抽象的
趋化因子RANTES(调节活化,t细胞表达和分泌;CC趋化因子配体(CCL)-5)和单核细胞炎症蛋白(MIP)-1α (CCL-3)与肺结节病的肺泡炎的发展有关。新的C趋化因子单半胱氨酸基元(SCM)-1α (XCL-1)和CC趋化因子单核细胞趋化蛋白(MCP)-1 (CCL-2)也是单核细胞趋化因子,代表肺泡炎的备选候选介质。因此,我们在对照组和结节病患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)中研究MCP-1和SCM-1α的表达,以及RANTES和MIP-1α的表达。并探讨趋化因子表达与结节病临床病程的关系。
所有四个趋化因子的信使核糖核核酸(mRNA)表达通过从未分钝的支气管葡萄球菌(17名患者,12例对照)提取的RNA的半定位逆转录酶 - 聚合酶链反应来确定。通过酶联的BALF(60名患者,17例,对照)通过酶联免疫测定法测量RANTES,MIP-1α和MCP-1蛋白。
在结节病中,MCP-1和即咆哮和SCM-1αmRNA表达,特别是患有更晚期疾病的患者。rantes,即MCP-1浓度在患者获得的BALF样品中升高;胸部放射线阶段2疾病患者和患有持续和复发性疾病的患者,MCP-1水平最多。
总之,除了咆哮之外,趋化因子单核细胞化学蛋白-1和单胱桃蛋白质-1α还具有与牙垢病变的肺泡和疾病过程中的表达相似相关。
这项研究得到了捷克卫生部(IGA 3768-3)和学校、教育和体育训练部(MSM 151100002)的支持。
Sarcoidosis是一种多系统肉芽肿性疾病,最常影响由CD4 + T淋巴细胞和巨噬细胞在疾病部位进行肉芽肿形成产生的肺部产生的肺部1.虽然局部淋巴细胞增殖发生在结节病2,肺炎主要是从循环到支气管肺泡空间促进淋巴细胞和单核细胞的结果3..该方法的特征在于细胞粘附分子,趋化因子配体和受体的上调3..趋化因子,低分子量多肽,对特定白细胞群体发挥有效的趋化性和活性作用5..关于它们的性质,趋化因子涉及肺泡炎的发育和肌肉肉芽肿形成3..
根据其生化结构,趋化因子分为四组:CXC,CC,C和CX3.C3..在这些广泛的部门内,当前命名法将序列号分配给单独的趋化因子配体7..RANTES的功能特性(通过激活、t细胞表达和分泌调节;CC趋化因子配体(CCL)-5),单核细胞炎性蛋白(MIP)-1α (CCL-3),单核细胞趋化蛋白(MCP)-1 (CCL-2), CC趋化因子组的成员,以及C趋化因子单半胱氨酸基元(SCM)-1α (XC趋化因子配体(XCL)-1)都预示着它们介导单核细胞向肺的迁移。咆哮,一个体外T细胞化学趋化剂,优先吸引CD45R0 +记忆T细胞,其在结节病病人的肺部增加8..趋化因子MIP-1α和MCP-1最初被认为是吸引单核细胞的特征在于有效的T细胞引诱剂体外9..SCM-1α,人类“LymPhotidin”10,是纯淋巴细胞化学术11.
为了探讨这些“候选”趋化因子在结节病的肺泡炎发展中的潜在作用,作者研究了支气管肺泡细胞中的趋化因子通信核糖核酸(mRNA)和蛋白表达,并从结节病患者患者中灌洗液(BALF)并与之比较来自对照受试者的细胞和灌洗液。此外,作者调查了趋化因子表达是否与胸腔放射学阶段评估的临床过程有关,需要治疗和疾病解决/进展。
方法
学习人口
在研究的第一部分,筛选mRNA趋化因子表达从BALF中恢复的未分离支气管肺泡细胞。12名对照组(年龄39.5±3.8岁(中位数±sem), 7名男性,8名非吸烟者,4名吸烟者)和17名结节病患者(年龄44.8±2.2岁,7名男性,16名非吸烟者,1名吸烟者)按照标准方案进行支气管肺泡灌洗(BAL);胸片1期(12例),2期(4例),3期(1例)。结节病的诊断以典型的临床特征和肺活检组织病理学检查的肉芽肿为基础,进一步以淋巴细胞CD4+ BAL为支持,符合《结节病国际声明》的标准12.
