微生物热休克蛋白对气道炎症和高反应性的影响¹

热休克蛋白(hsp)^3.是一组高度保守的蛋白质，由原核和真核细胞产生，以应对各种环境压力(1，2，3.，4，5)．虽然hsp在不同物种间普遍存在且高度同源，但hsp是免疫应答的重要靶Ags。微生物热休克素已被证明是刺激T细胞和B细胞的重要免疫原(6)．近年来，人们已经清楚地认识到，hsp家族的成员，主要是hsp60和hsp70，是病原体中触发免疫反应的主要ag (7)．hsp是包括分枝杆菌在内的各种微生物的免疫显性抗原，是T细胞识别的共同目标(8)和增强T细胞的反应性(9，10，11)．特别是微生物热休克蛋白与th1型免疫反应的产生和诱导有关(12)，最近的研究表明分枝杆菌hsp65通过增加单因子的产生来诱导免疫刺激功能(13，14，15)．

过敏性哮喘是一种常见的慢性疾病，发病率越来越高，以气道高反应性(AHR)、气道炎症和血清IgE水平高为特征。在哮喘患者中，在支气管活检和支气管衬液中明显可见嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T细胞的活化和积聚(16，17，18，19)，并被认为是临床疾病表现的基础。因为CD4⁺在哮喘患者的气道中发现了产生IL-4、IL-5和IL-13的T细胞(Th2细胞)，由于Th2细胞因子是气道嗜酸性粒细胞增多和IgE合成所必需的，因此有人提出Th2细胞刺激炎症反应导致哮喘(20.)．

由于hsp给药与th1型免疫反应的产生有关，我们假设hsp可以作为一种免疫调节剂并影响过敏致敏的结果。在这项研究中，我们测试了五种不同的微生物hsp作为免疫调节剂在小鼠气道炎症和AHR模型中的功效。我们之前研究了过敏性AHR的小鼠模型，发现全身致敏和OVA反复气道挑战可导致th2型炎症反应，其中血清IgE和IgG1水平升高，AHR和嗜酸性气道炎症与支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-4和IL-5的升高有关。我们使用这个模型来研究hsp对气道反应性、肺部炎症和气道中局部细胞因子产生的影响。

雌性BALB/c小鼠，8-12周龄，无病原体，来自Jackson实验室(Bar Harbor, ME)。小鼠保持无ova饮食。本研究中使用的所有实验动物都遵循国家犹太医学和研究中心动物护理和使用委员会批准的协议。

对接受以下治疗的小鼠进行了研究:1)在非致敏动物(雾化(Neb))中，仅使用OVA进行气道挑战;2) OVA致敏和OVA气道挑战(IPN)。用20 μg OVA (V级;西格玛-奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州)悬浮在2.25毫克氢氧化铝(Alum Imuject;Pierce, Rockford, IL)在第1天和第14天的总剂量为100 μl。在第24、25和26天，用超声波喷雾器(DeVilbiss Health Care, Somerset, PA)通过气道雾化OVA(含1% PBS)刺激小鼠20分钟。

rHsp从StressGen生物技术公司(Victoria, Canada)获得。本研究使用了来自不同微生物的五种微生物rhsp (麻风杆菌，链球菌引起的肺炎，幽门螺杆菌、芽孢杆菌Calmette-Guérin(卡介苗)和结核分枝杆菌)．纯化的rhsp含有<50个ELISA单位的内毒素/mg蛋白。在致敏或攻毒前2 h，分别于第1、14、24天以100 μl PBS溶解的100 μg hsp ip注射给药。除特别说明外，每个hsp的剂量为100 μg。作为对照，小鼠服用PBS。第28天评估气道功能，处死小鼠获取组织和细胞用于进一步检测。在每个实验中，每组由四只老鼠组成。所有实验至少重复两次。

小鼠经尾静脉注射200 μg抗TCR-δ (GL3)的仓鼠单抗，以耗尽γ/δ T淋巴细胞。21)．对照组小鼠注射仓鼠IgG。注射后1天，小鼠呈敏化状态，分别给药100 μg麻风杆菌HSP遵循上述协议。

