抽象的
年代-carboxymethylcysteine (年代-CMC)已被用作呼吸系统疾病的黏液调节剂。然而,其作用机理年代-CMC对过敏性气道炎症的作用尚未确定。
在本研究中,BALB/c小鼠最初对卵清蛋白(OVA)致敏,并在数周后再次对OVA进行激发(二次激发)。年代-cmc(5-100 mg·kg−1)从二次激发前2天至试验当天。
小鼠在第二次攻毒6小时后出现气道高反应性(AHR),支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞数量增加。在二次攻毒72小时后,小鼠再次出现AHR,但BAL液中含有大量嗜酸性粒细胞。年代-CMC处理可在6小时内降低AHR和中性粒细胞 h、 以及72岁时的嗜酸性粒细胞增多和AHR h、 这些效应呈剂量依赖性。72岁时观察到杯状细胞增生 h、 减少了年代cmc。BAL液中干扰素-γ、白细胞介素(IL)-12和IL-10水平升高,IL-5和IL-13水平降低。
总之,数据表明年代-Carboxymethylysteine在两种不同阶段的敏化小鼠中对次级过敏原攻击的反应的两个不同阶段有效地减少气道高反应性和气道炎症。
尽管自20世纪90年代以来,哮喘治疗取得了重大进展,但发病率和死亡率仍然是全世界关注的问题1.在哮喘的发病机制中,各种炎症细胞被认为在气道高反应性(AHR)和过敏性气道炎症的发展中发挥重要作用。常见的理论是,这种疾病是慢性气道炎症的结果,很大程度上依赖于嗜酸性粒细胞,导致AHR和可逆的气道阻塞2,3..随着发病率和治疗性不足的升高,现在更明显的是,哮喘是一种异质综合征,具有许多细胞类型和培养方为疾病表型贡献。呼吸道疾病的核心病发生的核心是抗原特异性的记忆T细胞反应,也许是较小程度,抗原特异性免疫球蛋白E反应4,5.
相反,粘液的高度折射是哮喘学的主要症状之一,与致命的哮喘发病机制有关6.尽管黏液产生对哮喘气道的作用尚不清楚,但MUC5AC和其他黏液蛋白基因已在临床研究中显示与哮喘状态相关7在动物模型中8.年代-carboxymethylcysteine (年代-CMC)作为黏液调节剂用于治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘和慢性鼻窦炎、中耳炎等慢性鼻部疾病,有一定疗效9- - - - - -11. 然而,很少有研究涉及变应原诱发哮喘的潜在疗效或作用机制。片山等等。12显示,年代在抗原诱导的豚鼠模型中,-CMC降低咳嗽敏感性,但不降低AHR和Asti等等。13抑制对烟雾诱导的AHR的抑制作用。年代已知cmc抑制中性粒细胞趋化体外也体内13,14.在过敏原挑战后的早期点,已经显示出气道功能的嗜中性粒细胞数量增加。伴随着气道功能的变化15.然而,中性粒细胞的消耗似乎对过敏性气道嗜酸性粒细胞炎症或AHR影响不大16.
