文摘
突变基因编码骨形成蛋白(BMP)受体2型(BMPR-2)已报告在肺动脉高血压(PAH),但它们的功能相关性仍不完全理解。
骨形态发生蛋白受体表达在人类肺部和评估培养肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)分离出19个特发性PAH患者和9个遗传PAH患者BMPR-2突变。BMP4-treated PASMCs评估Smad和p38增殖作用的蛋白激酶(MAPK)信号与有丝分裂和细胞凋亡有关。
肺组织和PASMCs遗传PAH患者提出减少BMPR-2表达式和变量增加BMPR-1A BMPR-1B表达式,虽然不那么重要减少BMPR-2表达式在PASMCs特发性肺动脉高压病人。遗传PAH PASMCs没有显示出增加的磷酸化Smad1/5/8 BMP4的存在,实际上p38MAPK通路激活。个人反应不同的从一个突变到另一个。PASMCs PAH患者提供在体外增殖的模式,这可能被BMP4在特发性肺动脉高压而不是遗传的多环芳烃。PASMCs特发性多环芳烃和多从遗传多环芳烃提出BMP4-induced细胞凋亡的抑制作用。
大多数异构BMPR-2变异与缺陷Smad信号补偿p38MAPK信号激活,占PASMC增殖和凋亡不足。
肺动脉高压(PAH)是一种罕见疾病预后不良和神秘的病理学特征是一个进步的肺血管阻力增加和最终的右心室衰竭1。突变的骨形成蛋白(BMP)受体2型(BMPR-2),成员转化生长因子(TGF) -β受体家族,已报告在一个高比例的遗传形式的疾病,患者在10 - 30%的零星的特发性PAH患者2。到目前为止,超过200种不同BMPR-2描述了突变,基因分布广泛,大多数预测过早截断的成绩单3。BMPR信号包括heterodimerisation两跨膜受体丝氨酸/ threonine-kinase链,持续活跃BMPR-2和相应的1型受体BMPR-1A / ALK3或BMPR-1B / ALK64,5。与配体的相互作用,例如BMP4, BMPR-2磷酸化的激酶结构域激活相应的BMPR-1,进而启动细胞内信号通过一组的磷酸化BMP-restricted Smad蛋白质(Smad1/5/8)。随后,这些磷酸化和Smad4 Smads联系,把细胞核,然后调节靶基因的转录。替代Smad-independent涉及增殖信号通路蛋白激酶(MAPK),包括细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2,小君n端激酶(物)和p38MAPK,已报告是由骨形态发生蛋白配体激活6。由此产生的不平衡被认为是引起肺动脉平滑肌细胞的增殖(PASMCs),肺小动脉的重塑在多环芳烃的主要组成部分1。
感兴趣的,组织病理学和临床多环芳烃有或没有的照片BMPR-2突变出现类似,除了早期发病的年龄,更严重的血液动力学的妥协在诊断和血管舒张药测试不太常见的可逆性7,8。因此,功能的后果BMPR-2突变仍不完全清楚,但可能会提出他们的表型影响可能随类型的突变或交互与其他信号通路。
之前就有报道称,PASMCs特发性PAH患者存在一个在体外增生性表型9,10。在目前的研究中,我们调查的影响BMP4 Smad和p38MAPK信号与有丝分裂和细胞凋亡在培养PASMCs隔绝特发性肺动脉高压病人没有检测到突变和遗传PAH突变患者。结果符合关键作用的概念对BMP / Smad预防异常生长和凋亡的信号PASMCs迷失在大多数但不是所有类型的突变。
方法
组织样本
肺组织和肺血管在肺移植采样和测序筛查BMPR-2突变。与医疗记录确认再确认后,PAH患者隔离分成两组,根据突变的存在与否。这两个组分别称为遗传多环芳烃(n = 9)和特发性多环芳烃(n = 19)患者。肺标本也采样对照组(n = 10)在肺叶切除或全肺切除术治疗疑似局部肺肿瘤。这些对照组没有承担任何BMPR-2突变和多态性。
所有PAH患者在纽约心脏协会功能类III或IV和处理注射。epoprostenol。超音波检查发现对照组,进行手术排除肺动脉高压、肺动脉和采样距离肿瘤区域。这项研究是通过当地的机构审查委员会(伦理委员会,CPP巴黎七世,比塞特尔勒,法国),和病人提供知情同意前对该研究的贡献。
