摘要
慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加剧的主要特点是支气管树中活化中性粒细胞的积累。这种现象可以通过增加的迁移和/或由于抑制自发细胞凋亡而通过延长的存活来解释。本研究的目的是评估COPD患者外周血中性粒细胞的凋亡行为在急性加剧期间。
包括急性加重和10名健康志愿者的三十六名住院患患者。在3-5天和放电后,在入院时获得血液样品。基于培养18小时后,基于膜蛋白V-PE结合和核形态测量分离中性粒细胞的自发凋亡。
入院时,COPD患者的自发凋亡率明显低于健康志愿者(平均±sd 31±13%)与44±18%)。入院时中性粒细胞凋亡百分率为31±13%,3-5 d后为39±15%,出院时为47±18%。第一天和出院时的自发凋亡率有统计学差异。在本研究中,一秒用力呼气量<35%、吸烟习惯、皮质类固醇治疗或细菌感染证据均未显示对自发凋亡有任何影响。
总之,在慢性阻塞性肺病的急性加剧期间,中性粒细胞粒细胞显示出在治疗和临床缓解后逐渐增加的自发细胞凋亡。这提出了中性粒细胞凋亡在慢性阻塞性肺病的发育和解决方案中的中性粒细胞凋亡的重要性问题。
M.W.R.Pletz由德国研究基金会支持。M. ioanas是Paul-Ehrlich-Gesellschaft 2002的研究员。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重的发病机制尚不完全理解。病毒和细菌感染和气道炎症是导致组织损伤和渐进式支气管阻塞的事件周期的主要贡献者1.
在COPD患者的支气管肺泡灌洗(BAL)中,激活的中性粒细胞大量积聚在支气管树中是常见于稳定状态和加重状态2.这种现象可以通过两种机制解释:1)增加中性粒细胞迁移;和/或2)由于抑制自发性细胞凋亡,延长的存活率3..在炎症消退过程中,中性粒细胞通过自发凋亡从炎症部位被清除,导致巨噬细胞识别和吞噬4.任何对中性粒细胞凋亡的显著抑制都可能导致中性粒细胞过度积聚和对健康组织的损害5.这一概念得到了一些研究的支持,这些研究显示,急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者的血液和/或BAL中性粒细胞凋亡均减少。6和肺炎7.
对各种类型细胞的细胞凋亡的放松抑制似乎在发病机制和COPD的进展中具有重要作用。增加血清水平的可溶性Fas受体,这是凋亡的抑制剂8,已与严重的COPD相关联9.然而,在COPD的急性加剧期间,关于中性粒细胞的凋亡特征少知之甚少。
由于中性粒细胞是COPD的急性炎症细胞,因此预期在恶化期间的外周血中性粒细胞的自发细胞凋亡。
患者和方法
研究科目
36名根据GOLD标准诊断为COPD的住院患者2并表现为急性加重。急性加重是由下列任何一种标准组合定义的:呼吸困难加重,痰量增加和痰脓性增加。有新的放射浸润、已知的HIV感染、支气管扩张或肿瘤的证据和/或免疫抑制治疗的患者被排除在外。急性加重的治疗包括吸入支气管扩张剂和全身皮质类固醇(强的松龙75 mgI.v.每日3天,随后口服治疗2周),低氧血症时使用氧气,脓痰和/或痰中有微生物生长迹象时使用抗生素(β‐内酰胺/β‐内酰胺酶抑制剂联合或氟喹诺酮类药物)。
为了确保凋亡过程的参考数字,非匹配组的10名健康、不吸烟的医务人员志愿者也进行了调查。除个别病例口服避孕药外,本组受试者未服用任何药物。该研究得到了Freie Universität Berlin (Berlin, Germany)伦理委员会的批准,并获得了所有患者和志愿者的书面知情同意。
研究设计
为了研究COPD患者急性加重期间外周血中性粒细胞的凋亡行为,一项为期18个月的前瞻性研究在柏林Heckeshorn胸科医院(德国)进行。
在3-5天和放电后(通常在14天后)后,在入院时研究所有患者。从患者图表中收集了人口统计和临床数据,吸烟习惯,肺功能测试和微生物研究结果。在短短14天的住院住院的情况下,预定了一场守护的访问。在每次访问时,获得静脉肝素血液样品(20mL)并立即在实验室中加工。在三次访问之间比较培养18小时后的凋亡中性粒细胞的比例。