气道反应性评估采用两种方法，一种是采用单室全身体积描记术(Buxco Electronics, Sharon, CT)，如前所述(22)．本研究采用增强暂停(Penh)作为气道反应性指标。在体积描记术中，将小鼠暴露于雾化的PBS中2分钟，然后使用AeroSonic超声雾化器(DeVilbiss)增加雾化的甲基胆碱(MCh)浓度(PBS中3-50 mg/ml) (Sigma-Aldrich)。每次雾化后，记录3分钟。在每个3分钟序列中测量的Penh值取平均值，并将每个MCh浓度表示为PBS暴露后测量的基线Penh值的百分比。基线(PBS) Penh在任何治疗组中均无显著差异。基线Penh值为0.6±0.2(平均值±SEM)。

气道阻力(R_l)和动态顺应性(Cdyn)被确定为雾化MCh刺激后气道功能的变化。小鼠用戊巴比妥钠(90 mg/kg)麻醉，气管切开，机械通气，以160次呼吸/分钟的速率，保持恒定的潮气量(0.2 ml)。肺功能评估如前所述(23)．气管造口管(不锈钢套管，18G)连接四向连接器，其中两个端口连接两个呼吸机的吸气侧和呼气侧。通气速率为160次/min，潮气量为150 μl，呼气末正压为2 ~ 3 cm H₂O由呼吸机输送(型号SN-480-7-3;Shinano Manufacturing，东京，日本)。吸入MCh 8次，呼吸速率60次/分钟，潮气量500 μl，采用第二呼吸机(683型;哈佛仪器，南纳蒂克，马萨诸塞州)，增加浓度(1.56,3.125,6.25，和12.5毫克/毫升)。每次MCh攻位后，连续收集数据1-5分钟，R_l取Cdyn的最小值来表示这些功能参数的变化。

评估气道反应性后，经气管插管用HBSS (1 × 1 ml, 37°C)灌洗肺部。采用细胞计数仪(Coulter counter;Coulter, Hialeah, FL)。细胞旋切片用Leukostat (Fisher Diagnostics, Pittsburgh, PA)染色，并在1000倍放大的浸泡油下盲法计数200个细胞进行分化。采用ELISA法测定BALF上清液中的细胞因子水平，如前所述(24)．使用OptEIA试剂盒(BD PharMingen, San Diego, CA)，按照制造商的方案进行IL-10和IFN-γ的测量。IL-4和IL-5的检出限为4 pg/ml, IL-10和IFN-γ的检出限为10 pg/ml。

如前所述，用ELISA法测定血清中总IgE水平和ova特异性IgE、IgG1和IgG2a Ab水平。（25)．简单地说，用5 μg/ml OVA包被Immulon-2板。加入血清样本后，生物素化抗ige Ab (02122D;以BD PharMingen)检测Ab，用亲和素- hrp (Sigma-Aldrich)扩增反应。检测碱性磷酸酶标记的抗体(02003 E和02013 E;使用BD pharingen)。样本的ova特异性Ab滴度与内部混合标准有关，随机分配为500个ELISA单位。总IgE水平通过与已知小鼠IgE标准(55 3481;BD PharMingen)。IgE检出限为100 pg/ml。

如前所述，纯化支气管周围淋巴结(PBLN)细胞(26)．细胞按4 × 10镀⁵/ml于96孔圆底组织培养板中，一式三份，分别与培养基或OVA (100 μg/ml)在5% CO的潮湿气氛中孵育48小时₂在37°C。收集无细胞上清液，在−20°C保存，等待细胞因子ELISA。

在获得BALF后，用2ml 10%福尔马林经气管充气肺，然后浸泡固定在相同的溶液中。将5 μm厚的组织切片贴在载玻片上脱蜡。切片用周期性酸性希夫(PAS)染色以鉴定含黏液细胞，并在光镜下检查。嗜酸性粒细胞用兔抗小鼠嗜酸性主要碱性蛋白(MBP) Ab(由J. J. Lee, Mayo诊所，Scottsdale, AZ提供)免疫组化鉴定，如先前所述(26)．用配备荧光素过滤系统的尼康显微镜(尼康，花园城，纽约)以盲法检查载玻片。