在本研究中,我们利用小鼠模型来区分抗原激发后早期的嗜中性粒细胞为主阶段和晚期的嗜酸性粒细胞为主阶段,嗜中性粒细胞很少。这两个阶段都与AHR有关。来确定年代-CMC可以调节这两个阶段的炎症反应,在二次激发前给药,并监测气道炎症和AHR的变化。
材料和方法
动物
6-8周龄的女性Balb / C小鼠从杰克逊实验室(Bar Harbor,USA)获得了6-8周龄。将动物保持在卵烧蛋白(OVA) - 免饮食上。实验是根据国家犹太医学和研究中心(美国丹佛,Co)批准的一份议定书批准的议定书。
实验方案
对过敏原的致敏和挑战的实验方案由先前描述的方法改性17.简单地说,老鼠被i.p。注射10μg的OVA(V级; Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo,USA)在2.25毫克氢氧化铝(Alumimuluject; Pierce,Rockford,IL,USA),在第1天的总体积为100μl7.小鼠受到挑战(小学)通过通过超声波雾化器(Model Ne-U07; Omron Healthcare,Vernon Hills,IL,IL,US,美国),在第14,15和16天(盐水中0.2%)的气道(盐水0.2%)20分钟。在第30天,小鼠接受了单一的次要挑战通过卵圆率为1%的航空公司20天 最小对照组小鼠接受生理盐水作为第二次激发 h和72 h(图。 1.⇓)次要挑战后。
确定效果年代-CMC对气道过敏炎症和AHR的作用,5、10或100 mg·kg−1属于年代cmc是管理b.i.d。在500μldh2奥比i.p。第二次激发前2天至研究当天。对照组小鼠以相同方式接受生理盐水。年代-CMC由Kyorin Pharmaceuticals(日本东京)提供。
气道反应性测定
在烟雾化甲素(MCH; SIGMA)攻击后,评估了气道反应性作为气道功能的变化。用如前所述评估的肺功能麻醉,气管造口术和机械通风的小鼠进行麻醉,气管造口气和机械通风18.通风在160次呼吸·min−1在0.16毫升的潮气体积,呈末端呼气压力为2-4 cmh2O.肺阻力(Rl)通过使用隐性最小二乘算法将流量、体积和压力拟合到运动方程,连续计算(Labview,美国德克萨斯州国家仪器公司)。
雾化MCh通过旁路管注入通过超声波雾化器(5500D型;美国宾夕法尼亚州萨默塞特DeVilbiss)置于呼吸机呼气口和四通接头之间。雾化妇幼保健给药8个月 s,潮气量为0.45 mL和60次呼吸的频率·min−1使用另一个呼吸机(型号683;哈佛仪器,南纳蒂克,马,美国)。的数据Rl连续收集的时间长达3天 取最小值和最大值。PC200值(诱导200%变化所需的MCH浓度Rl还计算了相对于盐水)。
支气管肺泡灌洗
在评估AHR后立即,肺部受动通过含汉克平衡液的气管导管(HBSS;1×1 毫升,37摄氏度)。在每个样本中测量收集的支气管肺泡灌洗液(BAL)的体积,并计数白细胞的数量(Coulter Counter;Coulter Corporation,Hialeah,FL,USA)。通过在细胞离心制备物(Cytospin 3;Shandon Ltd,Runcorn,英国)上计数至少200个细胞来进行细胞差异计数。用改良的Wright Giemsa对载玻片进行染色,并通过标准血液学程序以盲法对白细胞进行分化。收集BAL液体上清液并储存在−70°C,直到测量。
细胞的准备体外细胞因子生产