筛查突变基因编码BMPR-2受体
突变BMPR-2基因在肺标本PAH (n = 28)患者如前所述的筛选11,12。短暂,整个蛋白质编码区域(对应于外显子序列的1-13BMPR-2从基因组DNA样本基因)放大与特定的引物PCR。PCR产品然后在1%琼脂糖凝胶电泳分离和纯化使用QIAquick PCR净化设备(试剂盒、Courtaboeuf、法国)。放大和纯化片段测序现代dye-terminator cycle-sequencing系统(ABI棱镜377,优秀的应用生物系统公司,Courtaboeuf)。
人类文化PASMCs和肺微血管内皮细胞
人类PASMCs培养的外植体肺动脉直径-10毫米(1.5)来源于之前描述的病人组移植对于遗传和特发性多环芳烃,并从控制。PASMCs培养在10%胎牛血清(FCS)在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)和段落之间使用3和6、如前所述13。培养PASMCs的表型是评估表达阳性的收缩和细胞骨架蛋白,包括平滑肌α-actin(α-SMA),肌间线蛋白和vinculin13。
人类肺微血管内皮细胞(胸大肌)是通过dispase我(罗氏诊断、Penzbeg、德国)消化紧随其后immunomagnetic净化与抗血小板内皮细胞粘附molecule-1 (CD31)单克隆antibody-labelled Dynabeads (Dynal生物技术、贡比涅、法国)的一个片段遗传和特发性肺动脉高压患者的肺组织隔离和控制,如前所述9,14。血管内皮细胞的表型特征,佩奇与乙酰化低密度脂蛋白结合荧光示踪carbocyanine染料(1,1′-dioctadecyl-3, 3、3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine高氯酸(Dil-Ac-LDL);Tebu Le Perray雷诺,法国)和内皮特异性抗体凝集素染色Ulex europaeusagglutinin-1 (UEA-1;Sigma-Aldrich欧文分校、英国)15。实验还进行与单克隆抗体对肌间线蛋白和波形蛋白(Dako、斯特鲁普、丹麦)。与阳性染色细胞Dil-Ac-LDL UEA-1和负染法肌间线蛋白和波形蛋白作为内皮细胞构成> 95%的压电陶瓷文化。佩奇段落之间使用3和69,14。
RNA提取和cDNA准备
总RNA制备snap-frozen人类肺组织样本(体重100毫克)均化根据Chomczynski和萨基的方法16,使用试剂盒试剂(表达载体、- pontoise、法国)。总RNA提取growth-arrested人类PASMCs和胸大肌的主要文化使用试剂盒RNeasy迷你包(试剂盒),根据制造商的指示。RNA浓度是由标准光谱光度测量的技术和RNA的目视检查完整性评估ethidium bromide-stained变性琼脂糖凝胶。第一链cDNA合成进行了使用上标二世逆转录酶系统(生活技术,Inc .,卡尔斯巴德、钙、美国),如前所述9,14。
实时定量聚合酶链反应
实时定量(RTQ) pcr引物设计使用计算机程序Primer3(底漆表达软件,应用生物系统公司)人类BMPR-1A BMPR-1B, BMPR-2,伯灵顿和Bcl2 mRNA, 18 s核糖体RNA作为看家基因。为了避免不适当的放大残余基因组DNA, intron-spanning引物。RTQ-PCR于7000年ABI棱镜进行了一式三份(美国应用生物系统公司,培育城市,CA), 12.5的混合物μL Sybr绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司、沃灵顿、英国),300海里(每个)底漆和5μL稀释25μL模板DNA的总量。信号检测和分析的结果进行ABI棱镜7000序列检测软件(应用生物系统公司)。相对量化是通过比较来完成的2-ΔΔCt方法通过正常化18 s核糖体RNA。伯灵顿的化验和Bcl2 mrna, PASMCs被播种和同步。然后细胞暴露于BMP4 (100 ng·毫升−1)为4 h,然后用于信使rna提取和RTQ-PCR。
