摘要gydF4y2Ba
本研究的目的是研究增加明确的下呼吸道(LRT)吸入肝素剂量对肺功能和凝血的安全性。gydF4y2Ba
10名志愿者从装载10万、20万、30万或40万国际单位(IU)的Sidestream喷射雾化器中吸入肝素。分别于吸入前、吸入后1、3、6和24 h测定肺功能、抗因子(anti - factor)-Xa、活化部分凝血酶活时间(APTT)、组织因子途径抑制剂(TFPI)、全血凝血时间、血小板、von Willebrand因子和C反应蛋白。gydF4y2Ba
肝素LRT最高剂量为32,000 IU。吸入肝素对肺功能无影响。抗xa活性曲线下的面积随肝素剂量的增加而增加(p=0.005),但在其他变量中保持不变。抗xa活性峰值为0.113 IU·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba吸入400,000 IU肝素后6小时。与基线值相比:20万(p=0.03)、30万(p=0.004)和40万IU (p=0.002)肝素后抗xa升高;吸入400,000 IU肝素6 h后,APTT达到最大值1.03 (p=0.05);10万(p=0.01)、20万(p=0.01)、30万(p=0.006)和40万IU (p<0.001)后,TFPI升高。gydF4y2Ba
用于临床或研究目的,可安全吸入向下呼吸道输送32,000国际单位的吸入肝素。gydF4y2Ba
这项研究得到了丹麦肺脏协会的资助。gydF4y2Ba
吸入性肝素对支气管哮喘的影响已成为多项研究的主题gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba因为肝素具有抗炎特性。这些研究的结果不一致,可能是因为给下呼吸道(LRT)的肝素剂量不同且不定量。使用了不同的气溶胶产生装置。超声波雾化器产生的气溶胶的粒径比喷射雾化器大gydF4y2Ba8gydF4y2Ba因此,来自超声雾化器的轻放疗剂量可能非常小。此外,由于雾化过程中蒸发水的损失,喷射雾化器的输出功率常常被高估gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,导致LRT中储存的药物数量少于预期。此外,研究了不同组的患者,并使用不同的刺激方法评估了肝素的效果,如运动、过敏原、组胺、甲胆碱、腺苷、一磷酸腺苷(AMP)和焦亚硫酸钠gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,使得比较变得困难。gydF4y2Ba
以往的研究没有对不同喷雾器产生的肝素气溶胶的性质进行研究,也没有准确测量吸入肝素沉积在LRT中的剂量。作者先前已经描述了由射流和超声喷雾器产生的肝素气溶胶的粒径和输出gydF4y2Ba10gydF4y2Ba.研究发现,与Ultraneb 2000超声波喷雾器(德维尔比斯,兰根,德国)相比,侧流喷射喷雾器(medical - aid, Bognor Regis,英国)的高肝素浓度和驱动流量产生的肝素气溶胶的颗粒尺寸更小。因此,估算的轻放疗剂量在喷射雾化器中最高。随后,通过闪烁术测定,单次雾化90000 IU后,LRT中沉积了7000 IUgydF4y2Ba99米gydF4y2BaTc-heparingydF4y2Ba11gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
为了研究吸入肝素在肺部疾病中的可能用途,必须明确和量化LRT剂量,并了解其对全身凝血和肺功能的影响。因此,必须确定吸入肝素的安全剂量。gydF4y2Ba
因此,本研究的目的是研究增加吸入肝素剂量对肺功能和凝血系统的影响。对混凝系统的影响如下所述。1)对循环血液的影响:活化部分凝血活酶时间(APTT)、抗因子(anti -Xa)和全血凝血时间(WBCT)。2)对内皮细胞的影响:组织因子途径抑制剂(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)和血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)的释放。3)不良反应:血小板。此外,C反应蛋白(CRP)描述了一种可能的全身炎症效应。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
喷雾器和肝素gydF4y2Ba
未分离肝素钠,浓度为25,000 IU·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(Leo Pharmaceutical Ltd, Copenhagen, Denmark)和来自同一批次的四个Sidestream喷射雾化器(medical - aid)。gydF4y2Ba
研究人群gydF4y2Ba
10名健康志愿者(3名男性)被纳入研究(平均年龄43岁;平均重量74公斤)。所有患者肺功能正常(平均±sd: 1秒用力呼气量(FEV)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba) 104±11%预测;强迫肺活量(FVC) 112±11%;和FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba/FVC 96±7% pred)和参考区间内凝血变量(APTT 1.01±0.10 (pred 0.90-1.20);凝血酶原时间0.99±0.06 (pred 0.8-1.20);血小板290±49 (pred 160-340×10gydF4y2Ba9gydF4y2Ba·LgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba).所有志愿者也都有正常的胸片和组胺激发试验(激发剂量导致FEV下降20%gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(PDgydF4y2Ba20.gydF4y2Ba) > 8 mg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba组胺)。gydF4y2Ba
