摘要gydF4y2Ba
白介素(IL)-1β是一种多效、促炎细胞因子,在驱动炎症反应和哮喘气道平滑肌(ASM)反应的结果变化中具有重要的作用。IL-1β属于一个分子家族,被称为IL-1轴,发挥促进和抗炎作用。由于IL-1轴分子的失调可能在哮喘的病理生物学中至关重要,本研究检测了人ASM细胞中IL-1抑制和刺激轴分子的表达和激活,以及它们在细胞因子和免疫球蛋白(Ig)E免疫复合物(IgE cx)介导的兔ASM收缩和松弛反应变化中的作用。gydF4y2Ba
结果表明:1)用IL-1抑制轴成员、IL-1受体拮抗剂和IL-1 ii型受体对离体兔气管环进行预处理,可以消除IL-5和IgE cx诱导的ASM反应性变化。2)对人ASM细胞给予IL-5、IL-1β和IgE cxs后,刺激和抑制IL-1轴分子的mRNA和蛋白表达均增加。3) il -5诱导IL-1轴分子表达的时间过程先于IL-1β和IgE免疫过程。gydF4y2Ba
综上所述,这些发现表明,在分子白介素-1轴水平上的调节可能在治疗哮喘方面具有显著的治疗潜力。gydF4y2Ba
这项工作得到了国家心肺和血液研究所基金HL-59906的支持。gydF4y2Ba
气道炎症伴激动剂介导的支气管收缩增强和肾上腺素受体介导的气道舒张受损是支气管哮喘的典型特征gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.而这些气道的炎症反应变化响应机制仍有待阐明,大量最近的证据牵连CD4 +辅助的至关重要的作用(Th) 2型细胞因子在炎症反应的病理生理学及其伴随在哮喘气道反应性的变化。在这方面,已知Th2细胞因子,白介素(IL)-4、IL-13和IL-5能够协调各种体液和细胞免疫反应,包括免疫球蛋白(Ig)E的合成、嗜酸性粒细胞的募集和激活,这些反应是过敏性哮喘的特征gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba.这些细胞因子也被证明通过直接作用于气道平滑肌(ASM)本身来调节气道反应性gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
虽然已知Th2细胞因子在哮喘的病理生理学中发挥着关键作用,但最近的证据表明,哮喘气道反应的改变可能是由IgE免疫复合物(IgE cxs)在ASM上的作用触发的。事实上,对ASM施加IgE cxs已被证明启动了一个信号级联,导致IL-5的诱导表达和自分泌作用,进而触发多效、促炎细胞因子IL-1β的产生gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.IL-1β是一种关键的细胞因子,在局部和全身免疫反应中都有中心作用。有证据表明,在慢性炎症条件下,如炎症性肠病、银屑病和类风湿关节炎,IL-1β的合成失调和释放延长可能参与了这些疾病的发病机制gydF4y2Ba10gydF4y2Ba.此外,IL-1β也与哮喘患者的炎症反应和气道反应性改变的早期阶段有关,IL-1β蛋白水平的升高已被证明存在于哮喘患者的气道中gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba.此外,累积的证据表明,IL-1β通过直接作用于ASM本身来调节气道收缩和舒张反应gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba.综上所述,这一证据突出了IL-1β在哮喘病理生理学中的重要作用。gydF4y2Ba
IL-1 i型(IL-1RI)和il -2型(IL-1RII)受体分子是两种不同的受体,它们结合IL-1α和IL-1βgydF4y2Ba13gydF4y2Ba.IL-1RI受体负责产生IL-1信号传导的生物学效应gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.相比之下,IL-1RII受体不具有功能性的细胞质信号肽,因此,它是一个诱骗受体,与IL-1结合并减弱IL-1信号gydF4y2Ba16gydF4y2Ba.此外,IL-1RII受体可被裂解成可溶性形式(sIL-1RII),与IL-1β具有高亲和力结合,进一步减少了IL-1β的可用量gydF4y2Ba17gydF4y2Ba.因此,IL-1RII能够通过隔离IL-1来抑制IL-1通路。IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)是另一种可以抑制IL-1活性的机制。IL-1ra与IL-1RI的结合亲和性接近IL-1α和IL-1β,但不诱导信号转导gydF4y2Ba18gydF4y2Ba.在各种实验模型中,IL-1ra预处理也显示出显著减少il -1介导的炎症损伤,表明这些抗炎作用是受体特异性的gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba.虽然IL-1轴分子IL-RL1(也称为T1/ST2)和IL-18RI并不直接参与IL-1信号传导,但两者都是重要的炎症标志物。哮喘患者急性加重后血清中IL-1RL1水平升高gydF4y2Ba21gydF4y2BaIL-18信号也明显上调。因此,IL-1RL1和IL-18RI可作为il -1介导的哮喘炎症标志物。gydF4y2Ba