在离心BALF后,得到上清液并储存在-80℃下;BALF细胞颗粒在胍异硫氰酸酯中裂解,用于随后的RNA提取13.17例患有的术术患者,10(59%)所需的皮质类固醇治疗,这始终在灌洗后启动。临床路线(2年代从介绍时)可以在15名(88%)患者中评估:五名患者(33%)在没有治疗的情况下恢复(第1类),六名患者(40%)在治疗后恢复(第2类),四名患者(27%)有持续的疾病(第3类)。
对照组由在介绍时的受试者组成,随后显示没有肺炎的临床症状;他们的病史没有肺病。所有人都具有正常的BALF细胞学,免疫学和微生物学。在该组中,包括两名涉嫌肺恶性肿瘤的患者;在未受影响的叶片上进行灌洗。
在该研究的第二部分中,在BALF上清液中研究了趋化因子蛋白表达。样品在17个对照受试者中获得(44.6岁±4.4 YRS,13名男性,10名不吸烟者,7名吸烟者)和60名患有的结节病(年龄45.5±1.5 YRS,26名Males,56名非闻名者,四名吸烟者);胸部射线照相阶段1(n = 35),阶段2(n = 17),阶段3(n = 3)和阶段0(n = 5)。60例患者,41例(68.3%)所需的皮质类固醇治疗。在60例(90%)患者的54名(90%)患者中,可以评估结节病的临床病程(介绍2年):14名患者(26%)在没有治疗(1类),26名患者(48%)治疗后恢复(第2类),八名患者(15%)具有持续疾病(第3类);在六(11%)患者(第4类)中观察到疾病的复发。表1中描述了从患者和对照受试者获得的BALF的细胞谱⇓.
所有参与者(患者和对照科目)都来自一个推荐中心(大学医院奥洛穆茨,奥洛穆尔科,捷克共和国)。该研究批准了该机构的伦理委员会。
趋化因子mRNA表达在BAL细胞中的评估
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测趋化因子mRNA表达。mil -1α、MCP-1、RANTES和SCM-1α mRNA通过将趋化因子表达归一化至β-actin的表达进行半定量:计算个体中每个趋化因子mRNA表达的“趋化因子/β-actin光密度比”(ODR)。关于这种标准化方法的细节,包括使用特定于所研究的趋化因子的引物对的优化实验的结果,在其他地方进行了描述13.
BALF中趋化因子蛋白的测定
使用固相夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测量不浓BALF中的趋化因子蛋白水平。为了检测免疫反应性咆哮和MIP-1α,使用量子测定(R&D Systems,Abindgdon,UK);测定显示出与一系列人趋化因子没有交叉反应性。简而言之,将100μl重复的BALF或标准物(重组人咆哮或MIP-1α)应用于预涂覆小鼠单克隆抗人rytes(抗人MIP-1α)抗体的ELISA托盘的孔。孵育(2小时,室温)后,在加入辣根过氧化物酶共轭山羊多克隆抗体(抗MIP-1α)抗体之前洗涤孔三次。将托盘孵育(1小时,室温),在色原和底物溶液中洗涤(四甲基苯胺和过氧化氢,1:1)。孵育(20分钟,室温)后,通过加入2M硫酸反应,使用ELISA板读取器(Titertek Multiksan MCC / 340,Thermo Labsystems,Vantaa,Finland)测量吸光度并在450nm下测量吸光度。通过Kim-E软件(úsol,布拉格,捷克代表)处理数据。检测Rantes和MIP-1α的下限为19.0 pg·mL-1.
