文摘gydF4y2Ba
本研究测试的假设来源于单核细胞的骨(BMDMC)治疗可以减少肺部炎症和纤维化导致改善呼吸力学矽肺病的小鼠模型。gydF4y2Ba
52岁女性C57BL / 6小鼠被随机分为四组。石英组(银),硅悬挂(20毫克/ 50μL盐水)气管内的灌输。在控制动物,50μL盐水是气管内的管理。1 h,控制和硅组进一步的随机,接收BMDMC (2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba注射。gydF4y2Ba控制细胞和SIL-cell)或生理盐水(50μLgydF4y2Ba注射。gydF4y2Ba控制和硅)。BMDMC得到来自男性供者老鼠。在15天,肺力学、组织学和Y染色体的存在,白介素(IL) 1β,IL-1α,IL - 1受体拮抗剂(IL-1RN), IL - 1受体1型,转化生长因子(TGF) -βcaspase-3 mRNA表达在肺组织进行分析。gydF4y2Ba
SIL-cell组分数的肉芽肿,巨噬细胞和胶原纤维含量的数量减少,从而提高肺力学。男性供者细胞在肺组织的存在是没有证实使用检测Y染色体DNA。然而,caspase-3 IL-1β、IL-1αIL-1RN和TGF-βmRNA表达细胞疗法后减弱。gydF4y2Ba
总之,BMDMC行动通过旁分泌炎症和纤维发生的过程改善肺功能影响。gydF4y2Ba
矽肺是尘肺病,包括结节的形成和破坏的大面积肺气体交换和肺功能受损,这可能导致呼吸衰竭。尽管广泛的努力,没有可用的治疗已被证明有效地停止或逆转这种障碍gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
成人骨髓来源的细胞(BMDC)作为骨祖细胞替换和/或修复受伤的组织gydF4y2Ba4gydF4y2Ba纤维化的实验模型gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。最近,我们的角色分析气管内的盒子BMDC矽肺模型,观察肺力学只有轻微改善gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,这可能是由于:1)矽肺的发病机理;2)BMDC注入的时机(早期或晚期肺损伤过程中);3)细胞的类型和给药途径。因此,我们测试了早期的假说,静脉注射和单一剂量的骨骨髓来源的单核细胞(BMDMC)可能避免机械肺癌小鼠模型的变化silica-induced纤维化。为此,肺静态倒电容、电阻和粘弹性压力,组织学,炎症和纤维发生的介质测量硅滴剂后15天。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
本研究经伦理委员会批准的卡洛斯·恰加斯球场生物物理研究所更健康科学中心,里约热内卢联邦大学(巴西里约热内卢)。所有的动物获得了人道关怀符合实验动物保健原则由国家医学研究学会和制定指南的护理和使用实验动物由美国国家科学院(美国华盛顿特区)。gydF4y2Ba
动物的准备和实验协议gydF4y2Ba
91 C57BL / 6小鼠(72女性和19岁男性,20 - 25 g)保持在特定的无菌条件下在动物保健设施肺调查和实验室的细胞和分子生理学、里约热内卢联邦大学。32雌性老鼠被用来评估肺力学和组织学、caspase-3 mRNA表达白介素(IL) 1β,IL-1α,IL - 1受体拮抗剂(IL-1RN), IL - 1受体1型(IL-1R1)和转化生长因子(TGF) -β,而Y染色体DNA检测在其余40。所有的动物被随机分配到四组。石英组(银),老鼠接受气管内的注入20毫克的石英晶体(1 - 5μm之间的粒度:80%;σ化学,圣路易斯,密苏里州,美国)悬浮在生理盐水(50μL总量),而盐水(50μLgydF4y2Ba信息技术。gydF4y2Ba)在对照组(C)灌输。从雄性老鼠BMDMC (2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·50μLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba生理盐水)静脉注射(C-cell和SIL-cell组)1 h后盐水或硅管理。gydF4y2Ba
提取BMDMCsgydF4y2Ba
来自14个雄性C57BL / 6小鼠的骨髓细胞(20 - 25克)被冲洗吸气从股骨和胫骨骨髓腔与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM;生命技术®,大岛屿,美国纽约)。实现了均匀的细胞悬液后,细胞离心(400×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟),re-suspended DMEM和添加到Ficoll-Hypaque (Histopaque 1083;σ化学),再次离心,用无菌PBS补充。细胞数在纽鲍尔和台盼蓝室评估的可行性。描述是由细胞流式细胞仪使用特定抗体。gydF4y2Ba
肺力学gydF4y2Ba