虽然有大量研究表明IL-1β在哮喘等炎症条件中的作用,但对IL-1轴分子的其他成员却很少关注。因此,本研究检测了IL-1分子家族是否在基线或炎症介质(如IgE cxs、IL-5和IL-1β)响应前哮喘敏感气道中有差异调节,这些介质在前哮喘状态的发展中具有重要的关联。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
制备气道平滑肌组织,与IL-5、IgE复合物和IL-1分子家族成员孵育gydF4y2Ba
本研究共使用14只新西兰成年白兔,经美国宾夕法尼亚州费城儿童医院Joseph Stokes研究所生物安全、动物研究和机构审查委员会(IRB)批准。在研究开始前的几周,这些动物没有呼吸道疾病的迹象。人ASM细胞购自Clonetics (San Diego, CA, USA),它们的使用同样得到IRB委员会的批准。gydF4y2Ba
在不存在或不存在IL-1家族成员、IL-1ra和sIL-1RII的情况下,分别给予IgE csx、IL-1β和IL-5,检测组织激动剂介导的缢缩和松弛反应的变化。简单地说,麻醉后用噻嗪(10 mg·kg)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和氯胺酮(50 mg·kggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba),处死兔子,切除气管gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba开胸手术,清除疏松结缔组织和上皮,分为8个6-8个环段 mm长。每个替代平滑肌环孵育24小时 在室温下:单独使用Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM),或在含有IL-5(4 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;IL-1β (5ng·mL .gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)或IgE cxs,有或没有对其sIL-1RII进行1小时预处理(5 微克·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;gydF4y2Ba或IL-1ra (140 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;研发系统)。IgE浓度为15µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba5µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba山羊抗人IgE (Biodesign International, Saco, ME)。美国)。在培养培养基中连续添加95%氧gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在孵化阶段混合。如前所述,IgE、IL5和IgE cxs的浓度是这些分子的最大有效浓度gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
药效学研究gydF4y2Ba
孵育后,每个组织片段在硅胶化的Harvard 20ml器官浴(Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA)中纵向悬浮在不锈钢三角形支架之间。下支架固定在器官浴的底部,上支架固定gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba连接到Grass FT.03C力传感器(Grass Instruments,昆西,马萨诸塞州,美国)的金链,从中等距张力连续显示在多通道记录仪上。将组织浸泡在改良的Krebs-Ringer溶液中。用5%的CO给浴槽充气gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在阿gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;pH值保持在7.35 ~ 7.40,器官浴温度保持在37℃。通过累积给药乙酰胆碱(ACh;10gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−3gydF4y2Ba此后,在单独的研究中,异丙肾上腺素的松弛剂量-反应曲线(10gydF4y2Ba−10gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM)在乙酰胆碱最大收缩一半的组织中进行。对异丙肾上腺素的松弛反应按最大松弛百分比(RgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba)根据活跃的胆碱能收缩,对松弛剂的敏感性被确定为产生50%R的松弛剂剂量的负对数gydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba(pD)gydF4y2Ba50gydF4y2Ba;gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba几何平均剂量的药物产生50%的最大反应(EDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba)价值)。gydF4y2Ba
