摘要GydF4y2Ba
研究了两种肥大细胞稳定剂——色甘酸钠(SCG)和多沙唑(doxantrazole)对活性氧(ROS)形成的影响。豚鼠肺泡巨噬细胞(AMs)产生lucigenin依赖的化学发光(LDCL)。当用福波肉豆蔻酸酯(PMA)或酵素(在60分钟的LDCL总量中分别增加了133%和464%)刺激细胞时,这种反应增加。SCG降低pma诱导的LDCL浓度(10 mM,降低55%)高于doxantrazole (1 mM,降低75%)。SCG降低了AMs对酵素的自由基生成,且呈浓度依赖性,降低幅度≤72%。Doxantrazole (0.1-1 mM)使总LDCL减少30-80%。此外,葡萄糖氧化酶在无细胞培养基中与葡萄糖共孵育可导致LDCL的产生。在SCG或doxantrazole存在时,抑制率为47-83%。SCG和doxantrazole对过氧化氢和过氧亚硝酸盐诱导的LDCL的抑制率≤92%。此外,这些药物可略微提高AMs的存活率。GydF4y2Ba
由此可见,doxantr唑和色甘酸钠抑制豚鼠肺泡巨噬细胞产生依赖于荧光素的化学发光是由于直接清除活性氧。Doxantrazole的效力是后者的10倍。肥大细胞稳定剂在过敏性哮喘中可能是有效的,不仅可以防止过敏原诱导的介质释放,还可以防止自由基诱导的肺损伤。GydF4y2Ba
色甘酸钠(SCG)被用于哮喘治疗,尽管其在治疗潜在病理生理学方面的作用仍存在争议GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.已知该药物稳定肥大细胞膜,从而抑制介质释放GydF4y2Ba2GydF4y2Ba. 以往出版物的证据表明,除了已知的抗过敏特性外,SCG还有其他一些作用机制。1) 在豚鼠气道高反应性卵清蛋白模型中,吸入SCG后早期哮喘反应(EAR)不受影响,但晚期哮喘反应(LAR)受到显著抑制GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba.2)SCG减少了大鼠肺受照侧的损伤GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba.3)SCG针对白细胞介素-5诱导的豚鼠中的肺炎,特别是支气管上皮细胞的脱落GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba.4) SCG可抑制哮喘患者气道内粘附分子的表达,减少气道内炎症细胞数量GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
呼吸爆发是受刺激的粒细胞和巨噬细胞的特征性反应GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba,导致活性氧(ROS)的形成,可杀死微生物,并可能导致组织损伤GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba.ROS是由活化的吞噬细胞和受损的哺乳动物细胞产生的GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba.超氧化物阴离子,含氧基团,是能够氧化到分子氧的氧化还原试剂或还原到过氧化氢GydF4y2Ba10GydF4y2Ba.这种自由基的自发产生已经在过敏受试者的抗原激发部位显示出来,它有助于与过敏性炎症相关的气道损伤的发病机制GydF4y2Ba11GydF4y2Ba.过氧化氢,另一种ROS,损害纤毛的上皮细胞,并产生人分离的外周气道的高反应性GydF4y2Ba12GydF4y2Ba. 目前的作者已经证明,当豚鼠离体气管受到邻苯三酚(一种产生超氧物的物质)刺激时,也会诱发气道高反应性GydF4y2Ba13GydF4y2Ba.过氧亚硝酸盐是一种强效的细胞毒性阴离子,由一氧化氮和超氧化物相互作用产生。它由许多炎症细胞产生,可能在气道疾病的病理生理过程中发挥重要作用GydF4y2Ba14GydF4y2Ba.外源性给药过氧亚硝酸盐模拟呼吸道中的某些炎症情况,如对组胺和甲胆碱的高反应性、上皮细胞损伤、嗜酸性粒细胞破坏和豚鼠离体灌注气管中主要碱性蛋白的释放,以及麻醉动物长期的气道高反应性GydF4y2Ba15GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