后15天的盐水或二氧化硅,动物镇静(安定1毫克gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba),犀牛(硫喷妥钠20毫克公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)、tracheotomised瘫痪(维库溴铵0.005 mg·kggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba注射。gydF4y2Ba)与恒流风机和通风(Samay VR15;)大学de la那时,乌拉圭的蒙得维的亚用以下参数:100次·分钟的频率gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;潮汐卷(gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba0.2毫升);和启发的氧为0.21。前胸壁手术切除和呼气末正压通气2而言不啻gydF4y2Ba2gydF4y2BaO运用。10分钟后通风期,肺力学计算,最后的实验(∼30分钟),肺组织学的准备。gydF4y2Ba
肺静态倒电容(gydF4y2BaEgydF4y2Ba圣,我gydF4y2Ba),电阻(δgydF4y2BaPgydF4y2Ba1,LgydF4y2Ba)和粘弹性(δgydF4y2BaPgydF4y2Ba2,我gydF4y2Ba结束阻塞)压力测量的方法gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。所有数据分析使用ANADAT数据分析软件(RHT-InfoData, Inc .,蒙特利尔,魁北克,加拿大)。gydF4y2Ba
组织学gydF4y2Ba
进行剖腹手术后立即测定肺力学和肝素(1000 IU)腔静脉静脉注射。气管夹在end-expiration,腹主动脉和腔静脉分段,产生大量出血,迅速杀死动物。正确的肺和10%缓冲福尔马林固定,石蜡包埋。每肺4-μm厚片(3)是削减和苏木精和伊红染色。gydF4y2Ba
肺的形态学分析使用一个与一个连贯的系统集成目镜组成的网格以100分和50行(长度)与传统的光学显微镜(奥林巴斯BX51;奥林巴斯拉丁美国公司。巴西圣保罗)。肉芽肿的面积分数是由20个随机点估算技术非co-incident微观领域的放大×200。多形核的,单核细胞和总肺实质和肉芽肿进行评估×1000放大和由点估算技术gydF4y2Ba10gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
胶原纤维(picrosirius方法)量化在肺泡隔和肉芽肿gydF4y2Ba11gydF4y2Ba。免疫组织化学进行了与传统avidin-biotin-peroxidase组织化学技术使用一只山羊anti-rat生物素化的抗体(ba - 4001;美国向量实验室,伯林盖姆,CA)对生物素化的Bandeiraea simplicifolia凝集素1 (BSL-1 B1205;向量实验室),标签巨噬细胞gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba。在每个幻灯片、15个不同的微观领域被随机选择和量化(×200放大)是借助数码相机(进化议员工具包媒体控制论,银泉,医学博士,美国)耦合到光显微镜(Eclipse 400;尼康,日本东京)。高质量(2048×1536像素)获得的图像使用图像专业+ 4.5.1软件(媒体控制论)。建立了胶原纤维的阈值对比度增强后在一定程度上的纤维很容易认定为双折射。该地区被胶原纤维是由数字光密度识别。支气管和血管被小心翼翼地避免测量。纤维所占据的面积除以组织胶原纤维区和表达为分数区。阳性细胞(巨噬细胞)数除以肺实质和肉芽肿区域表示为分数的巨噬细胞。gydF4y2Ba
Y染色体DNA检测gydF4y2Ba
量化的小鼠肺组织Y染色体是通过定量实时PCR在天1、3、7和15。短暂,DNA纯化600 -μl解决0.2%十二烷基硫酸钠/蛋白酶K(300μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba),提取与同等体积的酚/氯仿/异戊醇。离心后,水相转移到一个新的管和DNA是沉淀两卷乙醇100%。DNA resuspended nanodrop分光光度计和量化。5 ng的DNA被用于实时PCR反应SYBR绿色检测设备运行在7000年序列检测系统thermocycler根据制造商的指示(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。以下使用PCR引物:转发:5′-TCATCGGAGGGCTAAAGTG-3′;反向:5′-CAACCTTCTGCAGTGGGAC-3′。引物序列定义使用primer3软件基于亩骶决定性别的地区所对应的Y(对不起)基因(基因银行加入号码gydF4y2BaNM_011564gydF4y2Ba;美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。这些引物扩增一个产品88个基点。总DNA计算的相对数量比例(2-ΔgydF4y2BaCgydF4y2BatgydF4y2Ba)的Sry基因和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)。的引物GAPDH是:转发:5′-CCACCAACTGCTTAGCCC-3′;反向;5′-GACACCTACAAAGAAGGGTCCA-3′, 145个基点gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
表达caspase-3、IL-1βIL-1α、IL-1RN IL-1R1 TGF-βgydF4y2Ba
