酸脂质体消耗循环单核细胞可防止PH值[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]最近,一些研究指出了纤维细胞(单核吞噬细胞的一个亚群)在癌症和炎症疾病发展中的重要性[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba].这些细胞来自造血前体细胞,促进纤维化和慢性炎症过程[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba].纤维细胞以CD45和胶原蛋白的表达为特征,并与特发性肺纤维化患者的不良预后相关[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]在肺中,它们被招募到损伤部位,直接(通过产生细胞因子)或间接(通过诱导常驻细胞诱导细胞因子)参与持续性炎症重塑和促血管生成信号[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]有趣的是,与常氧小鼠相比,使用稳定的前列环素类似物曲前列素可显著减少缺氧小鼠肺纤维细胞的募集[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba].曲前列地尼还可降低右心室收缩压,轻微减少血管重塑,但未能逆转这些缺氧PH小鼠的右心室肥厚。这项重要的研究强调了循环纤维细胞的测量和治疗靶向性可能代表了PH临床管理的一个有希望的前沿。GydF4y2Ba
由于成人慢性炎症患者的循环纤维细胞升高,且慢性炎症与PH值相关,我们假设患有PH值的儿童和年轻成人的血纤维细胞数量增加。这些细胞的持续流入可能因此维持肺部永久性炎症和血管重塑的循环。为了验证这一点,我们使用外周血流式细胞术来量化PH患者接受各种药物治疗(包括前列环素类似物)与对照组相比的纤维细胞数量。我们发现PH值血液中的纤维细胞显著增加,与平均肺动脉压增加相关(GydF4y2BaP̄GydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构GydF4y2Ba)和年龄。结论PH值与循环纤维细胞升高有关,纤维细胞升高可能在血管重塑中起重要作用。GydF4y2Ba
方法GydF4y2Ba
受试者和血液采集GydF4y2Ba
科罗拉多多机构审查委员会(科罗拉多丹佛大学,美国科罗拉多州丹佛市)批准了该研究,并在适当情况下获得了所有患者的同意。所有受试者的人口统计数据见GydF4y2Ba表1GydF4y2Ba和GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba. 在所有患者首次心导管插入期间,从股静脉抽取5ml血液。PAH组由诊断为PH时年龄<18岁的儿童和年轻成人组成,来自世界卫生组织I类,定义为特发性PAH(IPAH)、遗传性PAH或与先天性心脏病(APAH-CHD)相关的PAH[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba].对照组包括年龄小于18岁、心脏结构正常、在手术开始前进行心律失常消融的儿童。所有接受消融治疗的患者在导管开始时窦性心律正常,抽血时,超声心动图正常。GydF4y2Ba
在首次插管时获得血流动力学参数和超声心动图数据,随后在治疗评估时获得。如MGydF4y2BaoellerGydF4y2Ba等GydF4y2Ba. [GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].从450×离心10分钟的血液中取出巴菲衣细胞GydF4y2BaGGydF4y2Ba(1200转/分)。加入氯化铵(0.15 M, pH 7.3)裂解红细胞后,洗涤白细胞,排除台班蓝以验证其活力,并制备至1×10浓度GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba细胞·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba用于抗体标记和流式细胞术。GydF4y2Ba
流式细胞术分析GydF4y2Ba
使用抗CD45的Pacific blue偶联抗体(PB986;BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA),根据制造商的协议进行固定和渗透(Fix/Perm Solution 554714;然后用兔抗人I型前胶原(MAB1913;Millipore, Billerica, MA, USA)。二抗(异硫氰酸荧光素)标记山羊抗兔免疫球蛋白G;AP132F;Millipore)。CD45-Pacific Blue和FITC同型对照的阴性阈值是使用来自正常和PH受试者的同型对照标记的细胞设置的,确切地如MGydF4y2Ba阿泰GydF4y2Ba等GydF4y2Ba[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba].所有随后的样品都对CD45+区域进行门控。数据记录为每毫升血液中的纤维细胞数量和白细胞总数(CD45+)的百分比。每个直方图至少使用200,000个事件。使用CXP软件(Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)在FC500流式细胞仪上进行流式细胞术。GydF4y2Ba
