摘要
肺炎的异常炎症反应(IR)与不良预后和高死亡率相关。动物模型有助于更好地了解肺部感染与相关IR之间的关系。本研究的目的是验证一种由疫苗接种诱导的肺炎的实验模型铜绿假单胞菌并研究长时间(96 h)的相关IR。
5头拉格白-长白猪进行了4天的通气试验。插管后,取含75毫升铜绿假单胞菌(106菌落·毫升−1)经支气管镜接种。在整个研究过程中监测生理和实验室参数。在血清和支气管肺泡灌洗(BAL)中测定促炎细胞因子。进行肺组织病理学检查及血、肺、肺泡培养。
所有的动物都出现了肺炎的组织病理学证据。对BAL和肺的微生物学研究证实了存在铜绿假单胞菌在所有的样本中。在整个研究中,在血清和BAL中观察到白细胞介素-6的增加。
综上所述,该实验模型通过接种高浓度铜绿假单胞菌在通风仔猪是可行的,可以适当的评价不同方面的相关炎症反应。
需要机械通气的严重社区或医院获得性肺炎患者死亡率非常高1,2.在过去的10年里,已经收集到的证据证明了宿主炎症反应(IR)在细菌感染进化中的相关性。几项关于严重肺炎的研究3.,4在肺和血清中显示了不同炎症细胞因子水平的增加,最近的出版物5,6已经证明,在这些患者中,IR的增加是对治疗无反应和死亡率的一个强有力的预测因子。在临床实践中,不同的因素,如抗生素的使用或共病的存在,可能会影响局部和全身IR,而这些因素在人体中的影响难以准确评估。动物模型可以帮助澄清这个问题。马奎特et al。7我们已经开发了一种机械通气仔猪肺炎的动物模型,与严重的人类肺炎非常相似。该模型已被证明对于正确评估诊断和治疗的不同方面非常有用8- - - - - -13.铜绿假单胞菌是社区获得性肺炎和呼吸机获得性肺炎中最致命的病原微生物之一吗1,2,6.的发病率铜绿假单胞菌肺炎正在增加,患者通常接受不同的抗生素治疗,并患有不同的共病和相关的肺部疾病。这些情况使对这种侵入性微生物的相关IR的解释复杂化。在排除或控制潜在混杂因素的重症肺炎动物模型的可用性可能会提高目前对涉及相关IR的内膜机制的认识。该动物模型已用于药理学研究13,包括对抗生素效果的评估14.在目前的研究中,临床和组织病理学结果铜绿假单胞菌研究了接种情况,以及长时间通气动物的相关IR特征(96 h) 。
假设接种高浓度的铜绿假单胞菌在通风条件下,仔猪会诱发严重的肺炎。通过这样做和保持仔猪长时间通风,可以研究肺实质的组织病理学紊乱以及相关的IR。本研究的目的是验证一种由疫苗接种诱导的肺炎的实验模型铜绿假单胞菌并评估肺和血清中的相关IR。
方法
在阿根廷布宜诺斯艾利斯的布宜诺斯艾利斯大学de Clínicas " José de San Martín "医院设立了一个实验性重症监护病房。它完全配备心血管监测仪(型号78353-A;hp, Andover, MA, USA),呼吸机(Monal D;液化空气公司Santé,巴黎,法国)和电动输液泵(雅培实验室,雅培公园,IL,美国)。
动物的准备
选用6头3月龄、体重20±2 kg的健康家种大白猪(Portex Ltd, Hythe, UK),经麻醉后用7.0 mm低压套管气管插管。麻醉前肌肉注射氯胺酮(凯他乐;Parke-Davis, Lansing, MI, USA) 250mg。持续输注咪达唑仑(Dormicum®;(瑞士巴塞尔罗氏)0.3 mg·kg−1·h−1,潘库溴铵(帕夫隆©4 mg;Organon, Buenos Aires, Argentina) 0.32 mg·kg−1·h−1和苯坦酰(升华©0.07 mg;Janssen Cilag,安弗斯,比利时)5 μg·kg−1·h−1. 将导管插入股静脉,持续输注10%葡萄糖(1.5%) 毫升·千克−1·h−1)和乳酸林格氏酯(3ml·kg−1·h−1),用输液泵。股动脉插管3F聚乙烯导管(Plastimed, St Leu-la-Forêt,法国)进行压力监测和采血。8F耻骨上导尿管(Vesicoset;血管omed,卡尔斯鲁厄,德国)通过外科中线小骨盆切除术放置在膀胱内。然后将仔猪置于俯卧位并机械通气。前12小时死亡的仔猪被排除在研究之外。
机械通风