实时定量rt - pcr进行测量的相对表达水平的炎症和纤维发生的介质。中央片左肺被削减,在cryotubes收集,速冻浸泡在液氮中,储存在-70°C。冷冻组织总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的建议。RNA浓度的分光光度法测定Nanodrop®nd - 1000。第一链cDNA从使用M-MLV总RNA逆转录酶合成装备(表达载体)。目标基因的PCR引物从英杰公司购买。相对mRNA水平测量SYBR绿色检测系统使用ABI 7500实时PCR(应用生物系统公司)。所有样品都是一式三份。caspase-3的相对量,IL-1β和TGF-β表达式计算比率(2-ΔgydF4y2BaCgydF4y2BatgydF4y2Ba)研究的基因与控制(GAPDH)。引物使用和PCR产品尺寸如下。Caspase-3:向前5′-TACCGGTGGAGGCTGACT-3′和反向5′-GCTGCAAAGGGACTGGAT-3′, 104个基点;IL-1β:向前5′-GTTGACGGACCCCAAAAG-3′和反向5′-GTGCTGCTGCGAGATTTG-3′, 93个基点;IL-1α:向前5′-TCAACCAAACTATATATCAGGATGTGG-3′和反向5′-CGAGTAGGCATACATGTCAAATTTTAC-3′, 102个基点;IL-1RN:向前5′-AACCACCAGGGCATCACATA-3′和反向5′-CCTCTTGCCGACATGGAATA-3′, 150个基点;IL-1R1:向前5′-GAGTTACCCGAGGTCCAG-3′和反向5′-GAAGAAGCTCACGTTGTC-3′, 66个基点;TGF-β:向前5′-ATACGCCTGAGTGGCTGTC-3′和反向5′-GCCCTGTATTCCGTCTCCT-3′, 77个基点;向前和GAPDH: 5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′和反向5′-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′, 62个基点gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
数据的正常(Kolmogorov-Smirnov测试与Lilliefors校正)和方差的同质性(列文值测试)测试。如果两个条件都满意,两组之间的差异是由双向方差分析评估图基的测试。硅和SIL-cell组之间的比较使用未配对t检验或执行Mann-Whitney紫外线测试参数和非参数数据,分别。数据均值±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba或中位数(25 th - 75百分位数)。在所有的测试中设定在5%显著性水平。统计分析使用SigmaStat 3.1 (Jandel科学、圣拉斐尔、钙、美国)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
BMDMC影响生存,肺部炎症和胶原蛋白的积累gydF4y2Ba
BMDMC静脉注射注射的池的特点是流式细胞仪显示以下成分:总淋巴细胞(4.18%)(CD45 + CD11b、CD29和CD34 -);T淋巴细胞(2.13%)(CD45 +, CD3 +和CD34 -);辅助淋巴细胞(0.47%)(CD4 +和CD8);T细胞毒性(1.66%)(CD4和CD8 +);单核细胞(2.76%)(CD45 + CD29 +, CD14 + CD38 + CD11b, CD34 -和CD3);粒细胞(78.7%)(CD45 + CD11b + CD38 +、CD34、CD29, CD14、CD34 -和CD3);造血祖细胞(0.48%)(CD34 +);和其他祖细胞(9.13%)。gydF4y2Ba
对照组的动物存活率为100%和53%,银集团。BMDMC注入了79%的存活率(p < 0.05)。gydF4y2Ba
组织学评价silica-treated老鼠间质和肺泡水肿,炎性细胞和肉芽肿结节有大量积累。BMDMC的治疗取得了显著减少的面积分数肉芽肿(144%)(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。然而,没有观察到显著变化的多形核中性粒细胞和单核细胞肉芽肿(MN)。相反,silica-treated老鼠提出更高的中性粒细胞数量和MN肺实质细胞与对照组相比。BMDMC疗法导致中性粒细胞减少和MN细胞(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
银组肺实质BSL-1-positive巨噬细胞的数量增加和肉芽肿。BMDMC治疗导致显著减少的数量BSL-1-positive巨噬细胞在肺实质与肉芽肿(无显著变化gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
大量的胶原纤维在肺泡隔和肉芽肿减少在silica-treated BMDMC治疗后小鼠(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
BMDMC影响肺移植和IL-1β、IL-1αIL-1RN, IL-1R1, TGF-βcaspase-3gydF4y2Ba