SCG对肺泡巨噬细胞(AMs)的影响尚未得到广泛研究GydF4y2Ba16GydF4y2Ba.在本研究中,我们研究了SCG(一种结缔组织肥大细胞的稳定剂)和doxantrazole(一种新的粘膜和结缔组织肥大细胞的稳定剂)对豚鼠AMs产生ROS的作用。测定活性氧生成GydF4y2Ba通过GydF4y2Ba荧光素依赖性化学发光(LDCL)的发射。此外,我们还研究了SCG和doxantrazole对葡萄糖氧化酶与葡萄糖相互作用产生的LDCL的影响。GydF4y2Ba通过GydF4y2Ba过氧化氢(HGydF4y2Ba2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)和过氧亚硝酸盐(ONOOGydF4y2Ba−GydF4y2Ba)在无细胞溶液中。该研究的目的是确定这些物质与ROS的产生的可能相互作用,并且可能是所涉及的机制。GydF4y2Ba
材料和方法GydF4y2Ba
动物GydF4y2Ba
在受控条件下,在受控条件下,特定病原体无豚鼠(400-500克,男性Dunkin Hartley; Harlan Olac Ltd,Bicester,Bicester,Bicester,UK)。允许水和商业咸菜GydF4y2Ba随意GydF4y2Ba.根据Harlan Olac Ltd的健康监测质量控制报告和组织学检查,这些豚鼠没有呼吸道感染。过量戊巴比妥钠(Euthesate®,0.8 g·kg体重)致豚鼠死亡GydF4y2Ba-1GydF4y2Bai.p。GydF4y2Ba;阿法莫bv,荷兰阿纳姆)。GydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗和巨噬细胞分离程序GydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗(BAL)在牺牲的动物上进行如下:从周围的结缔组织修剪气管,并使套管将插管插入气管;肺部填满GydF4y2Ba原位GydF4y2Ba在30厘米的压力下,15毫升预磨牙盐水GydF4y2Ba2GydF4y2BaO;在温和按摩后,将流体从肺部中取出60秒并节省;继续灌洗,每种几内亚猪填充离心管(50mL)。灌洗后,将管以500×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba和4°C 10分钟。丢弃上清液,保存球团。将细胞颗粒重悬在15ml的冰冷培养基中(罗斯威尔公园纪念医院(RPMI),含10%胎牛血清;Gibco,格兰德岛,英国),然后轻轻地转移到另一个管上面的Ficoll-Paque(法玛西亚生物技术公司,乌普萨拉,瑞典)。两个独立的层是可以区分的。试管在1000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba和4°C 20分钟。将分离的间隔并用RPMI将其体积调节至15mL并以500×以500×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba4°C处理10 min,然后重复此步骤。BAL细胞用Türk溶液(Merck, Darmstadt, Germany)染色,并在Bürker-Türk亮线计数室(Glaswarenfabrik Karl Hecht KG, Sondheim, Germany)计数。细胞在显微镜玻片上以45×纺丝进行分化GydF4y2BaGGydF4y2Ba用Diff-Quik®(Mez & Dade AG, Düdingen, Switzerland)固定并染色。在油浸显微镜下进行差异计数。最后的细胞悬液由99%的巨噬细胞组成。GydF4y2Ba
Lucigenin依赖化学发光排放GydF4y2Ba
使用LKB-1251发光计(LKB Wallac,Turku,Finland)测量LDCL生产。含有3×10的细胞悬浮液GydF4y2Ba5.GydF4y2BaAMs置于含有荧光素(50µL;Sigma, St Louis, MO, USA), Zymosan A(100µL;Sigma)或肉豆蔻酸酯(PMA, 50µL;在最终体积为0.5 mL克雷布斯缓冲液中。荧光素是一种化学发光指示剂,最终浓度为500µM。调理酵素和PMA作为细胞刺激剂,最终浓度为2.5 mg·mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba0.16µM。当研究SCG (Sigma)或doxantrazole (Sigma)对AMs产生的LDCL的影响时,用50µL的10倍浓度的每种化合物的溶液代替等体积的克雷布斯缓冲液。在60分钟的时间内测量LDCL。在无细胞的溶液中,使用葡萄糖氧化酶(0.1-100 U·mL)产生LCDLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba;Sigma)加葡萄糖(8.3 mM),过氧化氢(0.3-30 mM)和过氧亚硝酸(0.001-10 mM)。