用方差分析来确定各组间的差异水平。各组比较采用Tukey-Kramer诚实显著性差异检验;p显著性值设为0.05。所有测量值均以平均值±SEM表示。

为了评估hsp治疗对全身致敏和OVA气道挑战后AHR发展的影响，我们通过全身气压容积描记术测量了体内气道对雾化MCh的反应性。无花果。1说明，与对照小鼠相比，经OVA致敏和挑战并以PBS i.p.治疗的小鼠(对照)对吸入MCh的Penh反应呈显著的剂量依赖性增加。用麻风杆菌与PBS处理的小鼠相比，hsp显著降低Penh (p< 0.05)。与此相反，其他hsp对AHR的发展没有表现出显著的抑制作用，即使剂量达到200 μg。增加或减少剂量麻风杆菌hsp(200、50或10 μg)在预防AHR发展方面表现出剂量依赖效应(图2)。2一个)．致敏和气道挑战后AHR的发展不受影响麻风杆菌HSP仅在致敏前或气道挑战前使用(数据未显示)。

嗜酸性气道炎症是过敏原诱导气道致敏和挑战的重要结果。为了确定微生物热休克蛋白对过敏致敏和挑战后炎症反应的影响，评估了BALF的细胞含量。用OVA致敏和刺激小鼠出现明显的气道炎症，以嗜酸性粒细胞为主。对照组小鼠仅接受3天的OVA气溶胶刺激，BALF中几乎没有嗜酸性粒细胞。管理麻风杆菌增敏和攻毒前的hsp抑制了BALF中嗜酸性粒细胞数量的增加(图2)。3.)．另一种微生物热休克蛋白对肺内嗜酸性粒细胞的积聚没有明显的抑制作用。改变剂量麻风杆菌hsp(200、50或10 μg)对BALF嗜酸性粒细胞数量有剂量依赖性影响(图2)。2B)．除卡介苗热sp处理的小鼠外，用热sp处理的小鼠明显表现为(p< 0.05)的巨噬细胞数量高于未处理的致敏小鼠和攻毒小鼠。当麻风杆菌在致敏前或气道挑战前单独给药hsp，与pbs处理、致敏和挑战小鼠相比，对嗜酸性粒细胞数量没有影响(数据未显示)。

在BALF检查的同时，还检查了肺组织。通过抗mbp染色组织的组织学检查，进一步研究嗜酸性粒细胞浸润的证据和微生物hsp的作用(图2)。4)．在单独刺激的小鼠中，在支气管周围和血管周围组织中检测到很少的嗜酸性粒细胞(图2)。4，一个)．相反，致敏和随后的气道挑战导致支气管周围和血管周围嗜酸性粒细胞数量显著增加。4，B)．治疗麻风杆菌hsp消除了支气管周围和血管周围区域嗜酸性粒细胞的积聚(图。4C)．另一种hsp没有显著改变嗜酸性粒细胞浸润(数据未显示)。

T细胞产生的Th2细胞因子在过敏性气道炎症和AHR的诱导中起关键的调节作用。为了评估微生物热休克剂在预防诱导Th2反应中的作用，我们在BALF中最后一次OVA挑战48小时后测量了IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的浓度。如图所示。5，致敏和挑战导致IL-4和IL-5升高，显著降低(pIL-10和IFN-γ水平均< 0.05)。麻风杆菌HSP治疗致敏/攻毒小鼠显著(p与未处理的小鼠(IPN组)相比，< 0.05)BALF中IL-4和IL-5水平降低(图;5)．相比之下,麻风杆菌与IPN组相比，hsp处理明显提高了BALF中IFN-γ和IL-10的水平。治疗组和未治疗组在其他hsp方面无显著差异(数据未显示)。

为了监测局部细胞因子的产生，从pbln中分离的单个核细胞被培养并用OVA刺激。ELISA法检测培养上清液中IL-4和IL-5的浓度。致敏和随后的OVA气道挑战导致培养中PBLN细胞IL-4和IL-5的产生增加(图2)。6)．PBLN细胞处理小鼠麻风杆菌与未处理的小鼠相比，hsp在ova刺激的培养中IL-4和IL-5的产生显著降低。

最后一次通气后48小时测定血清ova特异性IgE和总IgE水平。与单独刺激小鼠相比，OVA致敏和刺激导致血清中OVA特异性IgE和总IgE水平显著升高(p< 0.05)。给药100 μg麻风杆菌与未处理的对照组相比，hsp降低了ova特异性IgE血清(而不是总IgE)水平(图2)。7)．在使用另一种hsp治疗后，没有观察到这种影响。增加了麻风杆菌hsp剂量(200 μg/针)未进一步降低ova特异性IgE水平(数据未显示)。