排除标准为肺部疾病、出血性疾病、妊娠或哺乳、胃溃疡或消化道出血、肝素过敏、抗凝治疗。两名志愿者分别用美托洛尔和赖诺普利治疗动脉高血压,一名用激素替代疗法,一名用多种维生素制剂。gydF4y2Ba
每位受试者均提供书面知情同意。该研究得到了当地伦理委员会的批准。gydF4y2Ba
政府的气溶胶gydF4y2Ba
受试者吸入肝素4天,间隔≥14天,以确保肝素洗脱。10万、20万、30万和40万国际单位的剂量装入1、2、3或4个喷雾器中。这相当于给LRT注射的肝素剂量分别为~ 8000、1.6万、2.4万、3.2万IUgydF4y2Ba11gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
肝素钠(4ml,浓度25,000 IU·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)加载到侧流射流雾化器中,以10 L·min的流量驱动gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba.受试者佩戴鼻夹,通过吸口以正常的潮汐呼吸方式吸入肝素15分钟,直到可见的气溶胶产生停止。因此,每次给药的吸入时间分别为15、30、45、60 min。gydF4y2Ba
分别于吸入前和末次雾化开始后1、3、6和24 h进行肺功能检测和血样采集。gydF4y2Ba
肺功能gydF4y2Ba
采用体容积描记法测定肺功能指标:FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba、FVC、Tiffenau指数(FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba/FVC)、呼气峰值流量(PEF)和特定气道传导率(gydF4y2Ba年代gydF4y2BaGgydF4y2Ba亚历山大-伍尔兹gydF4y2Ba(SensorMedics, Bilthoven,荷兰)。gydF4y2Ba
血液采样gydF4y2Ba
所有血液样本由经验丰富的实验室技术人员通过肘前静脉穿刺抽取,受试者在椅子上休息15分钟。应用了最小的静态值。如稍后所述,样品在采集后立即进行处理。vWF、anti-Xa、TFPI和CRP的血浆置于80℃保存以备后期分析,WBCT、APTT和血小板则立即进行分析。gydF4y2Ba
凝血化验gydF4y2Ba
采血于枸橼酸管(0.5 mL, 0.129 mol·L)中进行APTT测定gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba柠檬酸钠)。通过混合等体积的血浆和Cephotest试剂(Nycomed, Oslo, Norway)来测定表面诱导的血浆凝固。混合物在37°C孵育6分钟并重新钙化。使用自动化设备(德国马尔堡Dade Behring凝固系统)记录凝固时间。结果表示为样品中凝血时间与20名健康志愿者凝血时间几何平均值之比。gydF4y2Ba
采血用于抗xa活性测定的cad管(0.5 mL柠檬酸钠和0.109 M含血小板聚集抑制剂(茶碱、腺苷、双吡唑)的柠檬酸)。血液2000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在20°C保存20分钟,然后在−80°C保存。用显色底物S‐2732S (Coatest肝素/肝素on Cobas Mira, Chromogenix, instrument Laboratory, CH Werfen, Barcelona, Spain)测定血浆中的抗xa活性。gydF4y2Ba
WBCT用血清计(International Technidyne Corporation, NJ, USA)测定。用hemchron®管(H106)采集血液(5ml)。凝结被玻璃表面激活。WBCT在两组中测量,并使用平均值。gydF4y2Ba
采血于柠檬酸管中,2000 ×离心2次,测定TFPIgydF4y2BaggydF4y2Ba在20°C下保存20分钟。血浆TFPI浓度(ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba酶联免疫吸附试验(ELISA) (ImubindgydF4y2BaTMgydF4y2Ba美国诊断公司(American diagnostics Inc., Greenwich, CT, USA)使用兔抗人TFPI多克隆抗体作为捕获抗体和针对TFPI分子部分的单克隆检测抗体。通过这种方法测定了脂蛋白结合和游离TFPI。gydF4y2Ba
采用枸橼酸试管采集血液,2000 ×离心,测定vWFgydF4y2BaggydF4y2Ba4°C保存20分钟。采用ELISA法(DAKO, Copenhagen, Denmark)测定vWF蛋白浓度。gydF4y2Ba
用乙二胺四乙酸(EDTA)管(5.9 mg EDTA·3 mL)采集血小板计数gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba).血小板血浓度由自动血液学分析仪(Technicon H*2, Bayer Diagnostics, Saint-Denis, France)测定。gydF4y2Ba
采集枸橼酸试管中用于CRP测定的血液,2000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C保存20分钟。用敏感的ELISA法(DAKO)测定CRP的蛋白浓度。gydF4y2Ba
