摘要
遗传改变,例如杂合子(LOH)或微卫星不稳定性(MI)的损失,均已涉及恶性和良性疾病。为了鉴定抗氧核糖核酸(DNA)在哮喘中的突变的突变,在痰细胞中研究了MI和LOH。
从22例中度哮喘患者的痰和血细胞中提取DNA。利用染色体5q, 6p, 11q, 14q上的18个多态标记对细胞进行MI和LOH分析。对6名健康受试者也进行了微卫星分析。
没有一个健康的个体表现出任何遗传变异。22例哮喘患者中有16例(73%)发现基因改变。总共有12例(54.5%)患者仅表现出LOH, 1例(4.5%)患者仅表现出MI, 3例同时表现出MI和LOH。LOH和MI在14q染色体上发病率最高。平均免疫球蛋白E和血液嗜酸性粒细胞水平在有三种或三种以上基因改变的哮喘患者中显著升高。
在哮喘患者中发现了痰液细胞的脱氧核酸中遗传改变的高发生率。需要进一步的研究来确定杂合性和微卫星不稳定性丧失的作用在调查哮喘遗传易感性中,因此在其发病机制中。
哮喘是气道的慢性炎症疾病,其中许多细胞类型发挥作用,特别是肥大细胞,嗜酸性粒细胞,T淋巴细胞,中性粒细胞和上皮细胞1.除了炎症,哮喘患者的气道壁的特点是许多结构改变,导致严重的情况下异常的“重塑”和永久性的气道口径减少2- - - - - -6.哮喘的遗传已被证明是复杂的,其特征在于多基因遗传和遗传异质性7.最近,已经显而易见的是,基因组的染色体5Q,6p,11q和14q的几个区域可能含有哮喘的易感基因8- - - - - -13.这些区域包含以下基因:1)辅助T细胞2型细胞因子(白介素(IL)-4, IL-5, IL-9);2)主要组织相容性复合体分子和肿瘤坏死因子α;3)高亲和性免疫球蛋白E (IgE) β链(FcεRIβ);4)参与炎症过程的T细胞受体5,6,14,15.编码在这些部位的介质或受体与过敏和支气管高反应有关,导致IgE水平升高和嗜酸性粒细胞计数升高5- - - - - -9,14.最近,努力集中在映射这些染色体区域并评估这些基因在哮喘发病机制中的作用。
脱氧核糖核酸(DNA)微卫星是高度多态标记,用于绘制染色体的特定区域。微卫星标记的某些遗传改变,包括微卫星杂合性缺失(LOH)和微卫星不稳定性(MI),已经在一些人类恶性肿瘤中被报道16.- - - - - -19..最近,在以正常细胞异常积聚为特征的良性疾病中,如光化性角化病,也发现了缺失和心肌梗死20.,21.,翼状胬肉22.,23.和动脉粥样硬化24..此外,MI和LOH已在慢性阻塞性肺部疾病中检测到(COPD)25.,结节病26.和特发性肺纤维化27..
该研究的目的是检测DNA的染色体区,DNA与哮喘发病相关的DNA劣化使用MI和LOH的遗传筛选工具。研究总共18种高度多态性微卫星标志物,位于染色体5Q,6p,11q和14q上。该研究的结果表明,这些遗传改变是在哮喘患者的基因组的上述地区中可检测到的现象,因此具有高突变率的那些基因率应该得到进一步的研究。
主题和方法
主题
共22例哮喘患者,年龄18-65岁。纳入标准为:1)终生非吸烟者,哮喘病史≥1年,45岁前发病;2)吸入4次100µg沙丁胺醇后1秒用力呼气量增加≥12%,或呼气流速峰值每日变化≥15%,每周≥4天,至少前2周。
所有患者在研究前均接受每日吸入糖皮质激素治疗,剂量为1000-1600µg倍氯米松或布地奈德,或500-800µg氟替卡松,疗程≥1年。
排除标准如下:1)除哮喘外的其他活动性肺病患者;2)有癌症病史的患者;3)孕妇;4)接受吸入性皮质激素以外的免疫抑制药物治疗的患者;5)接受慢性氧疗的患者;6)智力障碍患者。
对照组由六种健康,非惊厥,非饮食从未熏制的受试者组成,不受任何药物。所有受试者都经历了肺活量的肺炎和血液检查,嗜嗜嗜酸性嗜嗜嗜酸性计数(表1⇓).