使用HBT套件(Hycecl Biotechnology,Uden,荷兰)测量MCP-1蛋白。简而言之,预涂有100μl重复的样品或标准物(1小时,室温)预涂有初级抗人MCP-1抗体。洗涤后,加入生物素化的二次抗人MCP-1抗体和链霉抗生物素蛋白 - 过氧化物酶缀合物1小时。最后,施加四甲基苯苯胺底物溶液25分钟;在用2M硫酸停止反应后,在450nm下测量吸光度。通过Kim-E软件评估数据;MCP-1测定的检测限为6.0 pg·mL-1.
对于所有三种测定,使用新的等分试样的BALF来避免重复解冻和冻结样品,这可能会降低趋化因子生物活性。SCM-1α蛋白没有被测量,因为没有ELISA检测。
统计分析
Mann-Whitney U-测试用于检测趋化因子mRNA或蛋白质表达在结节病和对照组之间或不同疾病阶段之间的蛋白表达的差异。Spearman的等级相关用于评估趋化因素表达数据和BALF细胞计数之间的关系。P <0.05被认为是统计学意义的。
结果
趋化因子mRNA表达和结节病的临床严重程度
趋化因子mRNA表达在1级(n = 12)或2级(n = 4)患者(n = 4)的患者之间没有差异(n = 4)鼻窦射线阶段(RANTES mRNA:1级1.00±0.26,2级1.44±0.32,P = 0.56;SCM-1αmRNA:级别2.1±0.24,级2.00±0.26,P = 0.76)。当疾病严重程度通过对治疗的需要来定义,基于临床疗法(T +; n = 10),然而,通过与患者的患者进行比较,只有在呈现中增加咆哮和尤其是SCM-1αmRNA表达的趋势不需要(T-; n = 5)(rantes mRNA:t + 1.48±0.15,t- 0.88±0.63,p = 0.12; SCM-1αmRNA:T + 2.24±0.24,T- 1.56±0.53,P = 0.06).MCP-1 mRNA表达在更先进的疾病患者中也较高,但差异再次差异无统计学意义(T + 0.63±0.09,T- 0.40±0.14,P = 0.08)。MIP-1αmRNA表达与疾病课程无关(未显示数据)。
BALF中的趋化因素蛋白水平
在未浓缩BALF液中以免疫反应蛋白水平检测四种趋化因子中的三种(MCP-1、MIP-1α、RANTES)的mRNA水平;SCM-1α蛋白没有被测量,因为没有ELISA检测。在77份经检测的BALF样本中,仅检测到MIP-1α蛋白(1.3%),而在28%(60份样本中的17份)的患者样本中检测到RANTES蛋白,但在17份对照样本中未检测到RANTES蛋白。70%(42 / 60)的患者样本和53%(9 / 17)的对照样本中存在MCP-1蛋白。MCP-1,而RANTES蛋白水平与所给趋化因子的mRNA表达相关;相关系数(MCP-1) rS.= 0.55,p = 0.001。
与对照组相比,患者MCP-1 BALF蛋白水平显着升高(患者14.6±3.5 pg·mL-1;控制5.7±2.9 pg·ml-1;p = 0.02(图2A⇓)。对于咆哮,患者蛋白质浓度的增加存在趋势(图2B⇓)但这并未达到统计学意义(P = 0.08)。
MCP-1是本研究中发现的唯一在BALF中显著升高的趋化因子,为了确定其细胞来源,我们在4例结节病患者的BAL细胞的细胞离心标本中检测了细胞相关的MCP-1蛋白。肺泡巨噬细胞中MCP-1表达强烈、一致。MCP-1蛋白也与淋巴细胞相关,然而,其表达限于约三分之一的BAL淋巴细胞,且其表达强度低于巨噬细胞相关的MCP-1(数据未显示)。
