抽象的
五聚环蛋白(PTX)3涉及抗微生物防御,凋亡细胞清除和细胞外基质的稳定性。由于这些过程是慢性阻塞性肺疾病(COPD)改变,我们的目的是探讨该病患者PTX3表达。
通过免疫组化染色定量从不吸烟者、非COPD吸烟者和全球慢性阻塞性肺病倡议(GOLD) I、II和III-IV期COPD患者的肺组织中PTX3的表达。定量RT-PCR检测全肺组织mRNA表达。ELISA法测定诱导痰、血浆中PTX3浓度。
PTX3主要是小型气道和肺泡墙的局部局部。研究组之间的肺部,痰和血浆PTX3表达没有显着差异。然而,小气道中的PTX3表达在1 s中强制呼气量显着相关(r = 0.35,p = 0.004)。在肺泡壁中,PTX3表达与一氧化碳转移系数显着相关(r = 0.28,p = 0.04)。在痰中,PTX3水平与中性粒细胞的数量高度相关。最后,与轻度COPD相比,PTX3的全身水平倾向于严重COPD。
在COPD中,气流限制和减少的一氧化碳的转移系数与PTX3的肺间质表达降低。
由慢性阻塞性肺疾病(COPD)引起的发病率和死亡率在世界范围内呈上升趋势[1].世界卫生组织预测,COPD到2030年将其列为死亡的第四最重要原因[2].COPD患者肺功能的加速下降通常是进行性的,到目前为止,还没有医学治疗证明可以减缓这一过程。
COPD通常被认为是炎症性肺疾病,其中吸入的有害颗粒和烟雾触发先天性和适应性免疫应答的激活[3.].这种炎症反应有助于在结构和功能上改变小型气道和肺泡的四种主要机制:氧化应激,蛋白水解,细胞凋亡和重塑。这些机制导致COPD的两种主要病理特征:慢性支气管炎(具有缩小的小型气道)和肺气肿(肺泡壁的破坏)[4.那5.].
推动正在进行的炎症慢性阻塞性肺病的因素仍有待澄清。导致低档病毒感染和COPD患者小气道细菌定植受损的免疫防御机制,可以促进这个过程[6.-8.].此外,凋亡细胞清除的减少和自身免疫机制也可能在维持COPD患者肺部的破坏性炎症中发挥作用[9.-12].
五聚环蛋白(PTX)3是长PTXs,这是先天免疫应答的体液因子的成员。该分子是由不同类型的细胞(白细胞,成纤维细胞,内皮细胞,上皮细胞,软骨细胞,滑膜细胞和平滑肌细胞)产生。肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素1β是PTX3表达的主要诱导物[13-15].PTX3储存在嗜中性粒细胞的特定颗粒中,响应于微生物识别和炎症信号迅速释放。释放的PTX3部分在嗜中性粒细胞细胞外疏水膜中部分发现,其通过挤出的DNA形成[16].
类似于C-反应蛋白(CRP;哪个是短PTX),PTX3能够进行微生物的检测。此外,PTX3涉及凋亡细胞的间隙。除了先天防御功能外,PTX3还参与了细胞外基质的形成和稳定性。PTX3通过与TNF-α刺激的基因6(TSG-6)结合,用于透明质酸交联的锚定点,其是细胞外基质的主要成分[17那18].
在脓毒症和急性心肌梗死等炎症条件下,PTX3的血清浓度迅速增加[19那20.].增加的PTX3表达也存在于严重的慢性炎症条件下,例如类风湿性关节炎[21].相反,如在代谢综合征中检测到的低级别全身炎症,并不伴有全身PTX3水平的升高[22].PTX3在肺部感染和急性肺损伤中的作用是别的地方审查[23].