此外,作者调查了临床参数和入院时中性粒细胞凋亡行为之间是否存在相关性。因此,根据1秒用力呼气量(FEV)对COPD患者进行分组1),在这些组之间比较细菌感染,体重指数(BMI)和自发细胞凋亡率的确认。
对健康志愿者在不同的时间连续采集三份血样。分析中使用了三个测量值的平均值。
方法
中性粒细胞容易自发凋亡体内和在体外.对于每个血样,检测2次凋亡中性粒细胞:取血样后立即(基线凋亡)和培养18 h后。自发凋亡率为培养18 h后检测到的自发凋亡中性粒细胞的比例减去基线值,考虑进一步分析。使用了两种不同的方法:1)流式细胞术测量Annexin V‐PE/7‐AAD染色的细胞,2)光镜下评估核形态。
中性粒细胞分离及培养
加入10 mL 6%葡聚糖,沉淀1小时(37℃)后,使用Ficoll (Biochrom KG, Berlin, Germany)密度梯度离心从血液样本中分离中性粒细胞,然后低渗红细胞裂解。细胞被洗涤并以1×10的浓度重悬6细胞·ml.−1在pH=7.4的RMPI培养基中加入2.8 g·L−1消息灵通的,1 g·L−1NaHCO3.10%胎牛血清。在37°C, 5%二氧化碳(CO .),培养18 h后检测细胞的自发凋亡2)和90%的相对湿度。
流式细胞术
用Annexin V‐PE凋亡检测试剂盒I (PharMingen;Becton Dickinson,海德堡,德国),根据制造商的协议。简单地说,细胞在结合缓冲液(0.1 M HEPES/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl)中洗涤和离心2),将微球重悬于5µL Annexin V‐PE、5µL 7 AAD(7‐氨基放线菌素D)和100µL结合缓冲液中,室温黑暗孵育15 min。采用三色流式细胞仪(FACScan;Becton-Dickinson)使用CellQuest软件。预先确定的计数10,000粒白血球被设定在向前光散射。在FL‐2和FL‐3的7‐AAD中测量了Annexin V‐PE。只有细胞膜完整的细胞,即。7‐AAD(-)和Annexin V‐PE(+)被认为是凋亡的。
光学显微镜
从RMPI‐悬浮中性粒细胞制备细胞旋片,并用Pappenheim (Sigma, Taufkirchen, Germany)溶液染色。光镜下计数200个细胞并进行形态学观察。凋亡的中性粒细胞具有单叶或完全破碎的细胞核,核染色强烈,提示染色质凝结6.
统计数据
样本量主观设定在30 - 40之间,因为没有可用的参考数据可以进行统计估计。自发凋亡率表达于Annexin V‐PE(+)、7‐AAD(-)细胞百分比(通过流式细胞术测量)和凋亡中性粒细胞百分比(凋亡neutrophils×100/总中性粒细胞)(通过光镜计数(核形态))。数据的参数分布通过小样本(n≤50)的Shapiro-Wilk检验得到证实。用皮尔逊系数评价两种测量方法之间的相关性。使用配对t试验对比每次到访时的自发凋亡率。采用重复测量的方差分析进行多组比较。
此外,根据临床参数对COPD患者进行分组,并使用非配对t检验比较各组之间以及COPD患者与健康志愿者之间的入院时自发凋亡率。结果以百分比和平均值±sd表示。p‐值<0.05被认为是显著的。
结果
人口统计数据
在研究中注册了三十六个患有急性加重的COPD患者。人口统计特征如表1所示⇓.此外,对10名不匹配的、健康的、不吸烟的医务人员志愿者(4名男性,6名女性)进行了分析。
COPD患者在急性加重和健康志愿者中的自发细胞凋亡率
在入院COPD患者入院急性切除患者中的自发性嗜中性粒细胞凋亡,3-5天和放电(第14天±2天)显示增加值(图4⇓)对于独立方法,流式细胞术和光学显微镜。表2列出了COPD患者和健康志愿者的诱发凋亡率⇓.统计分析显示,COPD患者入院至第3-5天(p=0.006)和入院至出院(p<0.0001)之间的自发凋亡率差异有统计学意义。三个时间点之间的差异也通过重复测量方差分析的多组比较得到证实(λ=0.357, p<0.0001)。与COPD患者相比,非匹配健康志愿者的自发凋亡率明显高于入院时的值(43.9与31.2%,p = 0.01),但与放电时获得的值相比,没有显着差异(图4⇓).