蛋白质提取和BMPR-1A, BMPR-1B和BMPR-2西方墨点法
蛋白质提取snap-frozen组织样本重量(100毫克)的均化适当均衡的缓冲区(完成迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏诊断,曼海姆,德国)PBS和0.1% Triton x - 100)。匀浆离心机在4°C和上层的收集。蛋白质浓度测定后使用布拉德福德的方法1740μg肺样本的蛋白质在3×resuspended Laemmli缓冲区,煮5分钟,10%丙烯酰胺凝胶电泳分离。蛋白质是electrophoretically转移到硝酸纤维素(Sigma-Aldrich欧文分校、英国)在室温下1 h。阻塞后5%牛血清白蛋白(BSA)在1×渐变(T) tbs(10毫米Tris-HCl pH值8.0,150毫米渐变20氯化钠和0.1%)2 h在室温下,薄膜在室温下与T-TBS洗了三次为5分钟。膜与山羊反BMPR-1A孵化,BMPR-1B或BMPR-2抗体(1:50 0;研发系统,明尼阿波利斯,美国)在4°C一夜之间摇摆。然后膜清洗三次5分钟和二次抗体孵育(兔抗体免疫球蛋白G (Ig)结合辣根过氧化物酶;Dako、斯特鲁普、丹麦;室温下)1 h。免疫反应性的乐队被发现使用增强化学发光免疫印迹分析系统(Amersham法玛西亚生物科学,小都,英国),激光微量化。相对量化是由正常化β-actin (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。
免疫印迹BMP信号通路
PASMCs镀新鲜10% FCS / DMEM培养基24 h,然后采用无血清quiesced 48 h。BMP4 (100 ng·毫升−1)或车辆被添加到细胞为20分钟。蛋白质被洗涤细胞收获冷PBS和300年被刮μL 1×示例加载缓冲区(Tris-HCl pH值7.4,氯化钠,氟化钠、焦磷酸钠(在25毫米),钒酸钠(1毫米),EDTA, EGTA(2.5毫米),phenylmethylsulfonyl氟化物(1毫米),aprotinine, leupeptine(在5μg·毫升−1)、SDS、脱氧胆酸盐和NP-40冰(0.50%))。样品被储存在-20°C。测定蛋白质浓度后,布拉德福德的使用方法17、样品(20μg)在3×resuspended Laemmli缓冲区,煮5分钟在95°C,对丙烯酰胺凝胶电泳(10%)。免疫印迹分析进行单克隆鼠标反phospho-p38如上所述MAPK (Thr180 / Tyr182)(1:1000;细胞信号技术公司,丹弗斯,妈,美国),多克隆兔子反phospho-Smad1(Ser463/465)/ Smad5(Ser463/465)/ Smad8(Ser426/428)(1:1000;细胞信号技术Inc .)和多克隆山羊反总Smad 1/5/8 (1:1000;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。相对量化是由正常化总Smad1/5/8 phospho-Smad1/5/8和β-actin p38MAPK (Sigma-Aldrich,里昂,法国)。治疗100 ng·毫升−120分钟选择基于BMP4浓度关系的初步研究能力激活下游信号通路,抑制促生长活性PASMCs促有丝分裂的药物18,19。
PASMC增殖化验
人类的发展培养PASMCs是由(3H]胸腺嘧啶核苷掺入,代表DNA合成。简而言之,PASMCs被播种在24-well板的密度在10% FCS / DMEM 5×104细胞·好−1并允许为24小时坚持。中被删除和细胞受增长逮捕与血清DMEM孵化。48小时后,介质被新的取代DMEM含有10% FCS或10 ng·毫升−1血小板源生长因子(PDGF)在100 ng·毫升的存在与否−1BMP4。PASMC增殖也在应对评估10% FCS和10 ng·毫升−1PDGF孤单。对于每一个条件,3H]胸苷(0.6μCi·毫升−1)被添加到每个。孵化24 h后,细胞与PBS洗两次,冰冷的对待10%三氯乙酸和0.1 N中和氢氧化钠(0.5毫升·−1)。(3H]胸苷并入DNA计算和报告每好每分钟计数。