确定…的效果年代-CMC在单个细胞水平上对细胞因子产生的影响,用不同浓度的OVA和年代cmc。继发攻毒72 h后取小鼠脾脏、支气管周围淋巴结和肺。从脾脏和支气管周围淋巴结(PBLN)中分离单个核细胞。通过胶原酶消化和梯度离心(35% Percoll (Sigma))获得肺单个核细胞,以去除上皮细胞。在生理盐水激发和1 mL HBSS灌注4次后收集BAL液中的细胞。为了净化气道巨噬细胞,将BAL细胞置于37℃塑料培养皿中培养1 h,然后用37℃HBSS洗涤3次。收集到的黏附细胞显示为>95%的巨噬细胞。脾、PBLN和肺细胞(2×105)和肺泡巨噬细胞(1×105),加入或不加入10µg·mL培养−1OVA。年代在0,1,10和100μg·mL的浓度下将-CMC加入到培养物中−1.37℃孵育24 h后收集上清液。
细胞因子的测定
如前所述测量来自细胞培养物的BAL流体或上清液中的细胞因子水平19.简单地说,用96孔板(Immulon 2;Dynatech,尚蒂伊,弗吉尼亚州,美国)。采用ELISA试剂盒(QuantikineM;研发系统,明尼阿波利斯,MN,美国),所有遵循制造商协议。检出限为1.5 pg·mL−1IL-13;4 pg·毫升−1对于IL-4和IL-5;和10 pg·ml−1IL-10和IFN -γ。
组织学研究
肺通过气管充气,通过10%10%福尔马林膨胀,并通过浸渍固定在10%福尔马林中。在主支气管周围切割肺组织块并嵌入石蜡中。将切片(6μm)与血红素 - 曙红(HE)进行切割并染色以分析炎症细胞浸润。为了检测福尔马林固定气道组织中含粘液的细胞,部分染色酸性 - 席夫(PAS)并与他染色。含有嗜酸性主要碱性蛋白质(MBP)的细胞通过如先前使用兔 - 抗小鼠MBP(由J.J. Lee,Mayo Clinic,Scottsdale,AZ,USA提供)的免疫组织化学染色来鉴定免疫组织化学染色20.使用尼康显微镜(Melville, NY, USA)将载玻片转换成图片,该显微镜配有荧光素过滤系统。pas阳性细胞和组织中支气管周围嗜酸性粒细胞的数量使用NIH图像分析系统(版本1.63;NIH, Bethesda, MA, USA),并以盲法计算每个幻灯片6-8个不同的领域。
统计分析
所有结果都表示为平均值±扫描电镜.ANOVA用于确定所有组之间的差异水平。通过未配对的双尾T检验进行群体进行比较。用于分析肺泡巨噬细胞培养物中IL-10水平,使用MANN-WHITNEY U-Rest。显着性的p值设定为0.05。
结果
年代-CMC对气道的剂量依赖效应
确定是否…的影响年代-CMC呈剂量依赖性,分别为5、10、100 mg·kg−1属于年代-CMC被施用于小鼠。在次级过敏原攻击后6或72小时研究AHR和BAL细胞组合物。只有100毫克·kg−1属于年代-CMC可有效减少BAL液中的中性粒细胞数量6 第二次挑战后的h(图。 4a⇓b)。并行,只有100 mg·kg−1,年代-CMC能有效降低AHR,使PC显著增加200气道阻力的值。较低剂量年代-CMC(5、10和100 mg·kg−1)导致BAL液中嗜酸性粒细胞数量呈剂量依赖性减少,PC液中嗜酸性粒细胞数量呈剂量依赖性增加200继发性攻毒72小时后气道阻力值(图4c)⇓和d)。
组织学分析
在从先前描述的相同动物中除去的肺部进行监测他,PAS和抗MBP染色的组织学研究。在OVA敏化小鼠中,在次要攻击后72小时检测到泛刺激区域的细胞浸润(图5⇓).在次级攻击后,在血频攻击后6小时在血频攻击中观察到几种细胞,尽管在肺泡中观察到增加的中性粒细胞数量。在他染色的部分中,没有明显的差异年代在任何时间点观察- cmc处理和盐水处理的小鼠。
PAS染色部分显示次级攻击后的脚酚细胞增生和粘液大实生产72h(图6A-D⇓),但挑战后不是6小时(数据未显示)。下列的年代-CC治疗,与盐水处理的小鼠相比,PAS阳性细胞显着降低(图6⇓).