培养的气道平滑肌细胞的制备与治疗gydF4y2Ba
人类ASM (HASM)细胞来源于16岁和21岁男性捐献者(Clonetics),他们没有肺部疾病的证据,细胞在37°C、5% CO的湿化气氛中培养gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和95%的空气。本研究使用的细胞在第5 - 7代,在添加10%胎牛血清胰岛素(5 ng·mL)的平滑肌基础培养基(SmBM)中生长至95%的融合度gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)、表皮生长因子(10 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;成纤维细胞生长因子(2 ng·mL)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;庆大霉素(50 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba),如前所述gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.细胞生长至融合后,在未补充的SmBM (SFM)中饥饿细胞,然后暴露于单独无血清培养基(对照),IgE cxs(15µg·mL),持续不同时间gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba人IgE 5µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba山羊抗人IgE)、IL-5 (4ng·mL .gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)或IL-1β(1 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba).回收细胞培养液,在PBS缓冲液中洗涤三次,用于各种RNA和蛋白质实验。所有实验都有三个重复。gydF4y2Ba
IL-1轴mRNA表达的测定gydF4y2Ba
分析人IL-1轴成员IL-1α、IL-1β、IL-1β转化酶(ICE;caspase-1)、IL-1ra、sIL-1RI、sIL-1RII、IL-1RL1、IL-1受体附属蛋白(IL-1RacP)和IL-18RI,根据已公布的人类基因序列,采用RT-PCR和人特异性引物,包括以下引物集。对于ICE: 5 ' -引物5 ' - gtgcaggacaacccagcctat -3 ', 3 ' -引物5 ' - cgctgtaccccagatttttgt -3 '(产物为250 bp);IL-1RI: 5 ' -引物5 ' -ATCGTGATGAATGTGGCTGA-3 ', 3 ' -引物5 ' -TGACCCATTCCACTTCCAGT-3 '(产物为252 bp);IL-1α: 5 ' -引物5 ' -CGGGAAGGTTCTGAAGAAGA-3 ', 3 ' -引物5 ' -AGCAGCCGTGAGGTACTGAT-3 '(产物为235 bp);IL-1β: 5 ' -引物5 ' -GGACAAGCTGAGGAAGATGC-3 ', 3 ' -引物5 ' -TCCATATCCTGTCCCTGGAG-3 '(产物246bp);IL-1RL1: 5 ' -引物5 ' -TGGATATGCGAATGTCACCA-3 ', 3 ' -引物5 ' -GGTGTAATCACCTGCGTCCT-3 '(产物为250 bp);IL-1RAcP: 5 ' -引物5 ' -TCTGATGGATTCTCGCAATG-3 ', 3 ' -引物5 ' -TCTTGGAGCTGGCACTTTCT-3 '(产物253bp);IL-18RI: 5 ' -引物5 ' -CTGCTCTGCTTTGCTGAATG-3 ', 3 ' -引物5 ' -AGCCATGTCTGCTTTTCTCA-3 '(产物为250 bp);IL-1ra: 5 ' -引物5 ' -GGAATCCATGGAGGGAAGAT-3 ', 3 ' -引物5 ' -CCTTCGTCAGGCATATTGGT-3 '(产物为245bp); for IL-1RII: 5′-primer 5′-TGGCACCTACGTCTGCACTA-3′, 3′-primer 5′-TGGTCCCCCTCACACTTAGA-3′ (product is 260 bp); for RPL7: 5′-primer 5′-AAGAGGCTCTCATTTTCCTGGCTG-3′, 3′-primer 5′-TCCGTTCCTCCCCATAATGTTCC-3′ (product is 157 bp).