细胞凋亡检测
评价是由流式细胞术分析细胞凋亡DNA含量的碘化propidium合并和RTQ-PCR伯灵顿/ Bcl2比率的分析。DNA流式细胞术分析内容,PASMCs被播种和治疗24小时用新鲜血清DMEM BMP4的存在与否(100 ng·毫升−1)。培养基是删除并保存。细胞被trypsinised,回到中他们已经在然后离心机。细胞被洗两次在冰冷的PBS和存储在75%乙醇4°C。固定细胞离心,用PBS和孵化200μL核糖核酸酶(1毫克·毫升−1;英杰公司)和200μL propidium碘(1毫克·毫升−1;法国里昂Sigma-Aldrich)。在室温下细胞孵化1 h在黑暗中。样品被流式细胞术分析。单个事件记录使用的红色荧光在488 nm激光激发波长和发射波长610 nm, DNA指数测量。伯灵顿/ Bcl2比决心,PASMCs被播种,同步和治疗4 h如上所述。信使rna提取、互补脱氧核糖核酸合成和RTQ-PCR进行决定性pro-apopototic Bax的表达和抗凋亡Bcl2基因与18岁作为看家基因相比,如上所述。
结果
临床和PAH患者的血液动力学的特征
PAH患者之间没有差异BMPR-2突变(41±2岁与39±3年),女性男性性别比例(10/9与5/4)、平均肺动脉压(62±2与63±3毫米汞柱),肺血管阻力(20±1与20±2 U·m−2)、心脏指数(2.19±0.09与2.41±0.25 L·分钟−1·米−2)。没有一个病人出现可逆性在血管舒张药测试。
识别和描述BMPR-2突变
在13个外显子编码的种系突变BMPR-2被确定在9个遗传PAH患者(图。1⇓)。三个杂合的无意义突变被发现外显子1 (W16X), 2 (W70X)和3 (S107X),编码细胞外BMPR-2域的一部分。一个总删除外显子的突变包括1(Δexon1)。两个突变被发现在第5外显子,编码BMPR-2的跨膜域:一个杂合的无义突变(E195X)和一个造成损失的22日英国石油公司(bp del 22日)。两个杂合的错义突变和一个无义突变分别确定了外显子7 (S301P)和11 (R491W和Q495X), BMPR-2的激酶结构域编码部分。没有ALK-1突变被发现在PAH患者和没有突变。
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/34/5/1100/F1.medium.gif)
病人的遗传特征。的示意图表示骨形态形成蛋白受体2型(BMPR-2)功能域,展示的范围BMPR-2突变研究研究表明氨基酸替换或无意义突变的性质(X)。
肺和细胞BMPRs的表情
BMPR-1A mRNA和蛋白的表达增加在肺组织遗传和特发性患者2(无花果⇓3,⇓),但mRNA表达只是增加PASMCs特发性PAH患者(图2 b⇓),不是胸大肌不同于控制的遗传和特发性肺动脉高压病人(图2摄氏度⇓)。BMPR-1B mRNA的表达增加从遗传PASMCs PAH患者只有(图2 e⇓)。BMPR-2信使rna和蛋白质的表达是减少肺组织从遗传多环芳烃(无花果2 g⇓和3 c⇓),信使rna表达减少PASMCs遗传和特发性多环芳烃(图2 h⇓),而不是不同于控制在胸大肌(图。2我⇓)。然而,随着表示相对较大扫描电镜值,增加表达式BMPR-1A BMPR-1B和减少表达的BMPR-2 PASMCs变化极大地从一个突变到另一个,没有一致的模式(图。4⇓)。之间不存在相关性肺血管阻力和肺的表达BMPR-1A, BMPR-1B和BMPR-2蛋白质。
相对a - c)骨形态形成蛋白受体1型(BMPR-1A) d-f BMPR-1B和胃肠道)BMPR-2 mRNA的表达。整个肺组织样本(a、d、g),培养肺动脉平滑肌细胞(PASMCs;b, e和h)和肺微血管内皮细胞(胸大肌;c、f和我)从控制(□),肺动脉高血压(PAH)患者没有(▪;特发性多环芳烃)和用BMPR-2突变(▓;实时定量PCR遗传PAH)进行了评估。结果表示为±扫描电镜。统计差异被Mann-Whitney测试评估。*:p < 0.05与控制条件;* * *:p < 0.001与控制条件;#:p < 0.05特发性多环芳烃与可遗传的PAH条件;# # #:p < 0.001特发性多环芳烃与可遗传的多环芳烃的条件。