动物以容积控制模式进行机械通气。呼吸机参数包括潮气量(VT)在恒定的吸气流量为10 毫升·千克−1,呼吸频率(fR)十五岁 呼吸·分钟−1,吸气时间为33%,初始吸气分数为(F阿,我2),呼气末正压(PEEP)为0。之后,F阿,我2,根据血气分析设定动脉血氧压(Pa、 O2) ≥80和<100 mmHg,PEEP增加至≤5 cmH20.气道压力,静态肺顺应性(除以VT通过吸气末期平台压力和总PEEP之间的差值15)和动脉血气(血气分析仪IL-1306;仪器实验室,米兰,意大利)每6小时测定一次。在整个方案中,二氧化碳动脉张力维持在35-45 mmHg通过增加fR达到auto-PEEP出现前的最大水平。超过这个限度,高碳酸血症可以耐受。
支气管接种
动物接种75 mL含106菌落(cfu)·毫升−1的致病性铜绿假单胞菌ATCC 27853。通过支气管镜通道,15 每毫升输液均匀分布在每个肺的每个肺叶。
静息和机械通气后,待动物血液动力学稳定后滴注细菌接种。
抽样和程序
机械通风参数(VT,fR,气道压力和F阿,我2)在0、2、6、12、24、36、48、60、72、84和96时监测心率、血压、体温、血气、血清电解质(钠、钾)和乳酸浓度 H分别在0、24、48、72和96时获取血液生化(葡萄糖、肌酐、尿素、胆红素、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶)和血细胞计数 H
支气管肺泡灌洗
于0 h(接种前)经支气管镜右肺中叶通道灌注5份20 ml无菌生理盐水(0.9%氯化钠),再抽吸铜绿假单胞菌暂停)及 h。
炎症参数
c反应蛋白
使用CRP试剂盒(西班牙巴塞罗那Biosystems S.a.)对血清和支气管肺泡灌洗液(BAL)中的C-反应蛋白(CRP)进行定量。
血液和BAL液中的细胞因子
在特定的猪试剂盒(美国明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems Inc.)中,使用ELISA方法测量血清和BAL上清液中的肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β、-6和-8水平。
在插管时和研究结束时测定BAL细胞因子和CRP。分别于插管时及插管后24、48、72、96 h检测血清细胞因子和CRP。
牺牲和验尸研究
在96岁时进行了牺牲 h在静脉注射氯化钾全身麻醉下。
肺标本采集
死亡后,动物仍处于机械通气状态,直到获得肺实质的外科样本进行细菌学和组织病理学评估。肺部通过颈胸中线切口无菌暴露。此后,至少一个肺组织样本(1 厘米3.)取自保存较完好的叶(宏观上)和涉及较多的叶。
组织病理学评价
肺组织按标准方法处理。分析血管(血栓和内皮病变)、胸膜(急性或慢性胸膜炎)和肺实质。肺实质的评估包括肺炎的严重程度和其他相关病变(透明膜和肺泡损伤)的存在。根据先前公布的标准对肺炎的严重程度进行分级18结果如下:0 =无肺炎;1 =脓性黏液堵塞;2 =细支气管炎;3 =肺炎(实变同时伴有多形核白细胞、纤维蛋白渗出物和细胞碎片进入肺泡腔);4 =合流性肺炎(沿不同次叶延伸);5 =脓肿性肺炎(细胞坏死伴细胞结构破坏)。肺炎仅限于后三种类型。根据观察到的最差的类别对每个标本进行分类。
统计分析
所有数据均表示为平均值±sd或扫描电镜是合适的。使用成对数据的非参数检验;Wilcoxon检验和Friedman检验分别用于两个或两个以上时间点的比较。p值<0.05被认为有统计学意义。
组织委员会批准
所有的动物都按照医院道德委员会和调查指导的指导方针(Clínicas“José de San Martín”)和“实验动物护理和使用指南”进行治疗。19.
结果
剔除1头在前12 h死亡的仔猪(死于动物制剂)后,共研究了5头仔猪。
生理和实验室数据
生理和实验室变量如表所示 1⇓.经支气管接种后,血流量迅速持续下降Pa、 O2/F阿,我2比率(p = 0.01)和体温升高(p = 在整个研究过程中观察到0.03)。静态肺顺应性随着时间的推移而降低,尽管差异未达到统计学意义。未观察到生化数据的差异。
炎症反应
在整个研究过程中,血清IL-6都在增加,在48小时时增加最大。IL-1β和-8无明显变化。虽然不显著,但TNF-α水平在研究结束时略有下降(图1)⇓).