核糖体蛋白L7(RPL7)的实验值用作加载对照。使用的循环曲线如下:在95℃下变性1小时 最小值;在52–60°C下退火1小时 最小值;在72°C温度下延伸1小时 使用的周期为:IL-1轴基因为31–34个周期;RPL7基因为26个周期。使用从2.5%制备的等量互补DNA(cDNA)对单个产物进行PCR反应 然后在1.2%琼脂糖凝胶上运行µg总RNA和每个PCR反应的等分试样,并使用产物特异性32通过Southern印迹分析测定每个基因的DNA水平gydF4y2BaPgydF4y2Ba标记探针。使用PhosphoImager (Molecular Dynamics, Boston, MA, USA)直接测量每个条带的放射性,对Southern印迹进行定量。gydF4y2Ba
Western blot检测IL-1轴蛋白表达gydF4y2Ba
IL-1轴成员IL-1RI、IL-1RAcP、IL-1ra和IL-1RII的蛋白表达通过对从培养的人ASM细胞中分离的膜蛋白裂解物样品进行Western blot分析进行测定,这些样品在0、24和48小时后单独使用SFM或含有IL-5(4)的SFM进行处理 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba),IL-1β(1 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)或IgE(15µg·mL .gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba人IgE 5µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba山羊反IgE)。蛋白裂解液样品均质并制备于40体积的50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 7.4),含1 mM苯甲基磺酰氟,5µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba抑肽酶5µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba亮抑酶肽。以100×离心去除细胞核和大颗粒gydF4y2BaggydF4y2Ba为5分钟。然后回收上清液,用Lowry法测定蛋白浓度。等量(30-50µg)的细胞蛋白在9-11%的sds -聚丙烯酰胺凝胶中分离,然后转移到硝基纤维素膜上。然后在4°C条件下,用一抗在25 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl和0.5% Triton-X-100(含5%脱脂牛奶)中过夜,对膜进行印迹gydF4y2Ba22gydF4y2Ba.所有使用的一抗均为小鼠抗人单克隆抗体(R&D Systems),稀释1:250。il - 1轴蛋白质含量在1小时后用增强化学发光检测孵化与1:1,000 anti-mouse辣根peroxidase-linked二级抗体的稀释25毫米Tris-HCl (pH值7.5),150毫米triton - x - 100含0.50%氯化钠和0.05%脱脂牛奶,和随后的接触放射自显影法电影。gydF4y2Ba
ELISA检测IL-1ra和sIL-1RII蛋白gydF4y2Ba
分别用SFM单独或含有IL-5 (4 ng·mL)的SFM处理0和24 h,测定ASM细胞培养液中IL-1ra和sIL-1RII的蛋白水平gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)或IL-1β(1 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba).如前所述,使用酶特异性免疫分析法定量评估IL-1ra和sIL-1RII蛋白水平gydF4y2Ba6gydF4y2Ba.后一种检测采用双抗体夹心策略,其中乙酰胆碱酯酶(AChE)、fab结合的IL-1ra-或sil - 1rii特异性二抗靶向第一种细胞因子捕获抗体(R&D Systems)。用分光光度法测定乙酰胆碱酯酶的活性,并相对于线性标准曲线(范围0-250 pg·mL)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba),该结果用于量化细胞培养基中靶向IL-1ra和sIL-1RII的数量。此外,HASM细胞还暴露于IgE免疫cxs(15µg·mL)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba人IgE 5µg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba山羊抗人IgE)0和24 h在1人缺席和在场的情况下 h最大有效浓度的预处理(50 ng·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)的IL-5受体中和抗体(IL-5ra;研发系统)。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