超氧化物歧化酶(SOD) (100 U·mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba;Sigma),过氧化氢酶(100 U·mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba;在30分钟内,研究了西格马(Sigma)、SCG (1-10 mM)和doxantrazole (0.1-1 mM)对LDCL排放的影响。综合响应用随光度计提供的PC软件进行测定。数据以峰值LDCL (mV)以及超过60或30分钟的曲线下面积(AUC) (mV×min)表示。所有实验均在37°C下测量LDCL生成。GydF4y2Ba
统计分析GydF4y2Ba
各处理组产生的LDCL峰值(mV)或AUC (mV×min)取平均值,以平均值±sem表示。采用单因素方差分析(ANOVA)对每组实验的结果进行评价。在单因素分析达到显著性水平的情况下,采用Bonferroni t检验进行方差分析后的均数比较。所有p值<0.05视为差异有统计学意义。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
肺泡巨噬细胞产生荧光素依赖的化学发光GydF4y2Ba
无刺激BAL细胞产生LDCL,峰值为137±34 mV, AUC为3564±228 mV×60 min。pma处理的细胞产生了更多的自由基,在60分钟内LDCL峰值增加了70% (p<0.05),总LDCL增加了133% (p<0.01)。Zymosan使基底峰增加了155% (p<0.01), AUC增加了464% (p<0.001)。SOD使细胞的峰值降低≤79%,AUC降低≤69% (p<0.001)。GydF4y2Ba
在37℃缓冲液中孵育1 h后,台虫蓝排除试验显示,40.3±10.2%的细胞存活。令人惊讶的是,SCG (1-10 mM)和doxantrazole (0.1-1 mM)使生存率提高了≤65%,但未达到统计学意义水平。GydF4y2Ba
SCG以高浓度(3.3-10mm)≤55%的PMA诱导的LDCL(图1AGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).PMA诱导的LDCL被多沙他唑降低(0.33-1 毫米)增加23–75%(图。 2aGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).但这些变化均未达到统计显著性水平。GydF4y2Ba
SCG降低了AMs对酵素的自由基生成,且呈浓度依赖性,降低幅度≤72%。在0.33和10 mM处效果显著(图1b)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).Doxantrazole(0.1-1 mm)将总LdCl减少30-80%(图2BGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba)以浓度依赖的方式。GydF4y2Ba
由氧活性物质产生的荧光素依赖的化学发光GydF4y2Ba
葡萄糖氧化酶(10u·mL .GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)当与葡萄糖反应30分钟时,产生最高强度的LDCL 在无细胞溶液中(数据未显示)min。当SOD(100 U·mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)添加到反应混合物中,而过氧化氢酶没有影响(图。 3aGydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).这表明超氧阴离子在该反应中具有独特的作用(图3a)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).当SCG (1-10 mM)加入混合物时,总LDCL以浓度依赖性的方式受到47-83%的抑制(图4a)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).Doxantrazole (0.1-1 mM)同样使总LDCL降低76-88%(图4a)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