相对)骨形态形成蛋白受体1型(BMPR-1A), b) BMPR-1B和c) BMPR-2整个肺组织样本中蛋白表达控制(□),肺动脉高血压(PAH)患者没有(▪;特发性多环芳烃)和用BMPR-2突变(▓;可遗传的多环芳烃)被西方墨点法评估。结果表示为±扫描电镜相对于β-actin和表达式。统计差异被Mann-Whitney测试评估。*:p < 0.05与控制条件;#:p < 0.05特发性多环芳烃与可遗传的多环芳烃的条件。
![图4 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/34/5/1100/F4.medium.gif)
相对)骨形态形成蛋白受体1型(BMPR-1A), b) BMPR-1B和c) BMPR-2 mRNA表达肺动脉平滑肌细胞与遗传肺动脉高血压患者自然发生的BMPR-2突变(Δexon1, G / A = W16X, G / A = W70X C / G = S107X, G / T = E195X, 22日英国石油公司德尔,T / C = S301P C / T = R491W和C / T = Q495X)。实时定量PCR结果评估。
微分的影响BMP4 Smad和p38MAPK信号
BMP4 (100 ng·毫升−120分钟)诱导激活(磷酸化)的Smad1/5/8 PASMCs与特发性肺动脉高压病人隔离和控制(图5所示⇓),这表明在这些细胞BMP信号的传输是完好无损。相比之下,没有BMP4-induced磷酸化Smad1/5/8观察PASMCs从遗传的多环芳烃,除了bp del突变(图22。5 c⇓)。BMP4激活p38MAPK信号从遗传PASMCs PAH患者(除了PASMCs 22 bp del突变)而不是从特发性PAH患者或控制(图。6⇓)。
Smad 1/5/8磷酸化诱导骨形成蛋白(BMP) 4。90%汇合的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)与控制(n = 10),肺动脉高血压(PAH)患者没有(特发性多环芳烃;n = 10)和骨形态发生蛋白受体2型(BMPR-2)突变(遗传的多环芳烃;n = 9)与100 ng·毫升刺激−1BMP4 20分钟,其次是总蛋白的溶解。)代表西方的屁股phospho-Smad 1/5/8和总Smad 1/5/8显示加载。b)的微phospho-Smad 1/5/8和总Smad 1/5/8乐队从西方滴控制(□),特发性多环芳烃(▪)和遗传多环芳烃(▓)PASMCs。结果提出了相对phospho-Smad1/5/8蛋白表达率和总Smad1/5/8带强度。数据意味着±扫描电镜。* * *:p < 0.001与基底条件nonstimulated PASMCs;# # #:p < 0.001与值PASMCs隔离控制与BMP4刺激;¶:p < 0.05与值从特发性PAH患者刺激BMP4 PASMCs孤立。c)的相对微比phospho-Smad 1/5/8 PASMCs孤立的定义自然发生的BMPR-2突变患者(Δexon1, G / A = W16X, G / A = W70X C / G = S107X, G / T = E195X, 22日英国石油公司德尔,T / C = S301P C / T = R491W, C / T = Q495X)。░:nonstimulated;与100 ng·毫升▒:刺激−1BMP4。