在适当的情况下,使用双尾配对t检验和方差分析进行统计分析。p值<0.05被认为是显著的。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
IL-1轴分子在调节激动剂介导的细胞因子和IgE免疫复合物致敏兔气道平滑肌反应中的作用gydF4y2Ba
为了研究IL-1抑制轴成员IL-1ra和sIL-1RII对il -5诱导的气道反应性变化的调节作用,在il -5处理的兔ASM片段中,分别比较了激动剂介导的ASM收缩剂和松弛剂反应,在没有或存在sIL-1RII或IL-1ra的情况下。如图1所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,相对于介质处理(对照)组织,在il -5处理的ASM中,收缩肌对外源施加ACh的反应显著增加。因此,最大张力(TgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba(平均±)值gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba)分别为81.32±5.43和99.97±6.36 g·g ASMgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba与相应的教育gydF4y2Ba50gydF4y2Ba分别为5.16±0.11和5.26±0.11 -log M (p<0.005)gydF4y2Ba马克斯gydF4y2Bail -5处理的ASM高于对照22.9%。此外,在il -5处理的组织中,增强的收缩体对ACh的反应在sIL-1RII预处理的组织中基本消失(图1a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)或IL-1ra(图1bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).相比之下,在使用IL-1ra或sIL-1RII治疗的对照组ASM组织中,收缩肌对ACh的反应没有改变(数据未显示)。gydF4y2Ba
白介素(IL)-5诱导兔气道平滑肌(ASM)收缩肌反应性改变。比较对照组和il -5处理的兔ASM组织中,在a)可溶性IL-1 ii型受体(sIL-1RII)或b) IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)缺失或存在情况下收缩剂与乙酰胆碱(ACh)的剂量-反应关系。数据以平均值±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba最大张力(TgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba在IL-5处理的组织中,IL-5对乙酰胆碱的作用显著增强,而在sIL-1RII或IL-1ra存在时,IL-5的这些作用在很大程度上消失。实验进行了三个重复。gydF4y2Ba
在扩展研究中,在可比较水平的初始持续乙酰胆碱诱导收缩期间,平均∼T的50%gydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba在对照组和il -5致敏的兔ASM片段中,给β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素可使预先收缩的组织产生累积的剂量依赖性松弛。如图2所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,相对于控制ASM, RgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba反应和pDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba在IL-5致敏的组织中,异丙肾上腺素的值显著降低。因此,RgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba数值(平均值±)gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba), IL-5致敏组为55.68±3.03,对照组为47.83±4.12% (p<0.01)。相应的pDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba异丙肾上腺素的平均值分别为6.39±0.03和6.38±0.03-对数MgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba在用sIL-RII预处理的IL-5敏感组织中,对异丙肾上腺素的反应在很大程度上被阻止(图2a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)或IL-1ra(图2bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).在对照实验中,没有发现sIL-1RII和IL-1ra显著影响对照组组织中对异丙肾上腺素的ASM松弛反应(数据未显示)。gydF4y2Ba