Y染色体DNA中没有检测到肺组织在天1、3、7和15(补充材料)。gydF4y2Ba
IL-1β,IL-1αIL-1RN表达式和高硅相比,对照组(分别为3.45、3.37和4.40倍,)(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。BMDMC显著降低IL-1β,IL-1αIL-1RN mRNA表达。IL-1R1 mRNA表达未加硅或BMDMC管理独立的。gydF4y2Ba
Caspase-3 (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)和TGF-β(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)mRNA表达在肺组织高硅相比,对照组(分别为2.48和3.51倍)。BMDMC治疗显著降低caspase-3和TGF-βmRNA表达控制值。gydF4y2Ba
肺力学gydF4y2Ba
流和无显著差异gydF4y2BaVgydF4y2BaTgydF4y2Ba在组。gydF4y2BaEgydF4y2Ba圣,我gydF4y2Ba,δgydF4y2BaPgydF4y2Ba1,LgydF4y2Ba和δgydF4y2BaPgydF4y2Ba2,我gydF4y2Ba压力控制和C-cell组相似。在银集团gydF4y2BaEgydF4y2Ba圣,我gydF4y2Ba,δgydF4y2BaPgydF4y2Ba1,LgydF4y2Ba和δgydF4y2BaPgydF4y2Ba2,我gydF4y2Ba较高(分别为177%、150%和177%)比对照组。BMDMC显著抑制机械肺的变化(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在最近的研究中,我们观察到早期静脉治疗BMDMC导致肉芽肿的面积分数减少,肺泡隔中巨噬细胞的数量,和胶原纤维内容导致的改善gydF4y2BaEgydF4y2Ba圣,我gydF4y2Ba,δgydF4y2BaPgydF4y2Ba1,LgydF4y2Ba和δgydF4y2BaPgydF4y2Ba2,我gydF4y2Ba压力。这些有利影响是不与移植相关的但可以归因于旁分泌作用减少caspase-3 IL-1β,IL-1α,IL-1RN, IL-1R1 TGF-βmRNA的表达。gydF4y2Ba
动物研究表明,甚至一个接触石英可以导致肺morpho-functional变化在15天模仿临床设置gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。硅动物提出了增加gydF4y2BaEgydF4y2Ba圣,我gydF4y2Ba,δgydF4y2BaPgydF4y2Ba1,LgydF4y2Ba和δgydF4y2BaPgydF4y2Ba2,我gydF4y2Ba压力。观察到的变化δgydF4y2BaPgydF4y2Ba1,LgydF4y2Ba可以归因于intrabronchial细胞渗透妨碍腔。的增加gydF4y2BaEgydF4y2Ba圣,我gydF4y2Ba和δgydF4y2BaPgydF4y2Ba2,我gydF4y2Ba压力可能会出现肉芽肿结节,细胞数量的增加肺泡隔和肉芽肿,肺泡崩溃,扭曲的专利肺泡和间质水肿,依照先前的研究在silica-treated BALB / c小鼠gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。银集团还显示增加巨噬细胞的数量在肉芽肿和肺实质,这可能释放炎性细胞因子il - 1等gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,招聘的炎症细胞进入肺泡隔gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。il - 1家族包括IL-1αIL-1βIL-1RN,绑定到相同的受体,IL-1R1gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba。在这种情况下,增加在肺组织中il - 1的表达水平与肺纤维化的发展。BMDMC疗法减少IL-1α和IL-1RN mRNA表达按照研究奥尔蒂斯gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,观察减少IL-1αIL-1RN mRNA表达间充质干细胞后政府bleomycin-induced损伤的小鼠模型。相反,IL-1R1 mRNA表达硅和/或BMDMC注入后保持不变。并发炎症过程,暴露于二氧化硅也启动细胞凋亡gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,增加caspase-3表达式(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。细胞凋亡也被牵连引发的改造过程gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,增加TGF-β表达式(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba),它可以影响间充质细胞迁移、增殖和细胞外基质沉积gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。