p38增殖蛋白激酶(MAPK)磷酸化诱导骨形成蛋白(BMP) 4。90%汇合的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)与控制(n = 10),肺动脉高血压(PAH)患者没有(特发性多环芳烃;n = 10)和骨形态发生蛋白受体2型(BMPR-2)突变(遗传的多环芳烃;n = 9)与100 ng·毫升刺激−1BMP4 20分钟,其次是总蛋白的溶解。)代表西方墨迹phospho-p38和β-actin显示加载。b)微phospho-p38和β-actin乐队从西方滴控制(□)、特发性多环芳烃(▪)和遗传多环芳烃(▓)PASMCs。结果提出了相关蛋白表达phospho-p38和β-actin带强度的比例。数据意味着±扫描电镜。* * *:p < 0.001与基底条件nonstimulated PASMCs;# # #:p < 0.001与值PASMCs隔离控制与BMP4刺激;¶:p < 0.05与值从特发性PAH患者刺激BMP4 PASMCs孤立。c)相对微密度比的phospho-p38MAPK PASMCs隔绝自然发生的定义BMPR-2突变患者(Δexon1, G / A = W16X, G / A = W70X C / G = S107X, G / T = E195X, 22日英国石油公司德尔,T / C = S301P C / T = R491W, C / T = Q495X)。░:nonstimulated;与100 ng·毫升▒:刺激−1BMP4。
BMP4对PASMC增殖的影响引起的血清和PDGF的治疗
PASMCs孤立从遗传和特发性PAH展出增殖,增加评估的(3H]胸腺嘧啶核苷掺入,10%血清的存在而不是10 ng·毫升−1PDGF(图7所示⇓)。添加BMP4诱导的抑制(3H]胸腺嘧啶核苷掺入血清-和PDGF-treated PASMCs特发性多环芳烃和控制,但不是从遗传PASMCs PAH患者。缺乏BMP4-induced抑制扩散在PASMCs遗传的PAH患者,除了22 bp del突变的患者。
基底(3H]胸腺嘧啶核苷掺入在肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)来源于控制(□;n = 10),肺动脉高血压(PAH)患者没有(▪;特发性多环芳烃;n = 19)和骨形成蛋白(BMP)受体2型突变(▓;可遗传的多环芳烃;n = 9)在回应孵化有或没有BMP4 (100 ng·毫升−1),在10%胎牛血清(FCS)或10 ng·毫升−1血小板源生长因子(PDGF)。数据意味着±扫描电镜。* *:p < 0.01与从控制PASMCs孤立;* * *:p < 0.001与从控制PASMCs孤立;#:p < 0.05与基底条件BMP4-nonstimulated PASMCs;# # #:p < 0.001与基底条件BMP4-nonstimulated PASMCs。
BMP4对PASMC凋亡的影响
流式细胞仪分析显示BMP4(10和100 ng·毫升−124 h)凋亡率增加PASMCs特发性PAH患者和控制但在较小程度上PASMCs特发性多环芳烃,不从遗传PAH患者(图8⇓)。伯灵顿/ bcl - 2 pro-apoptotic比率增加了BMP4 100 ng·毫升−1从控制和特发性PASMCs PAH,但不是从遗传PAH患者(图8 b⇓)。
骨形成蛋白(BMP) 4-induced肺动脉平滑肌细胞的凋亡(PASMCs)与控制(□n = 10),肺动脉高血压(PAH)患者没有(▪特发性多环芳烃;n = 10)和骨形态发生蛋白受体2型突变(▓遗传多环芳烃;n = 9)。)流仪分析propidium iodide-stained PASMCs接受10和100 ng·毫升−1BMP4评估细胞的分布在细胞周期的不同阶段。凋亡细胞百分比评为sub-G0 / G1期细胞群。b)凋亡指数(伯灵顿/ bcl - 2比例)PASMCs播种,同步48 h和100 ng·毫升对待−1BMP4。相对mRNA表达(伯灵顿/ bcl - 2)比例是由实时定量PCR。数据意味着±扫描电镜。*:p < 0.05与同样的待遇PASMCs隔离控制;* * *:p < 0.001与同样的待遇PASMCs隔离控制;#:p < 0.05与基底条件BMP4-nonstimulated PASMCs;# # #:p < 0.001与基底条件BMP4-nonstimulated PASMCs。