综上所述,PTX3具有几个可能与COPD发病机制相关的重要功能。我们假设PTX3在慢性阻塞性肺病中表达改变,导致慢性阻塞性肺病患者对低级别感染和自身免疫反应的易感性增加。除了免疫作用外,透明质酸交联减少,PTX3表达改变可能干扰结构过程,如重塑和肺气肿。
材料和方法
使用的材料和方法的详细描述可以在在线补充材料中找到。所有患者在参与研究前均签署书面知情同意书。根据《赫尔辛基宣言》,该研究由根特大学医院(根特,比利时)和Gasthuisberg大学医院(鲁汶,比利时)的医学伦理委员会批准。
肺组织
肺组织是从根特大学医院诊断患者患有孤零性肺肿瘤的患者的外科肺切除术,以及大学医院Gasthuisberg的肺癌肺癌肺癌患者。
用抗人PTX3抗体(克隆MNB4; Alexis Corporation,Lausen,Switzerland)染色石蜡包埋肺组织切片。通过计算机图像分析系统(KS400; Zeiss,Oberkochen,Germany)分析了没有软骨和相邻肺动脉的空气道。使用两个独立观察者的半定量评分测定PTX3在肺泡中的表达,用于临床数据。
用TaqMan基因表达测定法(Applied Biosystems公司,福斯特城,CA,USA)分析靶基因(PTX3和TNF-α)和在肺组织的mRNA参考基因的表达。RT-PCR一式两份地使用稀释的cDNA模板进行,并且LightCycler480探针主混合物(罗氏公司,巴塞尔,瑞士)。
痰液诱导和加工
如前所述进行痰诱导和处理[24].通过ELISA用于人PTX3(Alexis Corporation)的分析样品。
血浆PTX3和CRP水平
通过ELISA对人PTX3(Alexis Corporation)和CRP(R&D Systems,Abingdon,英国)的高敏感性ELISA分析样品。
统计分析
使用SPSS软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。通过Kruskal-Wallis试验评估多种研究组之间的差异,然后使用Mann-Whitney U-Test进行组到组比较。
使用Pearson相关系数获得的临床数据和对数转换的图像分析的数据之间的相关性。线性回归被用来研究在1秒(FEV图像分析数据和用力呼气量之间的关联1).的<0.05的p值被认为是显著。
结果
不吸烟者、非COPD吸烟者和COPD患者肺中PTX3的定量分析
小气道PTX3蛋白表达的定量
提供了研究人群的特征表格1.这些人口由66名患者组成:从不吸烟(n = 10),没有copd(n = 16)的吸烟者,以及慢性阻塞性肺病(金)阶段I(n = 13),II(n = 14)和III-IV(n = 13)。
无慢性阻塞性肺病吸烟者和慢性阻塞性肺病患者肺组织中PTX3染色的代表性切片如图所示图1 e和f分别。使用计算机化图像分析,在小气道的墙壁中测量PTX3的表达水平。在严重且非常严重的COPD中,与轻度COPD和没有COPD的受试者相比,小气道壁上的PTX3水平往往。研究组之间的PTX3表达没有显着差异(图2一个).然而,PTX3(作为总气道壁的总染色面积的面积)与后支气管扩张剂FEV显着相关1%预测(Pearson相关系数r = 0.35,p = 0.004)(图2 b)和fev1/强迫肺活量比(r=0.27, p=0.031)(数据未显示)。当基底膜长度的阳性染色面积正常化时,FEV之间的相关性1PTX3表达仍然显著(r=0.31, p=0.012)。目前吸烟者和戒烟者之间的PTX3表达没有显著差异(数据未显示)。PTX3表达与临床和生化指标的单因素分析显示在表2.PTX3表达与气道阻塞相关,但与其他生物学指标无显著相关性。
通过线性回归模型(表3).PTX3表达水平与FEV之间的关联1在调整变化的变量后保持重大意义,改变了FEV的点估计1乘> 10%(用吸入的皮质类固醇处理,用口服皮质类固醇治疗和退出吸烟以来的时间)。
肺动脉PTX3蛋白表达的定量分析
使用图像分析测量PTX3在邻近小型气道附近的肺动脉中的表达。肺动脉壁中的PTX3表达在研究组之间并不不同(在线补充材料中的E-1)。PTX3表达的水平随着一氧化碳的肺的传递系数而显着相关(K.CO.) (r=0.30, p=0.039)(图在线补充资料中的E-2)。
诱导痰中PTX3的表达
研究人群的特征如e-表3在在线补充材料和诱导的痰上清液中PTX3 ELISA的结果如在线补充材料的E表5中所示。研究组之间没有显着差异。fev之间没有相关性1诱导痰上清中PTX3的浓度(数据未显示)。诱导痰中PTX3水平与中性粒细胞数量显著相关(r=0.66, p<0.001) (图4 b).
ptx3等离子体中的表达
研究人群的特征在于在线补充材料中的E表4中。与血浆中的高敏感性CRP水平相反,研究组之间的血浆PTX3的浓度不差(在线补充材料中的E表5)。血浆PTX3浓度与FEV无关1(r=0.08, p=0.56)(图E-4在线补充材料)。而在COPD亚组中,循环PTX3水平与FEV显著相关1(r = 0.37,p = 0.04)。相反,血浆CRP水平与FEV显着相关1(r = -0.32,p = 0.014)(数据未显示)。
讨论
据我们所知,这是第一次研究PTX3在人肺组织切片中的表达。重要的是,这项研究揭示了气流限制和减少之间的显著关联K.CO.PTX3在COPD中的肺部表达。
本研究证实了PTX3在人肺组织的mRNA和蛋白水平的表达。PTX3在肺白细胞和II型肺细胞中均有表达,与既往一致体内小鼠和人体细胞的研究体外[25-28].除了PTX3在炎性细胞和肺泡上皮细胞中,还观察到PTX3的重要细胞外位置,特别是在牙槽壁上以及肺动脉壁中的小型气道的龈下区域和外膜上。PTX3的间质定位模式以前在心肌和肾脏中报道了[29那30.].