慢性阻塞性肺病患者自发中性粒细胞凋亡与临床参数的相关性研究
将COPD患者按临床参数分组,比较各组入院时诱导凋亡率。两组患者FEV无差异1<35%在入学时预测(FEV1<35%31.5±13.7与FEV1> 35%32.6±11.8,p = 0.8),BMI <20(BMI <20 34.2±13.0与BMI >20 31.2±12.0,p=0.6),痰培养阳性(阳性34±12.1)与阴性25.6±9.3,p=0.06)、吸烟习惯(目前吸烟者33.9±13.5)与前吸烟者和非吸烟者(30.8±12.3,p=0.5)和入院时接受皮质类固醇治疗(吸入30.9±10.7)与口语30.7±13.5,p = 0.9)。
在一小组(n=8) COPD患者(入院时、3-5天后和出院时)(n=4)和健康志愿者(n=4)中,也采用ELISA技术测定了血清白介素(IL)‐6和IL‐8水平。在急性加重过程中,IL - 6和IL - 8水平没有观察到统计学差异。同样,COPD患者和健康志愿者之间也没有差异(数据未显示)。
讨论
本研究发现慢性阻塞性肺病急性加重住院患者外周血中性粒细胞自发凋亡减少。自发凋亡率在恢复过程中呈进行性增加。
在测量细胞凋亡的这种性质的研究中,必须使用至少两种独立的方法来测定用于编程的细胞死亡10..凋亡的主要特征是磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内层向外层重新分布,染色质的凝聚和碎裂11..前者可以通过标记的Annexin V结合来评估,后者可以通过核染色来评估。因此,目前对细胞凋亡的评估是基于流式细胞术测量Annexin V‐PE/7‐AAD‐标记的中性粒细胞和光镜检测细胞核的形态学变化。与染色质凝结和断裂引起的核形态变化相反,磷脂酰丝氨酸的外化是细胞凋亡的早期特征。因此,通过Annexin V‐PE/7‐AAD染色检测的凋亡率高于通过评估细胞核形态得到的凋亡率。但是,本研究中两种方法之间存在显著的相关性,两种方法得到的结果相似。
COPD患者肺中聚集的主要细胞是中性粒细胞,这可能与对凋亡的抵抗有关3.,12..然而,关于外周血中性粒细胞室的资料并不多。目前的作者假设,COPD急性加重时外周血中性粒细胞也应呈现特定的凋亡模式。这一假设得到了以下证据的支持:1)COPD是一种具有系统性影响的炎性肺疾病13.;2)细胞因子和其他抑制中性粒细胞凋亡的信号因子,例如可溶性Fas8和IL 614.,具有可检测的水平在COPD患者的血清和血浆中9,15..Yasudaet al。9血浆中可溶性Fas、IL - 6和肿瘤坏死因子α浓度的增加是COPD进展的独立危险因素,并与疾病的严重程度相关。然而,可溶性fas对嗜中性粒细胞凋亡的抑制作用尚未得到证实。
在最近的一项研究中,Turlejet al。16.发现肺泡中性粒细胞对肺泡凋亡的抵抗力增强;起伏被认为是慢性阻塞性肺病或哮喘的动物模型10..作者未检测到外周血中性粒细胞对凋亡的抗性有显著差异。这可能是由于样本量小(6人健康)与6 heaves-affected马)。然而,在ARDS中已经报道了局部和外周血中性粒细胞自发凋亡的减少6,严重炎症反应综合征17.和肺炎7.