过氧化氢(0.3-30mm)导致所有浓度的LDCL(数据未显示)。然而,在其剩余的实验中使用10mM该试剂,因为在该浓度下实现了最大的光发射。LDCL完全被过氧化氢酶废除但不是SOD(图3BGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).SCG(10) mM)和多沙他唑(1 mM)抑制过氧化氢的作用92%(图。 4bGydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
过氧亚硝酸钠诱导的LDCL在0.1 mM时可检测到,在更高浓度时,LDCL的强度高于化学发光仪的灵敏度范围(数据未显示)。令人惊讶的是,SOD使过氧亚硝酸盐诱导的LDCL增加了91%,而过氧化氢酶降低了80%(图3c)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).SCG和doxantrazole对过氧亚硝酸盐的抑制作用分别为≤89%和73%(图4c)GydF4y2Ba⇑GydF4y2Ba).GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
从豚鼠分离的AMs在颗粒或可溶性刺激下产生LDCL。当肥大细胞稳定剂(SCG或doxantrazole)加入孵育缓冲液时,这一比例降低。进一步的实验表明,这些物质是活性氧的清除剂,如超氧化物和过氧化氢,以及过氧亚硝酸盐。此外,这些药物以浓度依赖性的方式轻微提高了细胞的存活率。GydF4y2Ba
超氧化物阴离子是几种代谢过程产生的重要RO,其中黄嘌呤氧化酶降低烟苷腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)氧化酶,以及P450单氧酶系统是最重要的GydF4y2Ba17GydF4y2Ba-GydF4y2Ba20GydF4y2Ba.在呼吸系统中,各种炎症细胞产生超氧化物GydF4y2Ba21GydF4y2Ba-GydF4y2Ba22GydF4y2Ba它可能涉及呼吸系统疾病的病理生理学。细胞的自由基产生的特征在于化学发光的排放GydF4y2Ba23GydF4y2Ba化学发光放大器荧光素常用于提高自由基检测的灵敏度GydF4y2Ba24GydF4y2Ba.GydF4y2Ba
目前的研究表明,呼吸道中的两种肥大细胞稳定剂的作用机制之前尚未确定。文献中有证据表明,肥大细胞稳定剂在其他器官中的作用与其抗过敏特性无关。例如,多沙他唑抑制正常的肠粘膜大鼠耳鸣GydF4y2Ba通过GydF4y2Ba抗胆碱作用GydF4y2Ba25GydF4y2Ba. 多沙他唑抑制卵清蛋白诱导的空肠离子转运增加GydF4y2Ba26GydF4y2Ba和气管GydF4y2Ba27GydF4y2Ba致敏大鼠粘膜GydF4y2Ba在体外GydF4y2Ba.doxantrazole比scg更有效。此外,Doxantrazole抑制了大鼠Jejunal圆形平滑肌中的抗原诱导的收缩,但不是SCGGydF4y2Ba28GydF4y2Ba.在本次研究中,doxantrazole的清除自由基的能力也比SCG高出约10倍,因此,总体上看来,doxantrazole的清除自由基的能力更高。SCG对巨噬细胞影响的报道较少。该制剂可增强大鼠腹腔巨噬细胞结合绵羊红细胞的能力GydF4y2Ba29GydF4y2Ba.有趣的是,最近的一项研究表明,一些抗哮喘药物,包括SCG,可以减少人类嗜酸性粒细胞的超氧化物释放GydF4y2Ba30GydF4y2Ba.然而,在本研究中,SCG能够在非常低的浓度下发挥作用,在当前的研究中不能发挥任何清除作用。对于SCG(至少1mm)和doxantrazole(至少0.1 mM)来说,影响LDCL的浓度确实很高。然而,这些浓度可能与哮喘或变应性鼻炎患者反复雾化使用肥大细胞稳定剂的病例有关,因为局部使用可能导致这些药物的高浓度。GydF4y2Ba
综上所述,色甘酸钠和多沙唑表现出非特异性抗氧化性能,不仅抗活性氧(如超氧化物和过氧化氢),而且抗过氧亚硝酸盐。因此,肥大细胞稳定剂在哮喘患者中可能是有效的,不仅可以防止过敏原诱导的介质释放,还可以防止炎症过程中活性氧造成的气道组织损伤。另外,清除自由基可能部分作用于色甘酸钠和多沙唑对肥大细胞的稳定作用。然而,还需要进一步的研究。GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
作者要感谢I. van Ark和T. Muis对这项研究的技术支持。GydF4y2Ba
- 收到了GydF4y2Ba2002年1月19日。GydF4y2Ba
- 公认GydF4y2Ba2002年5月9日。GydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司GydF4y2Ba
参考文献GydF4y2Ba
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