肺切片的抗MBP染色显示组织中嗜酸性粒细胞的定位 h在二次激发后,观察到支气管周围区域有大量嗜酸性粒细胞聚集(图。 7a-f⇓).MBP阳性细胞(嗜酸性粒细胞)的定量显示次要攻击后6小时小增加,但在血浆的区域中次级攻击后标记的72小时(图7G⇓).72 h的嗜酸性浸润明显减少年代cmc治疗。
BAL流体中的细胞因子水平
为了阐明S-CMC对气道过敏性炎症的作用机制,我们测定了BAL液中不同细胞因子的水平。如图所示 8.⇓继发变应原激发6小时后,与生理盐水激发相比,BAL液中T-helper (Th)-2细胞因子、IL-4、IL-5和IL-13水平显著升高。在二次攻毒72小时后,这些水平要低得多。继发性攻毒后IL-10水平升高,并在72 h时保持较高水平。年代-CMC治疗后72 h BAL液中IL-10水平进一步升高。继发性变应原刺激后IFN-γ和IL-12水平升高年代-CMC处理后72 h IL-12水平进一步升高。治疗年代-CMC将IL-5和IL-13的水平降低72小时。
培养细胞中细胞因子水平
收集肺,脾和PBLN细胞并在继发性卵胚攻击后从小鼠纯化。在盐水攻击后收集BAL肺泡巨噬细胞(如材料和方法中所述),测定培养细胞上楦中的细胞因子水平。用OVA培养时,肺细胞中IL-10的水平增加(图9A-C.⇓).来自脾脏和PBLN细胞的IL-10的水平,以及IL-5和IL-13的水平也显示出一些增加(数据未显示)。但是,这些增加的水平没有通过包含来改变年代-CMC在培养中。与此相反,培养的肺细胞中Th-1细胞因子IFN-γ和IL-12水平显著升高年代cmc治疗。在脾脏和PBLN细胞培养中未检测到这些细胞因子(数据未显示)。肺泡巨噬细胞的IFN-γ、IL-12和IL-10随细胞凋亡的增加而增加年代-CMC处理(图9d-f⇓).
讨论
年代-CMC被广泛用作粘液调节剂,因为它被认为可以通过改变其生化特性来提高粘液清除率21.年代-CMC已用于COPD的治疗方法。爱德华兹等等。9报道称,年代-CMC改善COPD患者的症状。年代-据报道,CMC对气道炎症有其他治疗作用。例如年代-CMC已被证明具有抗氧化作用22并改善了这一点2气体诱导的肺炎。年代-CMC可使大鼠气道粘膜黏液糖蛋白中黏液蛋白和唾液酸含量正常化,抑制MUC5AC蛋白表达水平的升高23.年代据报道,疾病抑制中性粒细胞迁移体内和体外24.石井等等。14显示,年代-CMC可能通过诱导磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C抑制中性粒细胞活性体外.在哮喘,年代-CMC已被证明具有改善粘合反射的粘合剂传输或抑制的疗效25,26.然而,还没有进行对照临床研究来确定年代-CMC对气道功能或气道炎症的疗效。
在本研究中,小鼠在继发变应原激发后出现两阶段气道炎症反应,一阶段为嗜中性,另一阶段为嗜酸性。在对二次刺激反应的两个阶段均检测到吸入MCh的AHR。在第一阶段,最后一次抗原激发6小时后,小鼠出现AHR和中性粒细胞为主的气道炎症反应,BAL液中嗜酸性粒细胞很少。年代-CMC给药改善AHR并减少了气道中的中性粒细胞数。在此阶段,只有更高剂量的剂量年代cmc似乎有效。在哮喘患者27,28在动物模型中15在美国,中性粒细胞已被证明是过敏原刺激后气道中的第一个炎症细胞。已知中性粒细胞会释放几种已知对气道有毒的化学介质。中性粒细胞内流高峰的时间与AHR的发展相吻合。中性粒细胞是否直接或间接地促进AHR的发展尚不清楚16,29. 因此,尽管年代-CMC治疗减少了中性粒细胞的积聚和AHR,目前这两个过程还不能确定地联系在一起。
72小时对抗原攻击的反应非常不同,其特征在于伴随AHR的发育伴随的嗜酸性粒细胞的数量显着增加。年代-CMC处理减少了嗜酸性粒细胞的数量,几乎消除了AHR,表明在这个较晚的时间点比6 h时更有效。72 h时,对年代-CMC显示出清晰的剂量依赖性。部分地,与6小时相比,72小时的这种效果较高,可能反映更长的持续时间年代cmc治疗。
小鼠支气管周围区域出现明显的细胞浸润72 与生理盐水激发的小鼠相比,第二次过敏原激发后的h。这种浸润比在6小时时观察到的更明显 h、 MBP抗体对肺切片的染色显示,在6岁时支气管周围区域有嗜酸性粒细胞聚集(高于对照组) h、 治疗年代-CMC对这种反应影响不大。当嗜酸性浸润到血糖加入区域和气道腔中突出72小时后,继发抗原攻击后,这种炎症细胞流入明显减少年代cmc治疗。由于气道中的嗜酸性粒细胞被认为有助于AHR的发展17,30,这减少了年代-CMC可能是气道功能正常化的原因。到目前为止,没有直接影响年代-CMC作用于嗜酸性粒细胞。
继发抗原攻击后6小时几乎不可检测的脚酚细胞增生,而脚螺纤维细胞增生和粘液大实生产在72小时上显着增加。在72小时,年代-CMC治疗可有效降低这种反应,这可能导致AHR的降低6.由于已经通过反应性氧物种显示了粘蛋白相关的基因MUC5AC表达,通过中性粒细胞弹性蛋白酶缩放31,年代-CMC可能通过这种机制调节粘液的产生,正如报道的SO2气体性肺部炎症23.