讨论
目前的结果表明,1)肺组织和PASMCs,但不是胸大肌,从遗传PAH患者呈现减少的表达BMPR-2和变量表达的增加BMPR1-A BMPR-1B,而只有一个(相对不那么重要)的表达减少BMPR-2 PASMCs从特发性肺动脉高压病人中观察到;2)从遗传PASMCs PAH患者没有BMP4-induced Smad 1/5/8磷酸化但显示BMP4-induced p38MAPK通路的激活;3)PASMCs PAH患者呈现的在体外可以抑制增殖和抗凋亡模式BMP4在特发性肺动脉高压而不是遗传的多环芳烃;和4)个人响应变化到另一个地方,从一个突变与PAH患者特别是PASMCs 22 bp del突变相比没有区别与特发性PASMCs PAH患者没有发现突变。目前的研究证实了以前的研究关于BMPR-2信号在多环芳烃和介绍,第一次,一个大在体外PASMCs比较有和没有自然发生的BMPR-2突变。
虽然BMPR-2变异识别大多数遗传PAH患者和无症状携带者的显著发展疾病的风险,两个大型临床研究未能披露不同的临床表现,血液动力学和组织病理学在遗传和特发性肺动脉高压病人之间,除了早期疾病的发作,更损害血液动力学,也许不那么频繁的可逆性在遗传PAH的血管舒张药测试7,8。这些观察表明异构功能后果的各种> 200BMPR-2迄今为止报道的突变,也与共存的交互信号异常。在目前的研究中,没有差别在遗传和特发性肺动脉高压的临床表现,但这可能是相关的次要的表型差异,个体差异和小样本大小。
我们的结果证实BMPR-2却降低了在特发性肺动脉高压的表达,更减少了遗传的多环芳烃21。肺组织的相对大小和孤立PASMC和压电陶瓷表达式是一个主要的暗示PASMC BMPR-2的位置。这是在与主要内皮细胞位置之前报道在正常控制和PAH患者的肺21。然而,最近的研究对人类PASMCs和胸大肌显示相对高水平的细胞类型BMPR-2,但非常低的表达BMPR-1A和1 b在胸大肌,符合BMP4响应能力的缺乏22。在目前的研究中,BMPR-2的表达,BMPR-1A和BMPR-1B在胸大肌与PASMCs相比低得多,而且没有明显的影响BMPR-2突变,以便进一步分析关注PASMCs。此外,在遗传PAH患者,BMPR-2表达水平低于预测的haploinsufficiency和nonsense-mediated衰变过程中次要无意义突变的存在。这些观测结果符合认为一些额外的环境和/或遗传因素可能是负责进一步减少BMPR-2表达式。
减少表达BMPR-2也被报道发生在肺动脉高压的实验动物模型,如诱导的慢性systemic-to-pulmonary分流23低氧暴露24和野百合碱25。在后者中,减少BMPR-2表达式在肺组织和PASMCs描述25。令人惊奇的是,独家BMPR-2超表达的基因治疗没有改善monocrotaline-induced PAH的老鼠26,表明受体的结合是无法恢复BMP信号,因此,没有预防疾病发作或恶化。目前的结果表明,降低表达与突变BMPR-2似乎解释PASMCs的前导和抗凋亡的影响至关重要。
在目前的研究中,BMPR-1A的表达和BMPR-1B倾向于增加,尽管很不定地,显著增加的BMPR-1A遗传和特发性肺动脉高压患者的肺组织只有在PASMCs特发性肺动脉高压病人,和BMPR-1B PASMCs从遗传PAH患者。BMPR-1A的表达减少在研究各种原因严重肺动脉高压患者,包括多环芳烃、二尖瓣狭窄和血栓栓塞肺动脉高压,这是解释与他们的一个过度27。研究BMPR-2的表达是不变的27。我们之前报道RTQ-PCR和免疫印迹不变的表达而在整个肺组织和PASMCs PAH患者14。在monocrotaline-induced肺动脉高压,BMPR-2和BMPR-1B的表达减少,而BMPR-1A保持不变的表达25。增加表达BMPR-1B据报道在一个特发性肺动脉高压病人28。这些矛盾的结果的原因尚不清楚。因为BMPR-1A / BMPR-2主要BMP4-responsive受体复杂允许Smad 1/5/8刺激22的超表达BMPR-1A PASMCs的特发性肺动脉高压病人可以以某种方式与这些细胞的正常BMP4反应有关。至于BMPR-1B超表达的遗传的多环芳烃,这可能是猜测与替代p38MAPK信号激活。