趋化因素蛋白表达和结节病的临床过程
胸部放射学阶段2患者的MCP-1蛋白水平与第1阶段疾病的患者相比(第1阶段(n = 35)9.8±3.7 pg·mL-1;2期(n=17) 40.5±7.8 pg·mL-1;p = 0.003)。此外,MCP-1 BALF蛋白质水平平行于疾病的临床过程:通过与疾病患者的水平相比,疾病持续或复发的患者的患者中的MCP-1水平呈增加,患者(类别3和4)增加分辨率(类别1和2)(类别3和4(n = 14)26.7±9.5 pg·ml-1;类别1和2(n = 40)10.3±3.5 pg·ml-1;p = 0.01)。
趋化因子表达与BAL细胞数之间的关系
MRNA用于趋化因子咆哮和SCM-1α与BALF淋巴细胞数相关的MRNA(图3⇓)。当对受试者与具有低(≤10%)BALF淋巴细胞计数的受试者进行比较(≤10%)的受试者时,趋化因子mRNA表达也增加了(咆哮,P = 0.02; SCM-1α,P= 0.01)。在RANTES和SCM-1αmRNA之间也观察到一个关联,无论是CD4 +淋巴细胞的绝对和相对数量(P <0.01),也是在这些趋化因子和CD4 / CD8 +的比率之间(P <0.01)。MCP-1蛋白质水平与灌洗淋巴细胞数相关(P = 0.02),并在具有较高比例(> 10%)的BALF淋巴细胞(P = 0.001)的受试者中升高。对于咆哮,蛋白质浓度和BALF淋巴细胞数之间存在关联的趋势,但这并未实现显着性。SCM-1α的蛋白质数据不可用。还在趋化因子mRNA /蛋白质数据和支气管肺泡巨噬细胞,中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的百分比和总数之间进行相关性,但没有发现任何关联(数据未显示)。
讨论
结节病患者的肺泡和淋巴细胞积聚来自细胞粘附分子,趋化因子配体和受体之间的相互作用3..本研究集中在MRNA的测定上,并且在可能的情况下,也可以在可能的四个成员的蛋白质表达中,其中四种成员的CCL和XCH趋化因子亚组,该主要候选者用于单核细胞吸引力对肺部。发现CC趋化因子,RANTES和MCP-1在患有结节病的患者中上调,并且还观察到SCM-1α(C趋化因子)的mRNA升高。趋化因子上调在疾病进展并与淋巴细胞肺炎有关的患者中最明显。
最突出的是关于MCP-1的调查结果。MCP-1表达已经在间质肺病中进行了在BALF中进行过研究,但直到最近主要在纤维膜炎中14-15而不是在结节病16.本研究中60例结节病患者的非浓缩灌洗液中MCP-1蛋白水平升高,补充了27例结节病患者浓缩BAL中MCP-1蛋白水平升高的报道17.最近,来自Sarcoizosis病患者的血清样本中报告了MCP-1的增加18.目前作者推测,系统性MCP-1水平可能反映了身体的总肉芽肿负担,而BALF水平可能更好地反映肺部受累。细胞相关的MCP-1蛋白对肺泡巨噬细胞的定位与这种解释一致。在上述关于支气管肺泡MCP-1蛋白的作用的讨论的背景下,在本研究中报告患者BALF的MCP-1蛋白质的显着升高以及射线照相阶段2疾病以及更先进的(IE。持续和复发)疾病。在mRNA和蛋白质水平上并行检测疾病中MCP-1和更晚期的MCP-1,虽然患者MCP-1 mRNA的增加没有达到统计学意义。然而,趋化因子蛋白的存在对于其化学态功能是必要的,因此,目前关于MCP-1蛋白质水平的显着增加的数据及其与疾病课程的关系是相关的体内.