细胞自旋与免疫荧光GydF4y2Ba
在单独的实验中,细胞被重新悬浮到0.5×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba细胞·毫升GydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba250×离心200 μLGydF4y2BaGGydF4y2Ba细胞纺丝在1/1丙酮/甲醇中固定10分钟,然后在加入抗体前在磷酸盐缓冲液中再水化。制备的细胞与前面描述的完全相同的抗体染色用于流式细胞术。每个样本组包括抗体同型阴性对照,以及抗体对制造商提供的同源抗原的预吸附。载玻片安装在Vectashield + 4 ',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)培养基中(Vector Laboratories Ltd, Burlingame, CA, USA)。在室温下,使用装有Zeiss 20×0.4na和10×0.3na物镜的Zeiss Axiovert S100显微镜和Axiocam相机(Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY, USA)采集图像。使用Axiovision 4.6软件(Carl Zeiss Inc.)进行图像采集。用三种对照制剂和三种PH制剂分别在5个区域内计数免疫阳性细胞(绿色),然后除以DAPI+细胞总数。GydF4y2Ba
临床数据GydF4y2Ba
回顾图表,提取人口统计学、血流动力学和6分钟步行试验的数据。描述患者群体的所有信息见GydF4y2Ba表1GydF4y2Ba和GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
统计分析GydF4y2Ba
所有值均表示为平均值±GydF4y2Ba扫描电镜GydF4y2Ba.使用GraphPad软件(GraphPad software for Science Inc, San Diego, CA, USA)进行组间比较。两组比较采用非配对t检验,使用Pearson r相关系数将纤维细胞数量与临床和血液动力学参数相关联。p<0.05为差异有统计学意义。GydF4y2Ba
后果GydF4y2Ba
纤维细胞定量GydF4y2Ba
循环纤维细胞在几种慢性炎症疾病中增加,包括成人纤维化性肺病[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba].此外,这些细胞的数量越多,疾病的严重程度和预后就越差[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].我们假设患有严重PH的儿童和年轻成人会有更多的循环纤维细胞。事实上,我们发现,与对照组相比,PH患者外周血中纤维细胞的数量和百分比显著增加(平均值±)GydF4y2BasdGydF4y2Ba0.42×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba±0.21×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba每毫升CD45+前胶原I+细胞数(4.24±3.06%)(n=26)GydF4y2Ba对GydF4y2Ba0.21×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba±0.10×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba每毫升CD45+ I前胶原细胞(0.84±0.23%)(n=10) (GydF4y2Ba图1GydF4y2Ba与继发性PH相比,患有IPAH的患者的纤维细胞数量无统计学显著差异。患有PH的女性和男性患者的纤维细胞数量无统计学差异。未经治疗或接受过一次治疗的个体(约GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba通道阻断剂(西地那非或安布里森坦)的平均纤维细胞/CD45+计数为3.35%,而两种药物治疗的患者为3.90%,接受三种或三种以上治疗的患者为5.99%。病情最严重的是那些接受三种或三种以上药物治疗的患者。GydF4y2Ba
纤维细胞与临床和血流动力学参数的相关性GydF4y2Ba
纤维细胞数量与GydF4y2BaP̄GydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构GydF4y2Ba(r=0.575,p<0.05)和年龄增长(r=0.354,p<0.05)(GydF4y2Ba图2c-fGydF4y2Ba).纤维细胞数量与性别、6分钟步行距离、血浆脑利钠肽(BNP)、n端前BNP或治疗时间之间没有相关性(数据未显示)。我们发现血浆单核细胞趋化蛋白-1水平无统计学差异(305.3±64.7)GydF4y2Ba对GydF4y2Ba276.7±39.7pg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)或基质衍生因子(SDF)-1(1943.6±398.5)GydF4y2Ba对GydF4y2Ba2100.1±459.9 pg·mLGydF4y2Ba−1.GydF4y2Ba)在PH值之间GydF4y2Ba对GydF4y2Ba控制,分别。GydF4y2Ba