导致AHR、炎症和杯状细胞增生的许多反应是特定细胞因子水平变化的直接结果。当测定BAL液中的细胞因子水平时,检测到Th-2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13增加6 二次抗原激发后h。事实上,72 h这些水平显著降低。年代-CC治疗在6小时内改变这些细胞因子的水平几乎无效。年代-CMC在72℃时可有效降低细胞因子水平 此时IL-13的减少可能解释杯状细胞增生的减少32.当中性粒细胞在6小时占主导地位时,IL-5的水平最大程度地增加,但减少72小时(从700-200pg·mL−1),嗜酸性粒细胞在气道占主导地位。已知IL-5是一种有效的嗜酸性粒细胞诱导剂33,但IL-5可能有嗜酸性粒细胞诱导的时间滞后。当检查肺组织和BAL中嗜酸性粒细胞的时间关联时,肺部嗜酸性粒细胞累积在≥24小时的情况下15,如这里所示。
IFN-γ和IL-12水平在6和72℃时保持稳定 第二次激发后的h个时间点,和年代-CMC处理的小鼠。IL-10水平在6和72时升高 第二次激发后h,并随着时间的推移而进一步增加年代cmc治疗。
Th-2细胞因子,IL-4,IL-5和IL-13已与人类哮喘的过敏性嗜酸性气动通风炎症和AHR相关联29以及动物模型30.然而,IFN-γ可以抵消TH-2细胞因子活动34.IL-12已被证明可以降低AHR和嗜酸性炎症35.IL-10的功能更复杂。Makela.等等。36据报道,IL-10对于AHR的发展是必要的,而其他报道表明IL-10可以调节过敏原诱导的气道炎症37.IL-10和IL-12主要由单核细胞或巨噬细胞分泌。IL-10和IL-12被证明是由年代-CC治疗体外,年代-CMC可能调节巨噬细胞或单核细胞产生的细胞因子体内还有24.IL-10或IL-12水平升高如下年代-CMC治疗可能是有利的,可用于减少AHR和归一化气道功能,并且IFN-γ的增加可能更有益,因为IFN-γ被识别为气道中过敏性炎症的负调节剂38.
总之,施用MUCOREGULATOR年代-羧甲基半胱氨酸可使气道高反应正常化。在对继发变应原的两个不同反应阶段,气道中性粒细胞或嗜酸性粒细胞减少。年代-羧甲基半胱氨酸还调节支气管肺泡灌洗液细胞因子水平和杯状细胞增生。综上所述,在中性粒细胞和嗜酸性粒细胞占优势的阶段,对继发性过敏原激发的反应,年代-羧甲基半胱氨酸降低气道对吸入甲基胆碱的高反应性,表明其作为反复暴露于过敏原的哮喘患者的免疫/炎症反应调节剂的潜力。
- 收到了2004年7月30日。
- 接受2005年6月10日。
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