分析gydF4y2Ba
数据以平均值±sd报告。数据被分析为曲线下面积(AUC)使用梯形规则。多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。显著性水平设为5%。当p‐值显著时,个体组采用Mann-Whitney U‐检验进行比较。数据也分析随时间的变化,弗里德曼重复测量方差分析的秩。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
肺功能gydF4y2Ba
所有的受试者都能进行身体体积测量动作,除了一个受试者不能被教测量所需的喘气gydF4y2Ba年代gydF4y2BaGgydF4y2Ba亚历山大-伍尔兹gydF4y2Ba.吸入肝素不影响任何肺功能变量。AUC之间的差异没有达到统计学意义(FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Bap = 0.992;FVC p = 0.982;PEF p = 0.887;gydF4y2Ba年代gydF4y2BaGgydF4y2Ba亚历山大-伍尔兹gydF4y2Ba: p = 0.807)。gydF4y2Ba
正如预期的那样,随着时间的推移,有轻微的生理增加,但这只达到了几个变量和剂量的统计意义(FEVgydF4y2Ba1gydF4y2Ba: 200000 IU, p=0.04;FVC: 200,000 IU, p=0.05; 300,000 IU, p=0.01;PEF: 100,000 IU, p=0.01;gydF4y2Ba年代gydF4y2BaGgydF4y2Ba亚历山大-伍尔兹gydF4y2Ba: 100,000 IU, p<0.001, 200,000 IU, p=0.03, 300,000 IU, p=0.03)。gydF4y2Ba
系统的影响gydF4y2Ba
激活部分凝血活酶时间gydF4y2Ba
给药吸入肝素未导致APTT的AUC发生任何显著变化。当随着时间的推移分析数据时,吸入肝素400,000 IU后出现显著变化(p=0.047),表明肝素最高剂量增加了APTT。峰值出现在最后一次雾化开始后1和3小时(图1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
Antifactor-XagydF4y2Ba
吸入肝素导致抗xa活性的AUC发生显著的、剂量依赖的变化(p=0.005)(图2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).吸入100,000 IU肝素可使抗xa活性从0.006±0.02增加到0.014±0.03 IU·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba.吸入200,000 IU肝素导致从0.016±0.04到0.046±0.07 IU·mL的微小但不显著的增加gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba吸入6 h后(p=0.1736)。吸入300,000 IU后,抗xa活性从0.006±0.02 IU·mL增加到0.062±0.07 IU·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba3 h后(p=0.1736)。吸入400,000 IU肝素可使抗xa活性从0.08±0.03增加到0.113±0.08 IU·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba给药后6 h (p=0.009)。抗xa活性降至0.032 IU·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba24小时以后。在吸入200000 IU (p=0.034)、300000 IU (p=0.004)和400000 IU肝素(p=0.002)后,Anti-Xa也随时间发生显著变化。gydF4y2Ba
组织因子途径抑制剂gydF4y2Ba
吸入1小时后,给予40万IU肝素导致TFPI从48.0±13.6增加到76.2±38.4 ng·mL,但TFPI的AUC没有显著变化(p=0.257)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).在所有剂量的肝素组中,TFPI随时间均有显著释放(100,000 IU, p=0.011;200000 IU, p = 0.011;300000 IU, p = 0.006;400000 IU, p < 0.001)。gydF4y2Ba
全血凝时间、血小板、血管性血友病因子和C反应蛋白gydF4y2Ba
吸入肝素未导致WBCT、血小板、vWF或CRP的AUC发生任何变化。当随着时间推移分析时,吸入100,000 IU肝素后CRP下降,但吸入任何其他剂量后无变化。其他变量都没有随时间变化。gydF4y2Ba
的不利影响gydF4y2Ba
没有志愿者报告肝素吸入后自发性、延长或过度出血或呼吸困难。gydF4y2Ba
两名志愿者分别吸入剂量2和3后,在吸入一天结束时抱怨头痛,这是一个非常温暖的一天,身体体积描记器温度≤28°C。一名志愿者在吸入第3剂后立即抱怨头痛。志愿者外出后,所有症状都消失了。一名志愿者在吸入第2和第3剂后抱怨喉咙有“干燥点”,但在第4剂后没有抱怨。没有其他副作用的报道。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