方法
从所有受试者中收集痰和外周血样品。通过痰诱导,安全,非侵入性方法获得痰液样品28..通过超声雾化吸入NaCl浓度逐渐增加的溶液(Ultraneb 2000;DeVilbiss医疗公司。Somerset, PA, USA),直到取了足够数量的样品。如前所述,将痰样的粘性部分从痰中分离出来29..根据标准方案,在手术前和过程中对气流限制进行肺活量测定29..本研究期间没有注意到严重的不良反应。具有细胞活力> 90%和上皮细胞污染<2%的痰液用于DNA提取。血液和痰样品储存在-70℃以进行DNA提取。
脱氧核糖核酸萃取
采用标准煮沸法和乙醇沉淀法提取痰细胞学标本DNA。使用Nucleon试剂盒(Amersham Biosciences Corp, NJ, USA)按照制造商的说明提取外周血细胞DNA。DNA样本保存在4°C。
微卫星标志物微卫星不稳定性与杂合性分析的丧失
利用位于染色体5q、6p、11q和14q上的18个多态微卫星标记揭示MI或LOH。这些染色体区域的选择是基于先前的认识,即这些区域包含细胞因子、介质或受体的基因,假定这些基因是特应性和哮喘的候选基因7- - - - - -13.两组微卫星标记分别为:D5S207、D5S376、D5S82、D6S1002、D6S2223、D6S429、D6S259、D6S263、D11S2072、D11S480、D11S1253、D11S1383、D11S1876、D14S258、D14S251、D14S72、D14S292、D14S588(表2)⇓).
采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增DNA序列。pcr在50 Ml 10×缓冲液(670 mM Tris HCL, pH 8.5;166mm硫酸铵;67毫米氯化镁;1.7 mg·毫升−1牛血清白蛋白;100µM β -巯基乙醇和1%(体积重量)八羟醇‐9 (Triton X‐100)和1 U的Taq DNA聚合酶(Gibco/BRL Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD, USA))。反应在95°C下变性5分钟,每一步DNA扩增在95°C、55°C和72°C下30个循环。10µl的PCR产物在8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析,然后进行银染色。检测凝胶,比较痰液和对照(外周血)中相同数量DNA中各种等位基因的染色强度。两名不了解受试者临床特征的科学家进行了独立阅读26..如果两名研究者意见不一致,PCR产物在6%的聚丙烯酰胺7 M尿素1XTB测序凝胶(LICOR 2400 DNA Sequencer, Lincoln, NE, USA)中进行分析,并用GENEPROFILER软件(SCANALYTICS, USA)对等位基因大小进行验证。
通过比较从配对DNA标本(痰/外周血)中扩增的微卫星标记的电泳模式,并显示痰DNA标本中一个或两个等位基因的转移,对MI进行评分。这种变化表现为一个或多个重复单元的添加或删除,导致新的微卫星等位基因的产生。LOH定义为与相应的正常等位基因(外周血)相比,病理性等位基因(痰)的强度降低≥50%。19.,25.- - - - - -27..
统计分析
两组间定量测量值采用非配对t检验,三组间采用方差分析检验。百分比比较采用卡方检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。
伦理
本研究经医院医学研究伦理委员会批准,患者同意。
总共22例患者中的16例(73%)在测试的一个或多个微卫星标记中显示出痰液中的遗传改变。在22例患者的15名(68%)中发现了一种或多种标记中的LOH。十个哮喘患者(50%)在多个标记中显示LOH(表2⇑).四名患者(18%)在一个或多个标记处展现了MI。三名患者(14%)显示MI和LOH(表2⇑).最大总数的改变(LOH和MI)见于17例(8个改变)。
在染色体区5Q,6P,11Q和14Q的标记上表现出LOH的样品的比例分别为6/22,10 / 22,7 / 22和8/22。MOH或Mi最常影响的标记为14季度14Q32.1-32.3的D14S292,其六种改变,其次在6P23-24.2,D6S2223上的D6S263和14 Q23-24.3上的D14S258,每次改变五个改变(表2.⇑).最后,最受影响的心肌梗死标志物是D14S588, 3例患者(14%)出现心肌梗死(表2)⇑).哮喘患者被分为两组,A组,变化少(每个患者0-2)和B组,变化多(每个患者≥3)。平均IgE血药浓度(336.2±352.4 IU·mL)差异有统计学意义−1相对165.1±146 IU·毫升−1)和嗜酸细胞计数(560±385细胞·mL)−1相对256.8±200细胞·ml−1(图2)⇓).B组的哮喘学显示较高水平的IgE(P <0.02)和嗜酸性粒细胞(P <0.03)(图2)(图2⇓).两组肺活量值差异无统计学意义。
讨论
在本研究中,研究了22名中度哮喘患者的微卫星DNA的遗传改变。结果显示,73%的哮喘患者表现出心肌梗死或LOH的基因改变,而健康受试者均未表现出任何改变。
方法批判
患者数量少可能是本研究的局限性。然而,即使在这个小队列的患者中,发现的改变频率也是非常显著的。此外,只有6名正常人接受了测试。然而,作者之前对116名正常受试者进行的研究,在使用大量非特异性哮喘标志物,将痰细胞的DNA与血细胞的DNA进行比较时,没有显示出任何遗传改变,无论是心肌梗死还是失活25.- - - - - -27..