白介素(IL)-5诱导兔气道平滑肌(ASM)松弛反应的改变。比较对照组与异丙肾上腺素的松弛反应曲线,以及IL-5处理的兔ASM组织在没有或存在可溶性IL-1 ii型受体(sIL-1RII)或IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)的情况下的松弛反应曲线。数据以平均值±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba价值观衰减百分比最大松弛(RgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba)和产生50% R的松驰剂剂量的负对数gydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba(pD)gydF4y2Ba50gydF4y2Ba;gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba几何平均剂量的药物产生50%的最大反应(EDgydF4y2Ba50gydF4y2BaIL-5对异丙肾上腺素的反应值在sIL-1RII或IL-1ra存在时被消融。实验进行了三个重复。课时:乙酰胆碱。gydF4y2Ba
我们还进行了与之前描述的il -5类似的实验,以确定IgEimmune cxs对兔ASM缩肌和松弛反应的影响,分别在没有和有IL-1ra或sIL-1RII的情况下。因此,TgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba数值(平均值±)gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba)分别为83.56±6.22和104.84±7.16 g·g ASMgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba与相应的教育gydF4y2Ba50gydF4y2Ba值分别为5.19±0.09和5.30±0.10 -log M (p<0.01)。此外,增强的TgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba和艾德gydF4y2Ba50gydF4y2BaIL-1ra预处理组和IL-1ra预处理组对IgE免疫cx处理组的乙酰胆碱值分别为87.12±6.84和5.21±0.11。同样,RgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba反应和pDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba在IgE免疫致敏组织中异丙肾上腺素的值显著降低。因此,RgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba数值(平均值±)gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba)在IgE免疫组中,cx治疗组和对照组ASM分别为57.22±5.12%和45.23±5.32%(p<0.01)。相应的pDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba异丙肾上腺素的平均值分别为6.34±0.05和6.36±0.05 -log M。此外,受损的RgydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba经sIL-RII(54.32±6.10)或IL-1ra(55.87±5.89)预处理的IgE免疫cx致敏组织对异丙肾上腺素的反应减弱。在暴露于IL-1β的兔ASM组织中也观察到与IL-5和IgE免疫cxs类似的对ASM收缩和松弛的影响,IL-1β或IL-1ra或sIL-1RII均可消除这些影响(数据未显示)。gydF4y2Ba
人气道平滑肌中刺激性IL-1轴分子的表达gydF4y2Ba
根据以往的证据,以及早期的研究表明,暴露于特应性哮喘血清的初发ASM诱导mRNA表达和IL-5的上调,而IL-5又以自分泌的方式诱导促炎细胞因子IL-1β的表达和释放gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,本文作者接下来检查培养的HASM细胞是否内源性表达IL-1轴分子的其他刺激和抑制成员的mrna,以及这些分子的表达模式是否在注射IgE cxs、IL-5或IL-1β后的ASM中被调节。据此,制备Southern印迹,用IL-1α、IL-1β、ICE、IL-1RI和IL-1RacP基因核苷酸序列特异的人cDNA探针进行探针检测。此外,还制备了157 bp RPL7探针作为凝胶加载的对照。如图3所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,相对于未处理(对照)细胞,ASM细胞中IL-1α表达增加,这是IL-1β单独作用的结果。同样地,IL-1β mRNA表达增加是对IL-1β本身的反应,在IgE cxs或IL-5暴露6和24小时后也是如此。此外,相对于对照细胞,所有处理条件下ICE的表达均显著增加(gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba在3、6和24小时对IgE、IL-5和IL-1β)的应答 H有趣的是,与IL-5和IL-1β在所有时间点均增加IL-1RI表达的作用相反,受体的mRNA表达仅在24小时显著增加 h响应IgE cxs。在所有测量的时间点,IL-1RAcP表达对IgE cxs的反应均显著增加,而在3小时时,IL-1RAcP表达仅略有增加 h对IL-5和at-6的反应 h对IL-1β的应答。gydF4y2Ba