目前的研究是第一个确定肝素定量肺内剂量对肺功能和全身凝血的影响。这表明,吸入≤32,000 IU的未分离肝素作为LRT剂量是安全的,就肺功能和全身凝血而言。通过以10 L·min的流量驱动的侧流喷射雾化器提供该剂量gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba需要40万国际单位的肝素喷雾剂费用,正如之前的研究显示的那样gydF4y2Ba11gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
在本研究中,所有剂量的肝素吸入后多次记录肺功能,但没有发现对任何肺功能变量的影响。因此,吸入肝素对健康志愿者的肺功能是安全的。同样,先前的一项研究表明,单剂量吸入肝素对肺功能没有立即影响gydF4y2Ba12gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
本研究表明,吸入肝素通过增加抗xa和APTT对循环血液有影响,并对内皮细胞释放TFPI有影响,但未发现不良或抗炎作用(血小板、CRP)。在之前的一项研究中,我们注意到单次吸入后gydF4y2Ba99米gydF4y2Batc标记肝素,在体循环中仅发现少量肝素。本研究通过测定抗xa活性证实了这一发现。抗xa活性的小幅增加可能反映了这样一个事实,即大多数到达血液的肝素与内皮细胞有关。在口服肝素或气管灌注肝素的动物研究中已经证实了这一点gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
以前的一项研究观察到吸入低分子量肝素的抗xa活性呈剂量依赖性增加,最大值为0.343±0.196 IU·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,而对APTT无影响gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.在本研究中,抗xa有升高,最大值为0.113 IU·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,并且在给予最高剂量的未分离肝素后,APTT随时间的增加。然而,由于在两项研究中使用了不同的显色测定法和校准器,因此不能比较antixa的绝对水平。gydF4y2Ba
在另一项研究中,未分离肝素剂量分别为700、1,300和2,000 IU·kggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(喷雾器充电)采用超声雾化gydF4y2Ba12gydF4y2Ba.anti-Xa的反应是可变的,且与剂量无关,但平均而言,其幅度比本研究大得多(因子7)gydF4y2Ba与gydF4y2Ba1.5)的一个因素。这种差异很难解释,因为超声波雾化器的粒径分布比喷射雾化器的大,这导致他们的研究中估计的最大LRT剂量与本研究中最小的LRT剂量(7000 IU)相当。gydF4y2Ba
TFPI与内皮细胞管腔表面的蛋白聚糖结合,已知可通过静脉或皮下肝素释放。本研究表明,吸入肝素也可从内皮细胞释放TFPI。TFPI是外部凝血途径的反馈抑制剂;肝素提高了TFPI抑制组织因子/因子via复合物的速率。这一作用可能有助于肝素的抗血栓特性gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba.LMW吸入研究发现吸入54,000 IU LMW肝素(喷射喷雾器充电)后TFPI水平增加了35%gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.该研究中TFPI升高55%可能反映了未分离肝素的LRT剂量较大。gydF4y2Ba
吸入肝素对vWF无影响。它主要由内皮细胞产生,并作为原发性止血的一部分从这些细胞中释放出来。肝素与vWF结合,从而抑制血小板与内皮下结构的不可逆结合。这一机制可能是肝素给药出现出血副作用的原因之一gydF4y2Ba18gydF4y2Ba.与TFPI一样,vWF也从内皮细胞释放,但vWF浓度缺乏反应说明这两种因素的释放机制肯定不同。gydF4y2Ba
血小板浓度不受肝素剂量增加的影响。测量血小板,以证明肝素诱导的血小板减少的缺失。CRP基本不受肝素吸入的影响。吸入100,000 IU肝素后随时间的显著下降一定是偶然的。在没有炎症性疾病证据的正常健康志愿者中,CRP不会受到影响。gydF4y2Ba
受试者对TFPI和anti-Xa反应的巨大差异表明,关于吸入肝素在体内的命运的知识是不够的。如前所述,肝素储存在内皮细胞中,但肥大细胞和巨噬细胞也是肝素的储存体gydF4y2Ba19gydF4y2Ba.由于肝素也是合成和代谢的,药效学可能是复杂的。这些因素排除了这种给药途径以外的作用,作为呼吸道疾病的抗炎剂。gydF4y2Ba
目前的研究表明单剂量吸入肝素是安全的。因此,考虑到后一组受试者的LRT沉积可能更大,可以计划对吸入肝素在正常受试者和阻塞性气道疾病患者中的长期安全性进行研究。gydF4y2Ba
综上所述,吸入≤32000国际单位的未分离肝素作为下呼吸道剂量,未影响肺功能。在循环血液(抗因子- xa,激活部分凝血活酶时间)和内皮细胞作为组织因子途径抑制剂的释放上,可以显示出剂量依赖的抗凝作用。然而,这些变化很小,没有临床意义。因此,作者认为吸入这些或更小剂量的肝素对肺功能和全身抗凝是安全的。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者感谢利奥制药有限公司捐赠的肝素。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2000年12月19日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2001年10月1日。gydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司gydF4y2Ba