用PAS对肺切片进行染色，以确定气道上皮中含有黏液的细胞。在致敏小鼠和攻毒小鼠中，与单独攻毒小鼠相比，发现大量黏液染色呈阳性的细胞。8，一个而且B)．治疗麻风杆菌hsp抑制杯状细胞增生和粘蛋白增生(图;8C)，而使用其他HSP治疗后没有发现这种差异(数据未显示)。

热休克蛋白可激活γ/δ T细胞(27)和γ/δ T细胞是气道反应性的负调节因子(21)．目的:探讨γ/δ T淋巴细胞在治疗效果调节中的作用麻风杆菌我们在致敏前1天通过注射TCR-δ mAb减少γ/δ T淋巴细胞。在最后一次气道挑战48小时后，使用全身体积描记术测量麻醉、气管切开和通气动物对MCh的气道反应性。基线R无显著差异_l和不同组之间的Cdyn值。注射Ab，然后致敏和攻毒的小鼠对吸入MCh的气道反应程度与单独致敏和攻毒的小鼠相同(图2)。9)．100 μg处理麻风杆菌hsp抑制了R_l以及整个MCh剂量-反应曲线中Cdyn的减少，结果与监测Penh的结果相似(图2)。1而且2)．然而,麻风杆菌-接受抗-δ Ab治疗的小鼠产生了与敏化和攻毒小鼠(接受对照仓鼠IgG)相同程度的AHR(图2)。9)．抗-δ治疗后，BAL嗜酸性粒细胞数量和细胞因子水平保持不变(数据未显示)。

在这项研究中，我们证明了这一点麻风杆菌在过敏性气道炎症小鼠模型中，hsp可有效预防AHR和气道炎症的发展。此外，与其他四种微生物hsp相比，对气道功能、炎症和细胞因子产生的影响仅限于用麻风杆菌hsp。麻风杆菌对致敏小鼠和攻毒小鼠给予hsp可导致嗜酸性炎症、Th2细胞因子产生、ag特异性IgE、杯状细胞增生和气道功能正常化的降低。

在特定类型的炎症中，包括关节炎和严重哮喘(28)，便会产生应力反应，从而产生热休克蛋白(2)．细胞因子可刺激T淋巴细胞产生hsp70 (5)、花生四烯酸和PGA₁激活热休克转录因子(29，30.，31)．热休克蛋白的产生可能保护细胞免受应激的不利影响(1，32)．可能与哮喘相关的是，过敏原诱导的炎症可能导致气道上皮的应激诱导(33)，而肺泡巨噬细胞吞噬嗜酸性粒细胞引发热休克蛋白合成(34)．最近，研究发现hsp70在支气管哮喘患者中表达上调(35)．在这项研究中，我们证明了小鼠的治疗麻风杆菌致敏前hsp和气道过敏原挑战显著抑制AHR的发生。此外，肺组织和气道的嗜酸性粒细胞增多在治疗后得到了预防麻风杆菌热休克蛋白，但不是和另一个热休克蛋白。这些发现表明，尽管它们在氨基酸序列(36)、微生物热休克菌的免疫特性不同。

T细胞在过敏性哮喘中起着关键作用，因为一旦识别过敏原，它们就能够释放大量的th2型细胞因子，包括IL-4和IL-13，这是IgE产生和杯状细胞增生所必需的，以及IL-5，这是组织嗜酸性粒细胞增多所必需的(37)．T细胞被激活(17，19，38，39)表达IL-4、IL-5 (40)、IL-4和IL-5是由Th细胞的一个亚型产生的(41)，主要用于治疗慢性哮喘(42，43)．由于过敏性哮喘被认为是由Th2细胞调节的，干扰这一免疫反应可能是一种有吸引力的干预模式。44，45)．能够识别热休克蛋白的T细胞是在皮肤或肠道微生物群的自然建立过程中诱导产生的，并且能够识别保守的表位，如热休克蛋白。这些对hsp的反应在对新Ags的免疫发展开始之前提供了对感染因子的初始防御(46)．我们证明了麻风杆菌hsp治疗改变了致敏小鼠在过敏原挑战后的局部细胞因子谱，减少了IL-5的产生，增加了BALF中IL-10和IFN-γ的水平。这些结果在体外培养ova刺激的PBLN单核细胞中得到证实。这些细胞因子作用的下游是特定的后果，包括BALF和肺组织中嗜酸性粒细胞数量的减少，以及血清ag特异性IgE水平的降低;上皮染色证实，致敏小鼠的杯状细胞增生和粘蛋白增生被消除。这些发现与微生物热休克蛋白与th1型免疫反应的产生和诱导相关的报道相一致(12)并诱导CD4细胞th1样活性⁺麻风病患者和健康个体的T细胞(47)．