纤维细胞的免疫表型确认GydF4y2Ba
我们试图确认对照组和PH受试者的纤维细胞的流式分选结果。使用与流式细胞术相同的程序,我们通过免疫荧光法验证其表型。正如预期的那样,PH患者(而非对照组)的细胞百分比强烈表达前胶原,从而确认了流式细胞术方案的有效性(GydF4y2Ba图3GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
基于涉及PH病理生物学中纤维细胞的动物模型和证明间质性肺病患者纤维细胞数量增加的人类研究,我们检验了PH患者循环中纤维细胞增加的假设。我们发现循环纤维细胞显著富集(定义为CD45+前胶原+细胞)与接受心律失常导管插入术的对照组相比,PH患者中的CD45+前胶原+细胞。此外,我们发现纤维细胞计数与GydF4y2BaP̄GydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构GydF4y2Ba还有年龄。结合我们团队和其他人之前的研究发现,在一个低氧PH的新生儿小腿模型中,肺血管内和周围的纤维细胞有丰富的装饰[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba,GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba],我们的数据支持这样的观点,即这些祖细胞的存在可能有助于炎症环境下病理性肺血管重塑。这是PH患者循环纤维细胞数量增加的首次证明,这种细胞类型已在患有慢性炎症性疾病的成年人中确定,并与预后不良、炎症和肺组织重塑有关。因此,我们的研究可能是理解纤维细胞在儿科PH过程中假定的病理作用的第一步。GydF4y2Ba
纤维细胞的生物学正迅速成为人们关注的焦点。最初被描述为影响组织修复的白细胞亚群[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba,纤维细胞在正常伤口愈合和纤维化中起关键作用[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba].它们从前体细胞分化是复杂的,但可能被细菌感染通过toll样受体2激活而抑制[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]在其他情况下,通过转化生长因子-β,纤维细胞可分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞表型[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]过氧化物酶体增殖物激活受体-γ[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]除组织重塑外,纤维细胞还与慢性炎症状态呈负相关。纤维细胞从骨髓中动员并在慢性炎症区域积聚,可能通过SDF-1/CXC趋化因子受体4信号轴[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba].GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba在PH的动物模型中研究了纤维细胞,纤维细胞与血管重塑、肺动脉压力升高和支气管血管区域的积聚有关[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba18GydF4y2Ba].尽管单核细胞流入肺的程度在患有PH的成年人中已被充分记录[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba),我们的研究首次定量评估循环纤维细胞在儿童和年轻成人博士目前的研究已经证实,纤维细胞存在于患者的血液博士如何(或是否)纤维细胞导致的肺血管重塑人类的条件还有待确定。至少在临床环境中,纤维细胞更精确的功能特征目前被似乎需要(细胞内)胶原蛋白作为纤维细胞识别的“金标准”所阻碍。使用细胞外标记物作为胶原蛋白表达的替代物的磁珠或流动分选可以避免固定和假定的纤维细胞通透性的需要,这一过程与许多下游功能检测不相容。最近,从慢性炎症患者中分离出来的纤维细胞显示出激活的表型[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]此外,培养的纤维细胞的表达谱不同于单核细胞、巨噬细胞和成纤维细胞[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba].这些发现突出了纤维细胞分化的复杂性,其中的细节(干细胞、过程、时间机制、组织影响、GydF4y2Ba等GydF4y2Ba)对纤维细胞具有高度特异性的细胞表面标记物的鉴定将有助于理解纤维细胞功能作用的研究GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba,正如已经确定的血清淀粉样蛋白P[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba].我们的研究小组此前已经证明,缺氧时大鼠肺血管系统的血管重塑和炎症需要单核/巨噬细胞系的循环细胞[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba].使用纤维细胞特异性激动剂和拮抗剂,基于GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba和GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba表面标志物的免疫表型将更明确地确定最负责重塑的细胞类型。GydF4y2Ba