目前的观察结果根据对较小患者数的研究,添加到先前关于rantes mRNA和细胞相关蛋白的上调的报告20.-22.组合细胞相关rantes表达的定位,主要是巨噬细胞20.根据其BALF水平的当前数据,可以想象,RANTES确实是从其产生细胞分泌到支气管肺泡腔。然而,尽管在mRNA和蛋白水平上发现了RANTES的平行升高,但RANTES蛋白的升高并没有达到显著性。Iida等等。21据报道,浓缩BALF样品的蛋白质水平增加了40例患者。因此,可以在该研究中用于响铃测量的测定对稀释因子太敏感。最近的报告支持此解释22,采用“高敏感”ELISA试剂盒检测非浓缩BALF中RANTES。另外,在RANTES mRNA和蛋白检测中观察到的差异可能是由于转录后和翻译后调控机制的可能影响,包括RANTES蛋白的释放和代谢23.翻译过程的复杂性以及进一步改变因子的存在,例如蛋白质储存或其可能的细胞内降解,可能导致BAL流体中的细胞内mRNA和蛋白质之间的直截了当的关系。尽管有上述约束,但重要的是,在(蛋白质和mRNA)水平中,变化的方向是相同的,并且它与以前的报告一致20.-22.
据报道,MIP-1α表达在Sarcoid肺泡巨噬细胞中增加25.然而,目前的作者和其他人21无法从结节病患者中检测到BALF中的MIP-1α蛋白。本研究中使用的MIP-1α特异性ELISA足够较低的检测限,在持续的实验中能够检测支气管肺泡细胞培养物上清液中大量的趋化因子蛋白。这些数据与发现MIP-1αmRNA存在但未在本研究中的BALF细胞中抑制的发现,表明MIP-1α不会大致与白细胞募集到结节病中的支气管肺池中。
与上面讨论的三种CC趋化因子相比,关于新型C趋化因子SCM-1α的组织表达的数据仍然有限26.目前在结节病患者的支气管肺泡细胞中发现的SCM-1α mRNA上调,将人类病理学中SCM-1α表达的数据扩展到肺间质疾病。SCM-1α (XCL-1)是t淋巴细胞(CD8+)和自然杀伤细胞的趋化剂11.SCM-1α上调与mRNA表达和BALF淋巴细胞编号之间的关系表明,XCL-1可以是涉及淋巴细胞迁移到肺部的另一个趋化因子体内.然而,未来的详细研究是为了更好地确定C趋化因子亚组在结节病变中的肺泡炎中的作用,特别是通过鉴定其细胞来源。
重要的是,这项研究表明BALF中的趋化因子表达可能与结节病的临床病程有关。在病情较严重的患者中(2年后评估),RANTES、SCM-1α和MCP-1 mRNA的表达倾向于高于疾病自行消退的患者。MCP-1蛋白水平在2期胸片患者和2年后疾病持续或复发的患者中显著升高。这些发现表明,在BALF中测量趋化因子可能成为评估可能进展和监测疾病进程的替代标志物。提出的数据和需要反映一个实际点29暗示在非浓度的BALF中测量的MCP-1蛋白是合适的候选标记。
最近,有人提出趋化因子IP-10 (CXCL-10)和RANTES共同调控结节样病变的炎症浸润30..来自这方面的数据和其他研究16-18表明,更广泛的引诱剂和活化的趋化因子可能有助于细胞迁移和激活过程在局部和系统性上在结节病中持续。可以参与疾病过程的不同阶段,互相涉及的趋化子,互相互动的趋化因子。在本阶段无法解决各个趋化因子的相对贡献问题,作者也不能解决趋化因子配体受体相互作用。
有关进一步的研究,请重点解决尚未答复的问题,重点评估这些调查结果对肺结节病患者纵向评估的实际适用性。
致谢
作者谨感谢B.Hutyrová,J.Zlámal和V.Lošt'áková提供临床细节。他们还要感谢A.Vévodová提供技术援助和F.Mrázek的帮助,以获得表1⇑.
- 已收到2001年10月26日。
- 公认2002年6月16日。
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