中介活动的一种可能机制麻风杆菌hsp涉及γ/δ T细胞。分枝杆菌刺激γ/δ T细胞，特别是分枝杆菌hsp65 (48)．出生等人(49)表明，γ/δ T细胞可以特异性地对同一区域的小合成肽作出反应麻风杆菌体外和体内热休克蛋白(50)．γ/δ T细胞已被证明负向调节气道反应性(21)．因此，一种可能是管理麻风杆菌hsp可激活γ/δ T细胞，导致AHR的下调或预防。为了研究这一假设，我们在hsp给药和致敏前使用了抗-δ单抗。该Ab已被证明能耗尽γ/δ T细胞(21)，并在本研究中得到证实。事实上，注射这种Ab几乎消除了的影响麻风杆菌hsp对AHR的影响，提示γ/δ T细胞在介导的影响中起着非常关键的作用麻风杆菌在这个模型中，如前所述。如前所述(21)，由于嗜酸性粒细胞数量和细胞因子水平保持不变，该Ab的作用不是通过改变肺部炎症来介导的。

其他类型的细胞，如树突细胞，也可能在神经元的活动中发挥作用麻风杆菌hsp。最近，Todryk et al. (51)表明，诱导hsp表达诱导T细胞、巨噬细胞和主要的树突状细胞浸润到肿瘤中，Th1细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-12)的表达，并通过T细胞介导的机制增强免疫原性。他们还证明，hsp靶向不成熟的APC，使它们更有能力捕获Ags，并触发Th1反应。

致敏和挑战通常会导致BALF IL-10水平下降，这是一种与抗过敏和抗炎活性相关的细胞因子。麻风杆菌hsp导致致敏小鼠和挑战小鼠IL-10水平升高。这样的数据表明之间的交叉反应麻风杆菌hsp和宿主hsp可能激活调节性T细胞释放重要的调节性细胞因子如IL-10，因此IL-10的增加可能在下调Th2细胞因子的产生中起作用(52)．腹腔给药麻风杆菌HSP产生的调节机制降低了淋巴结中负责过敏性气道炎症诱导的细胞的活性(52)．在体外观察PBLN细胞培养中细胞因子的产生支持了这一观点麻风杆菌其中ova刺激的IL-4和IL-5的产生被抑制。

目前尚不清楚，但有些令人惊讶的是，对气道反应性、炎症和细胞因子产生的显著调节作用如此有限麻风杆菌hsp。简单的解释如内毒素含量的差异被排除，因为内毒素含量在各种热休克蛋白之间没有差异(数据未显示)。尽管有大量的同源性，麻风杆菌已经描述了hsp65特异性表位，这些表位可与类似序列区分，例如与65-kDa的表位结核分枝杆菌蛋白(53)．这些独特的序列是否作为T细胞刺激序列，在过敏原诱导的模型中给予保护，仍有待确定。虽然卡介苗热激菌在我们的模型中通常不有效，但感染减毒的形式牛分枝杆菌在类似的ova诱导的气道嗜酸性粒细胞增多、局部IL-5产生和AHR模型中，卡介苗是一种有效的抑制剂，提示通过增加IFN-γ产生(54，55)．BCG hsp和BCG感染/免疫之间的这些差异可能反映了分枝杆菌DNA (CpG寡核苷酸或免疫刺激序列)在触发Th1反应和预防肺部炎症和AHR方面的效力(56，57)．

总之,麻风杆菌hsp对小鼠气道炎症和AHR模型的炎症调节非常有效。用麻风杆菌hsp时，小鼠未出现过敏原诱导的Th2反应、肺嗜酸性粒细胞增多和AHR。的活动麻风杆菌hsp对AHR降低的影响，至少部分是通过γ/δ T细胞介导的。本研究结果表明，热休克剂可以改善过敏原致敏和挑战后过敏原诱导的气道炎症和高反应性。

我们感谢Diana Nabighian和Lynn M. Cunningham提供的技术援助。