9个突变的发现在目前的研究中,W16X, R491W Q495X曾被报导过11,29日,30.。其他六个突变(Δexon1 W70X, S107X, E195X, bp德尔和S301P 22日),在所有四个领域的受体都是小说,其中包括总删除一个外显子,三个无意义突变,一个部分删除,一个错义突变。先前的研究表明,错义突变在配体结合域由半胱氨酸替换损害BMP信号突变体在胞质受体mislocalisation31日。此外,noncysteine替换本土化细胞表面也表现出缺陷BMP信号活动31日。相比之下,突变在细胞质c端域只有适度抑制Smad信号31日,32。因此,在本研究中,所有报告将容易被有害的突变改变了蛋白质序列在受体和相关蛋白质的重要功能的网站功能。
突变的BMPR-2(包括R491W)不同类地干扰BMP下游信号,但它们激活增殖途径24。我们以前报道,PASMCs隔绝特发性PAH患者提供增强的增长对血清的反应,而不是PDGF10。在目前的研究中,PASMCs有或没有BMPR-2突变没有在这方面表现不同,但BMP4-induced生长抑制和凋亡增加是明显在PASMCs更重要BMPR-2突变。这是所有的利益BMPR-2突变发现在目前的研究中,除了22 bp在跨膜域删除,反应均匀BMP4的这些影响,支持大多数的观念BMPR-2突变是功能联系在一起。沿着同一条直线,减少BMPR-2表达monocrotaline-induced肺动脉高压有关报道与降低的磷酸化Smad1 PASMCs BMP-induced细胞凋亡减少25。
在目前的研究中,BMP4 PASMCs与有关的应用BMPR-2降低激活(磷酸化)的突变Smad 1/5/8一起增加p38MAPK通路的激活(磷酸化)。我们选择一个剂量的BMP4 100 ng·毫升−1的基础上可用的文学18,19,32和初步测试显示100 ng·毫升的最大功效−1而10 ng·毫升−1和1 ng·毫升−1在歧视PASMCs有或没有BMPR-2突变。然而,最近的一项研究显示,最大功效较低剂量的10 ng·毫升−1BMP4的33。这些差异的原因还不清楚,因此缺乏完整的剂量反应曲线可能会限制我们的发现。monocrotaline-induced肺动脉高压,降低BMPR-2和phospho-Smad1 p38MAPK信号在PASMCs没有发生变化25。的差别在低氧诱导肺动脉高压,对这些BMPR-2并不影响Smad 1/5/8磷酸化,并与p38MAPK信号下降有关24。尽管这些差异的一部分可能与模型特异性和PASMCs与整个肺测量,目前的数据证实先前的报道31日,32大多数的突变BMPR-2与下游信号的更深刻的变革,增加p38MAPK信号是PASMC增殖增加的一个原因。
目前的结果支持的概念改变了BMPR-2 / Smad信号是增加的一个原因PASMCs扩散起着重要的作用在多环芳烃的肺阻力血管的重塑。
支持声明
这项研究是由国家卫生研究所支持的et de la医学研究院,Ministere de la矫揉造作的,des疾病研究所罕见,代表团说是倩碧de l 'Assistance Publique——Hopitaux巴黎(巴黎,法国),比利时基础心脏手术和全宗de la任职医学研究院(批准号3.4551.05;布鲁塞尔,比利时)。这个研究项目获得财政支持下的欧洲委员会第六框架计划(深刻理解合同- ct - 2005 - 018275和深刻理解- ct - 2005 - 018724, PULMOTENSION)。这只出版反映了作者的观点,在任何情况下是欧洲共同体承担任何使用可能是由它所包含的信息。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2008年12月2日。
- 接受2009年3月12日。
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