人气道平滑肌(HASM)中刺激型白细胞介素-1轴分子的mRNA表达。IL-1α、IL-1β、IL-1β转换酶(ICE)、IL-1 I型受体(IL-1RI)、IL-1受体样1 (IL-RLI)、IL-1受体附属蛋白(RAcP)、IL-18 I型受体(IL-18RI) mRNA的表达单独在无血清培养基中孵育6和24小时(对照),然后用免疫球蛋白(Ig)E免疫复合物(IgE cxs)、IL-5或IL-1β治疗。以核糖体蛋白l7 (RPL7)表达作为对照。相对于对照细胞,暴露于IgE cxs、IL-5或IL-1β可显著诱导这些刺激性IL-1轴分子的表达,IL-5表达水平的升高先于IgE cxs和IL-1β的诱导。图的右侧表达了cDNA片段的碱基对数目。实验进行了三个重复。gydF4y2Ba
抑制IL-1轴分子在人气道平滑肌中的表达gydF4y2Ba
除了IL-1轴分子的刺激组外,我们还使用针对人IL-1ra和sIL-1RII基因的cDNA探针进行Southern blot检测IL-1抑制性家族成员的mRNA。如图4所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,相对于单独暴露于载体的细胞,IgE cxs处理24 h时IL-1ra和sIL-1RII mRNA表达均适度增加。相比之下,IL-5处理在第3和6 h诱导IL-1ra和sIL-1RII的mRNA表达显著增加,在24 h显著减弱。最后,IL-1β处理导致IL-1ra表达在6 h增加,sIL-1RII表达在6 h也增加,但在24 h保持升高。综上所述,这些结果表明,ASM表达所有IL-1轴分子的mRNA,并且它们的mRNA表达顺序受IgE cxs、IL-5和IL-1β调控。IL-5导致这些分子的mRNA表达先于IgE cxs和IL-1β,提示IL-5在ASM中IL-1轴的调控中起主要作用。gydF4y2Ba
抑制性白细胞介素(IL)-1轴分子在人气道平滑肌(HASM)中的mRNA表达。培养的HASM细胞在0、3、6和24小时后IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)和可溶性IL-1 II型受体(sIL-1RII)mRNA表达的Southern印迹分析 单独在无血清培养基中培养h(对照组),然后用免疫球蛋白(Ig)E免疫复合物(IgE cxs)、IL-5或IL-1β进行治疗。核糖体蛋白L7(RPL7)的表达作为对照。与对照细胞相比,暴露于IgE cxs、IL-5或IL-1β可显著诱导这些抑制性IL-1轴分子的表达,并且在IgE cxs和IL-1β诱导之前,IL-5的表达水平增加。cDNA片段的碱基对数在图。实验分三次进行。gydF4y2Ba
IL-5和IL-1β对人ASM中IL-1轴分子蛋白表达的调节作用gydF4y2Ba
根据之前的观察,加上早期的观察表明,ASM细胞能够表达和释放IL-1β,以响应IL-5, IL-1β或IgE cxsgydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,目前的作者研究了在响应IL-5和IL-1β的HASM细胞中其他IL-1家族成员的蛋白表达和生产的性质。如图5所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2BaWestern blot检测IL-1R1蛋白水平在IL-5和IL-1β处理后6和24 h显著升高。在IL-1RAcP中也可以看到类似的结果,在IL-1β处理后24小时内观察到蛋白产量增加,在IL-5处理后48小时内观察到蛋白产量增加。当ASM细胞暴露于IgE cxs时,可以看到相应的蛋白表达增加(数据未显示)。gydF4y2Ba
人气道平滑肌(HASM)细胞中刺激性白细胞介素-1轴分子的蛋白表达。Western blot检测IL-1 I型受体(IL-1RI)和IL-1受体附属蛋白(IL-1 RAcP)在无血清培养基(SFM)培养的HASM细胞中的表达,并检测IL-5或IL-1β处理6、24和48 h后的表达。值得注意的是,相对于SFM, IL-1β和IL-5处理的细胞表现出IL-1RI和IL-1RAcP显著升高的蛋白水平。右边的数字是分子量(kDa)。实验进行了三个重复。gydF4y2Ba
对IL-1抑制性家族成员进行蛋白检测,主要是IL-1ra和IL-1RII。如图6所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba在IL-1β作用6和24 h时,IL-1ra蛋白表达显著增加,而IL-5对这些蛋白表达影响较小。当检测IL-1RII蛋白在IL-1β反应中的表达时,检测到与IL-1RII的可溶性亚型相对应的约37 kDa的条带,并在IL-1β和IL-5反应的24 h观察到表达增强(图6)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).IL-1RII印迹il -5处理的ASM细胞裂解液显示约68kda的条带,与IL-1RII (mIL-1RII)的膜结合形式相对应。6h时mIL-1RII表达增强,24h时达到表达峰值。gydF4y2Ba