气道壁中PTX3蛋白的平均表达水平在研究组之间没有显著差异。然而,与未受气流限制的受试者相比,COPD患者小气道中PTX3表达明显降低。确实,FEV之间存在显著的相关性1(小气道阻塞的标志)和小气道壁上PTX3的表达。这标志着FEV的独立联合1小气道中的PTX3表达将低水平的PTX3级别与COPD的最重要特征联系起来:气道阻塞。即使在调整可能的混乱时,这种关联也仍然很重要。
相比之下,在肺动脉和肺泡壁中PTX3的表达水平方面,研究组之间没有显著差异。虽然这一发现一开始可能令人惊讶,但有一个合理的解释:研究小组是由GOLD分类定义的,它使用FEV1对主题进行分类。然而,较低的肺泡和血管PTX3表达与减少相关K.CO.,这是肺气肿的标志。由于慢性阻塞性肺病是一种异质性疾病,严重慢性阻塞性肺病(即。严重的气流限制)可具有各种水平的肺气肿(例如,有限程度的肺气肿,因此,相对正常的水平K.CO.和ptx3)。
在mRNA水平下,PTX3表达与肺功能参数无关。乍一看,这种结果似乎与PTX3蛋白表达水平的结果相矛盾。但是,有几种可能的解释。首先,在总肺组织样品中测量mRNA水平,其包含肺中存在的不同结构,例如血管,气道,肺泡室和淋巴卵泡。细胞类型的整体混合物可以掩盖小气道墙壁和肺泡室中PTX3水平的具体下降。其次,COPD患者的转录后调节改变可能导致蛋白质水平的PTX3减少,但不在mRNA水平下。
当在没有气流限制的COPD和受试者的患者诱导患者的PTX3水平时,我们发现没有与FEV的关联1.P.Izzichini.等等。[31]还在诱导的痰中检测到PTX3。与我们的研究结果相比,pIzzichini.等等。[31]发现慢性阻塞性肺病患者的痰中PTX3水平高于对照组。PIzzichini.等等。[31比我们研究中PTX3的浓度要低。这些差异的原因可能是多方面的,包括患者选择和痰处理的差异。在我们的研究中,诱导痰中PTX3的浓度与痰中中性粒细胞的百分比相关。这一证据表明,痰中PTX3的水平很大程度上依赖于中性粒细胞颗粒中这种固有分子的储存。这一发现与先前有关中性粒细胞储存PTX3的报告相一致[32].
在全身循环中,PTX3水平与COPD的疾病严重程度没有显着相关。这与COPD患者的血浆CRP显着增加相反,证实了对COPD中的全身炎症的报告[33].重要的是,在COPD患者组中,血浆PTX3水平与FEV显著正相关1再次观察到,表明患者患有更高级的COPD阶段的循环PTX3水平降低。
总之,我们证实了在肺间质和循环PTX3蛋白水平的降低时临床上稳定的条件下测定与增加的气道阻塞和肺气肿在COPD相关联。COPD的肺功能参数和PTX3的表达之间的这种结合是通过的因果关系决不证据。事实上,可以在两个方向上产生的假设:COPD可诱导的PTX3的耗尽(通过在COPD PTX3的增强的蛋白水解破坏)和/或PTX3的降低的表达可能有助于COPD的发病机制。我们的研究提供的证据表明,在肺部PTX3的下降更可能是COPD的过程的结果,作为PTX3蛋白水平降低主要是慢性阻塞性肺病的更高级阶段(GOLD II-IV)。此外,由于没有在mRNA水平进一步支持了肺功能参数和PTX3表达之间有明显的联系在COPD PTX3的次级耗尽的概念。最后,我们小组最近的一项研究表明,PTX3基因敲除小鼠长期暴露于香烟烟雾中也有类似的肺部炎症和肺气肿分数作为它们的野生型对照,在COPD的发病机制对PTX3缺乏的主要作用争论[34].