因此,胶原纤维含量增加肺泡隔和肉芽肿(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。BMDMC减少了炎症过程减少巨噬细胞的数量在silica-induced肺纤维化有至关重要的作用,并减少IL-1β表达的肺部组织。减少IL-1βmRNA表达可能与肺实质的巨噬细胞数量的减少gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。促炎细胞因子,如IL-1β,发挥关键作用的发展矽肺病的介质通过调节负责持久性炎症和纤维化的发展gydF4y2Ba25gydF4y2Ba。此外,IL-1β已经涉及胶原的沉积gydF4y2Ba26gydF4y2Ba。在这种背景下,BMDMC减少了胶原纤维的肺泡隔和肉芽肿和TGF-βmRNA的表达。此外,凋亡机制涉及silica-induced发病机理gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba。Caspase-3表达减少小鼠治疗。gydF4y2Ba
先前的研究已经表明,BMDCs潜力治疗肺纤维化gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。这些研究使用间充质干细胞(MSC)需要细胞培养过程,产生一些缺点与文化条件,不利于细胞移植,并污染和免疫反应的风险gydF4y2Ba27gydF4y2Ba。最近,造血干细胞已经被认定为几个细胞祖细胞(内皮细胞、上皮细胞和神经元)和能够减少肺损伤小鼠肝纤维化模型gydF4y2Ba28gydF4y2Ba。骨髓单核细胞,因此,在我们的研究中,已知含有造血的和MSC,选择治疗silica-induced肺纤维化。此外,大多数的干细胞是困在肺部静脉输液后,与BMDMC通道与msc相比增加了30倍gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
在先前的研究中,奥尔蒂斯gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba表明,MSC治疗肺部炎症和羟脯氨酸的含量减少bleomycin-induced纤维化。罗哈斯gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba还描述了一种减少一些细胞因子的表达(IL-1β、2、il - 4)和修复bleomycin-injured肺。asbestos-induced肺纤维化小鼠模型,spegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba能够识别罕见BMDC II型pneumocytes的表型。所有这些研究描述了一个移植低于5%gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。在这种背景下,LassancegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba8gydF4y2BaBMDCs改善肺力学的报道,气管内的滴剂和组织学独立能力的细胞肺癌小鼠模型的灌输矽肺病。silicotic动物,使用荧光技术来评估归航,如绿色荧光蛋白阳性细胞和荧光gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交分析,是不可行的,因为石英晶体双折射。因此,在目前的研究中,男性DNA通过执行实时PCR扩增gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,供者细胞不能被发现在治疗小鼠天1,3,7和15。BMDMC减少肺纤维化的治疗所示可以归因于旁分泌作用减少炎症和纤维化的释放介质。gydF4y2Ba
有益的结论,早期静脉BMDMC治疗可能是独立于骨髓细胞归巢到肺,但通过下调介导的炎症和纤维发生的对硅的反应。因此,胶原纤维含量减少了肺实质的重组,改善肺力学。这些发现的第一个证据,早期政府BMDMC疗法silica-induced肺损伤后可能有益。因此,目前的实验模型系统可以作为起点在未来更有针对性的研究。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba可以从本文的补充材料gydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
支持声明gydF4y2Ba
本研究支持的卓越中心项目(PRONEX-FAPERJ),巴西科学和技术发展委员会(CNPq),卡洛斯·恰加斯球场里约热内卢州更研究支持基础(FAPERJ)和协调高等教育人员(披肩)的提高。gydF4y2Ba
感兴趣的语句gydF4y2Ba
没有宣布。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2009年12月31日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2010年7月21日。gydF4y2Ba
- ©2011人队gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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