在这项研究中,与排出时间相比,COPD患者在COPD患者中有显着降低的嗜中性粒细胞凋亡。几个因素可以影响COPD患者中嗜中性粒细胞的凋亡行为。吸烟是COPD和COPD相关死亡率的最重要的风险因素2.这已经被证明了在体外尼古丁通过抑制细胞凋亡,以剂量依赖性方式延长中性粒细胞存活18..然而,在本研究的人群中,没有发现吸烟习惯与中性粒细胞凋亡之间存在明显的相关性。这可能是因为尼古丁具有较短的血浆半衰期,而且患者要么是非/前吸烟者,要么是目前已停止吸烟的患者,与急性加重有关,因此尼古丁对中性粒细胞没有立即的影响。
皮质激素也可能影响细胞凋亡。在一些稳定状态或急性加重期的COPD患者中,皮质类固醇治疗表现出有益的抗炎作用2.虽然在体外数据提示高剂量皮质激素可抑制中性粒细胞凋亡19.,很可能,体内,通过抑制各种炎症细胞因子的抗凋亡作用,抑制了这一机制。这可以解释在本研究中,尽管在住院期间给予静脉和口服糖皮质激素,但患者的细胞凋亡率不断增加的悖论。由于大多数中度或重度COPD患者依赖类固醇,因此不可能排除住院前类固醇治疗的患者。
在本研究中的人口中,所有患者的36%(包括没有咳痰或没有有效的痰样品),所述痰中的微生物生长(九革兰阴性和六克阳性病原体)。微生物感染可能是与下嗜中性粒细胞凋亡降低相关的理论相关。在体外研究表明,脂多糖给药可使大鼠中性粒细胞大量活化并减少细胞凋亡20..常见的呼吸道病原体,例如金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在囊性纤维化患者的细胞培养中,也发现能促进中性粒细胞存活21..然而,有微生物生长的患者与无微生物生长的患者在细胞凋亡水平上没有差异。这一观察结果可能是由于患者没有出现菌血症,因此没有微生物或内毒素血症的直接影响,就像在在体外学习。
本研究的一个局限性是缺乏对影响细胞凋亡的细胞因子的深入研究,如IL - 6或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。在一小组受试者中测量了两种抗凋亡细胞因子的血清水平,但在患者和健康志愿者之间没有发现可检测的差异。因此,这些测量没有继续进行。
值得注意的是体内与...相比,调查结果可以很大差异在体外观察。这种差异可以解释为,体内,中性粒细胞在动态条件下同时暴露于几个抗凋亡因子,而在动态条件下在体外研究本质上局限于少量的静态干预6.
在疾病过程中发生外周血中性粒细胞的自发性凋亡和随后的恢复表明中性粒细胞的凋亡与加剧过程有关,因此可能是这种复杂疾病中的一种病原特征尚未解决。可能提出了许多论据以考虑这些发现:抑制在加剧的发作中的嗜中性粒细胞凋亡可能支持宿主在混淆相关感染时,加剧结束时对细胞凋亡的抗性降低可能是解决方案的一部分炎症或本研究中的观察结果可以简单地反映局部释放的炎症参数的全身效果。目前的发现被两种独立方法明确证实,但不能与加剧刺激因素相关,例如微生物生长或吸烟习惯。这提出了关于进一步研究的问题,用于解决慢性阻塞性肺病的恶化期间中性粒细胞减少自发性细胞凋亡的致病性重要性和原因。
致谢
作者谨此感谢M. Rau和G. Schreiber进行专家技术援助,而P.J.Halvey和L.Mcgee致命阅读稿件。
脚注
↵作者对这篇论文贡献相同。
- 收到了2003年7月31日。
- 接受2003年11月24日。
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