尽管疾病的良性性质,但在本研究中,在本研究中的哮喘的68%受试者中发现了LOH的证据30..LOH多态性标志物的分析是鉴定恶性或过急性疾病中推定抑制基因的常见策略。在恶性肿瘤中,观察来自肿瘤细胞中的特定染色体标记物的LOH表明存在紧密连接的肿瘤抑制基因,其丧失涉及肿瘤的发病机制。
LOH在良性疾病中也有发现,其特征是正常细胞的增生或异常增生,如光化性角化病、翼状胬肉和动脉粥样硬化20.- - - - - -24..在活性角化症中,被认为是一种鳞状病症,导致鳞状细胞癌,LOH的频率大于皮肤癌中检测到的频率21..然而,肿瘤抑制基因在人体细胞内稳态和增殖中的作用仍不完全清楚31..
虽然痰液中含有大量处于不同凋亡阶段的退化细胞,但在本研究和既往研究中,正常人均未检测到LOH或MI19.,25.- - - - - -27.,支持这些是疾病特异性发现的假设。
在当前的研究中,发现染色体区域内存在高频率的LOH,这些区域含有在气道重塑、支气管高反应性和特应性中起控制作用的细胞因子和介质的基因,支持这些过程在哮喘的发展中具有重要意义的假设5- - - - - -15.特别是,作者发现,与少于三个标记改变的哮喘患者和对照组相比,突变率高的哮喘患者组的血液IgE水平和嗜酸性粒细胞计数明显更高(图2)⇑).在控制炎症和支气管高反应性的基因的遗传基因座中检测到与过敏和哮喘的改变表型元素相关的基因的遗传基因座(增加的IgE和嗜酸性粒细胞)表明这些基因座可能在哮喘发病机制中发挥作用。但是,需要进一步的研究来澄清这些发现。此外,对于在该研究中研究的染色体区域的附加标记,需要更详细地解释LOH在基因组的这些区域的作用所需的细微映射。
微卫星分析揭示了哮喘中额外的遗传改变,在18%的受试者中发现了心肌梗死。心肌梗死在几乎所有的人类肿瘤以及良性疾病中都被发现,如翼状胬肉、特发性肺纤维化、结节病和慢性阻塞性肺病16.- - - - - -27..由于关于上述疾病的遗传基础的信息有限,这些发现的精确意义是模糊的。然而,作者表明,在微卫星序列的不稳定性中反映的哮喘中相对高的突变率表明了可能影响其他基因的基因组的稳定化并导致含有这些突变的细胞的放松管制。MI可能是与DNA修复缺乏相关的疾病的早期事件。氧化应激可能是导致DNA改变的重要因素。
如果MI和/或LOH确实与哮喘的结构改变的发展有关,它可能参与诱导肌成纤维细胞、肌细胞和成纤维细胞的有丝分裂率增加,从而有助于气道的重塑。然而,这一假设必须得到验证。最后,确定表现出这些基因改变的细胞类型,并研究这些现象是否在其他种族(非希腊裔)的哮喘患者中出现,可能是有趣的。必须说明的是,这项研究的结果不能推广到所有的严重人群或类固醇新手患者。
综上所述,本研究结果表明,杂合性缺失和微卫星不稳定性在哮喘患者的痰细胞中都是可检测到的现象,这些改变可能在哮喘的发病机制中发挥作用。需要进一步的研究来澄清杂合性缺失和微卫星不稳定性在基因组区域的重要性,这些区域包含哮喘候选基因并编码气道炎症和重塑的重要介质。
- 收到了2003年1月30日。
- 接受2003年7月14日。
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