纤维细胞数量与免疫功能的相关性分析GydF4y2BaP̄GydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构GydF4y2Ba纤维细胞计数与其他患者的人口统计学数据不相关。纤维细胞计数与年龄之间缺乏更强的相关性GydF4y2BaP̄GydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构GydF4y2Ba这并不完全令人惊讶,原因有几个。首先,我们的PH患者队列的年龄范围为22岁,有很大的标准差(6.18岁)。没有研究可以确定纤维细胞计数和年龄之间的联系。我们假设GydF4y2Ba先验的GydF4y2Ba对照组中(年轻)个体的纤维细胞数量较低(≤在对照组成人中观察到的。然而,这是一个需要额外测试的假设。在任何情况下,我们发现对照组外周血中的纤维细胞数量较少,与老年对照组中记录的数量相似[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]其次,我们研究中的许多PH患者采用了长期有效的不同治疗方案,包括钙通道阻滞剂、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂和前列腺素类药物。此外,一些儿童对急性血管扩张剂激发有反应,而其他儿童则没有。因此,可变的cl临床表现和潜在病理生物学(GydF4y2Ba如。GydF4y2BaIPAHGydF4y2Ba对GydF4y2Ba我们研究组的APAH-CHD)可能降低了纤维细胞数量,使其与PH值的严重程度更密切相关,如GydF4y2BaP̄GydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构GydF4y2Ba.事实上,由于前列环素激动剂的治疗似乎增加了晚期EPCs的数量,这种治疗也可能导致纤维细胞进入循环。在未来的研究中,限制对循环纤维细胞的分析,排除PH与广泛的肺部炎症和重塑无关的患者,以及对诊断患者(未经治疗的患者)的研究可能会有成果。纤维细胞参与了正常的伤口愈合和炎症,但目前我们无法确定这些患者参与了哪些机制。我们推测其机制是促炎的,也许,患有最严重疾病(接受三联疗法)的患者也有最高的纤维细胞数量的数据提供了支持这一假设的线索。这与EPCs相反,EPCs被认为随着PH值的增加而减少[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]因此,不同祖细胞群体的集体贡献控制肺内环境稳定,并进而在发病过程中偏离内环境稳定是合理的。GydF4y2Ba
综上所述,我们已经显示了PH患者和非PH患者之间循环纤维细胞的数量差异。纤维细胞计数与PH升高相关GydF4y2BaP̄GydF4y2Ba巴勒斯坦权力机构GydF4y2Ba和年龄。这项研究表明这些细胞在PH发病机制中的潜在作用,但需要更多的研究来证实我们的发现。在过去的十年中,大量新的研究重点放在肺炎症和血管重塑的机制上。我们的研究指出循环间充质祖细胞在这些炎症过程中的潜在贡献。GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
我们要特别感谢R. Strieter (Robert M. Byrne Cardiovascular Research Center, University of virginia, Charlottesville, VA, USA)的慷慨和仁慈,在他的实验室我们了解了在本报告中使用的技术。我们也要感谢来自斯特里特实验室的M. Burdick,感谢他的授课和慷慨的招待。我们感谢科罗拉多大学癌症中心流式细胞术中心(Denver, CO, USA)的技术援助。GydF4y2Ba
脚注GydF4y2Ba
有关编辑评论,请参见GydF4y2Ba第5页GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
支持声明GydF4y2Ba
这项研究是由美国国立卫生研究院(NIH)的临床导向研究特别资助中心HL 0849 23-02,NIH项目计划授予HL 014985-35,NIH/NCRR科罗拉多CTSI授予号UL1 RR025780,Jayd-Delua基金会和利亚Bult肺动脉高压研究基金。GydF4y2Ba
利益陈述书GydF4y2Ba
M.E.Yeager的利益声明可在GydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.com/site/misc/statements.xhtmlGydF4y2Ba
- 收到GydF4y2Ba2011年4月28日。GydF4y2Ba
- 认可的GydF4y2Ba2011年6月5日。GydF4y2Ba
- ©ERS 2012GydF4y2Ba
参考文献GydF4y2Ba
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