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/30/6/1167/F1.medium.gif)
在研究期间连续测定血清a)白细胞介素(IL)-1β,b)白细胞介素-6,c)白细胞介素-8和d)肿瘤坏死因子(TNF)-α。数据表示为平均值±扫描电镜.a) p = 0.97, b) p = 0.04, c) p = 0.67, d) p = 0.30(根据Friedman检验计算)。
研究结束时,BAL液中的IL-6浓度也显著增加。所评估的剩余细胞因子浓度增加未达到统计学意义(图。 2.⇓).在研究期间,BAL液中CRP水平没有变化(数据未显示)。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/30/6/1167/F2.medium.gif)
a)白细胞介素(IL)-1β, b) IL-6, c) IL-8和d)肿瘤坏死因子(TNF)-α研究开始时的0和96小时支气管肺泡灌洗(BAL)测量。数据以平均值±表示扫描电镜a)p = 0.06,b)p = 0.04,c)p = 0.14和d)p = 0.46(根据Wilcoxon检验计算)。
微生物学
铜绿假单胞菌在5头评估仔猪的BAL液和肺组织培养的所有样品中均存在。拜尔港文化产生了铜绿假单胞菌浓度为>104 cfu·mL−1四头小猪和>10头小猪5 cfu·mL−1在一只小猪身上。肺组织培养也显示出肺组织的生长铜绿假单胞菌浓度为>104cfu·gr−1在所有评估的样本中。血培养呈阳性铜绿假单胞菌在一个小猪。
摩根氏菌属morgani和凝固酶阴性葡萄球菌(二者的浓度均为103. cfu·mL−1)也分别在20个评估样本中的2个和3个样本中检测到。
讨论
本研究的结果表明,接种铜绿假单胞菌进入通气仔猪的肺部会引起肺炎。经过长时间的机械通气(96 h),所有动物均因该微生物发生肺炎,大部分仔猪肺出现严重的组织病理学病变。此外,使用该动物模型,作者能够评估相关IR的动力学,其特征是血清和BAL中IL-6水平随时间显著增加。
重症肺炎实验模型的可用性,其中动物在96小时内进行通气 h在不受抗生素治疗干扰的情况下,可以在整个过程中研究肺部发生的生理病理变化。接种铜绿假单胞菌导致肺炎临床症状的发展(发热和气体交换障碍)和肺力学的恶化(随着时间的推移静态顺应性下降)。验尸评估证实所有受评估动物的组织病理学和微生物学均存在肺炎。
肺炎明显存在于所有肺叶中,宏观上最受累,但也在60%保存最完好的肺叶中,证实了感染的多肺叶分布。有趣的是,也有证据表明,在80%的仔猪评估透明膜。在肺炎的发展中,透明膜出现较晚,其存在与弥漫性肺泡损伤和不可逆纤维化有关20.戈尔茨坦et al。9在同一动物模型中评估与急性肺炎相关的病变,如预期,未观察到透明膜或弥漫性肺泡损伤迹象。相比之下,在本研究中,肺炎晚期病变的发生是常见的,因为动物需要长期通风。这种情况可能有助于评估在这些晚期阶段声称有益的不同类型的治疗,如糖皮质激素或其他免疫调节剂。
在本研究中,铜绿假单胞菌的原因,因为它是一种常见的和经常致死的原因的肺炎通气患者2. 病人铜绿假单胞菌肺炎通常使用不同类型的抗生素,并伴有多种并发症,这些情况可能影响相关的IR。通过使用这种肺炎动物模型,避免了一些潜在的混杂因素,使IR评估更加准确。
研究结束时,肺IR表现为BAL液中不同促炎细胞因子的增加,主要是IL-6。虽然在血清中也观察到IL-6水平的增加,但在血液中评估的其余细胞因子的动态并没有显示出一致的模式,这表明IR主要是分区的。Dehouxet al。21在一项人类单侧肺炎的研究中证实了局部细菌感染反应中细胞因子的产生。然而,当肺炎更严重,导致败血性休克或在机械通气时获得时,全身IR也很明显3.,4,22.当地缺乏相关性和系统性炎症和不一致的模式不同的细胞因子测定血清中可能可能解释为没有脓毒症的动物研究,所反映的负面血培养一种动物,没有血液动力学的干扰,也没有要求vasopressive药物。在本研究中,IL-6是唯一的细胞因子评估显示显著增加(在血清和肺中)。事实上,已经观察到严重程度评分与血清IL-6之间的相关性23,24.此外,血清中IL-6浓度已被证明是不同人群死亡率的独立预测因素5,6.从这个意义上说,血清和BAL中IL-6浓度的测量可能是一个非常有用的参数,以评估IR的大小和不同的抗炎治疗的潜在效果。
目前的研究有局限性。首先,在先前健康的动物体内外源性接种高度细菌并不一定反映人类肺炎发展的复杂性。还必须考虑仔猪和人类之间在肺免疫方面的潜在物种差异。此外,不同时间点的连续BAL样本对于准确评估局部IR是最佳的。尽管本研究中评估的“早期”细胞因子已在临床实践中广泛用于IR评估,但其他炎症介质,如粘附蛋白,调节活化,正常T细胞表达和分泌,或IL-10,可能更合适,因为它们在感染的更晚期表达。最后,不能排除机械通气损伤可能在观察到的IR中起到一定作用的事实。
综上所述,目前的肺炎动物模型由铜绿假单胞菌已被证明是有效和可重复的,并且可能构成评估与肺部感染相关的炎症反应和免疫调节治疗的潜在效果的有用工具。
- 收到2007年5月4日。
- 接受2007年8月22日。
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