这些发现不排除患有COPD患者肺部PTX3蛋白水平的二次降低的可能性,显着促进了不同机制的人类疾病的进展,包括结构和炎症。如前所述,低水平的间质PTX3可能导致透明质酸交联与细胞外基质的不稳定性降低,增强肺气肿和持续炎症的透明低分子量透明质酸片段。实际上,几项研究描述了COPD中肺细胞外基质组分的改变[35-37].
降低循环PTX3水平和降低的间质PTX3可以有助于抗微生物防御受损,特别是在侵入性感染期间。COPD患者的这种有益的先天免疫功能与侵入性肺部感染的风险增加相容aspergillus fumigatus.和假单胞菌铜绿假单胞菌在这些患者中[38-40].众所周知,PTX3参与凋亡细胞的清除,该分子水平的降低可能导致COPD中凋亡细胞的积累[41那42,这是COPD发病中自身免疫成分的一个可能的危险因素。最后,由于PTX3在炎症期间对中性粒细胞内流有抑制作用[43[降低的肺PTX3水平可有助于不成比例的中性粒细胞流入,对肺组织有破坏性后果。
从COPD肺外效应的角度来看,与CRP相比,血浆PTX3作为检测全身炎症的标志物似乎并不有用。在严重炎症反应的情况下,如侵袭性感染和败血症,已经观察到PTX3的全身性水平升高[44].我们假设在慢性阻塞性肺疾病加重和侵袭性肺部感染期间,由于中性粒细胞储存的PTX3迅速释放和白细胞被吸引到炎症粘膜区域而增加,PTX3浓度将在局部和全身迅速增加。这一课题还需要进一步的研究。
有不同的组件有助于这项研究的实力。首先,本研究检测了PTX3,在不同的大型研究群体中的mRNA和蛋白质水平,涵盖健康受试者和具有不同阶段的患者。其次,在不同的隔室(痰,小气道,肺泡和血浆)中评估PTX3的表达,导致与呼吸道疾病相关的PTX3表达的广泛覆盖。第三,调整了人肺部较低的PTX3水平随着气流限制的较低PTX3水平的关联,以实现可能的混淆,表明与疾病的真实关系而不是旁观者效应。最后,在不同隔室中的PTX3的表达可以与已知的PTX3生产(TNF-α)和储存(痰中性粒细胞)的生理学相关联。
然而,该研究有几个局限性,需要解决。首先,为了评估PTX3在人肺组织中的表达,我们使用了孤立性肺病变患者的样本,这可能会影响急性期蛋白的表达。为了尽量减少肿瘤的影响,我们非常小心地从远离后梗阻性肺炎的病变处获取组织样本。其次,仅对COPD最轻阶段的不同人群的痰液和血浆中PTX3水平进行了测量,未提供终末期COPD中痰液和全身PTX3水平的信息。
结论
在这项研究中,我们描述了PTX3在人肺中的表达定位,并揭示了肺PTX3表达与气流限制和肺气肿等肺功能参数之间的正相关。这些数据表明COPD伴随着PTX3水平的显著下降,特别是在小气道间质室,这可能具有重要的结构和功能炎症后果。PTX3在COPD中的预测价值及机制作用有待进一步研究。
致谢
作者谨感谢K. de Rijck,A.Neesen,I. de Borle,K. de Saedeleer,E. Castrique,M. M. Mouton,P. Degryze A.歌舞团和S. Verschraeghen(所有呼吸系统部门,除了根特大学医院,格伦,比利时)为这项工作的技术贡献,以及H.Mindendorp,F. Vandewalle,A. Delporte和T. Verstraete(所有呼吸医学部门,根特大学医院),以支持数据管理。作者还要感谢G. Verlementen(呼吸医学部,大学医院Gasthuisberg,天主教鲁汶大学,Leuven大学,比利时),用于为COPD金阶段IV提供肺组织样本。作者您要感谢M. PRAET(病理学部门,跟根大学医院),用于提供阳性对照免疫组织化学染色的样品。
脚注
对于编辑评论见795页.
本文提供了补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
该工作得到了法兰德斯(FWO Vlaanderen;研究项目G.0011.03,G.0195.09N和G0343.01N)的支持基金和G.051504,从根特大学(比利时根特)的协同研究倡议,项目授予01251504。G.R.Van Pottelberge是法兰德斯科学研究基金博士研究员。K.R.布拉克是法兰德斯科学研究基金会的博士后研究员。
感兴趣的语句
G.R的兴趣陈述。van pottelberge和G.G.布鲁塞尔可以找到www.www.qdcxjkg.com/site/misc/statements.xhtml
- 收到了2010年8月27日。
- 公认2011年8月9日。
- ©2012年