人气道平滑肌(HASM)细胞中IL -1轴分子的蛋白表达。Western blot检测IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)和IL-1 ii型受体(IL-1RII)蛋白在无血清培养基(SFM)培养的HASM细胞(NT)和IL-5或IL-1β治疗6、24和48 h后的表达。相对于SFM, IL-1β和IL-5处理的细胞表现出IL-1ra蛋白水平的升高,可溶性(s)IL-1RII和膜性(m)IL-1RII表达也在IL-1β和IL-5处理后增加。分子量表示在图的右边(kDa)。实验进行了三个重复。gydF4y2Ba
IL-1轴抑制分子IL-1ra和sIL-1RII的蛋白释放gydF4y2Ba
鉴于之前的结果显示IL-5和IL-1β诱导了IL-1轴分子的上调表达,我们在培养的HASM细胞暴露于IL-5或IL-1β的培养基中平行测定了分泌的IL-1ra和sIL-1RII的蛋白水平。与对照细胞相比,IL-5孵育的细胞中IL-1ra水平在24 h时几乎增加了一倍,IL-1β在24 h时增加了近4倍(图7a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).相比之下,24小时的暴露 单独使用SFM对sIL-1RII的产生没有影响,暴露于IL-5和IL-1β的细胞的sIL-1RII蛋白水平分别增加了10倍和20倍(图7b)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
人气道平滑肌(HASM)细胞培养基中抑制白细胞介素-1轴分子的蛋白释放。对比IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)和可溶性IL-1 II型受体(sIL-1RII)蛋白在HASM细胞培养液中积累(对照组),IL-5或IL-1β暴露24 h后(平均值±)gydF4y2BasdgydF4y2Ba).相对于对照组,IL-5和IL-1β处理后24小时细胞培养液中a) IL-1ra和b) sIL-1RII蛋白释放显著增加。实验进行了三个重复。gydF4y2Ba
最后,为了确定HASM细胞中IgE免疫复合物的致敏作用是否依赖于IL-5,我们测量了在不存在和存在IL-5ra的情况下IgE免疫cx处理的HASM细胞中IL-1β的释放。如图8所示gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba,将HASM细胞暴露于IgE免疫cxs可触发IL-1β释放到培养基中,并且在IL-5ra存在下,这种释放明显减弱。这些结果与本研究作者使用特应性哮喘血清之前的观察结果一致gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
免疫球蛋白E免疫复合物致敏的人气道平滑肌(HASM)细胞释放白介素(IL)-1β比较HASM细胞单独在无血清培养基中培养(对照)后,以及在不存在或存在IL-5受体拮抗剂(IL-5ra)的情况下,用IgE免疫复合物(IgE cxs)处理24 h后,IL-1β蛋白在培养基中的积累。相对于对照组,在24 h时,IgE cxs处理导致细胞培养液中IL-1β蛋白的释放显著增加,而IL-5ra预处理的细胞中这种作用显著减弱。实验进行了三个重复。gydF4y2Ba
综上所述,这些结果为以下观点提供了广泛的支持:事件序列是IgE触发的IL-5释放,后者触发IL-1β,后者直接调节抑制性和刺激性IL-1轴分子的表达。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
众所周知,IL-1是包括哮喘在内的各种疾病中炎症过程的重要介质gydF4y2Ba10gydF4y2Ba.IL-1β的多效性导致多种细胞的激活,包括参与哮喘病理生物学的细胞,如肥大细胞、T-和b -淋巴细胞、上皮细胞和气道平滑肌细胞gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.此外,根据IL-1β对ASM的直接作用,人类和动物研究已经确定IL-1β是诱导实验性哮喘气道反应性改变的关键分子之一gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.在这方面,值得注意的是,除了其收缩特性外,ASM还能够产生IL-1β以及广泛的其他炎症分子,这些分子与哮喘有关gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba.当前作者最近的一项研究也表明,当注入ASM细胞时,IL-1β能够调节数百个基因的表达,其中大量基因此前与哮喘的病理生物学有关gydF4y2Ba28gydF4y2Ba.这些研究进一步支持了这样一种观点,即除了在气道口径调节中的作用外,ASM还具有合成功能,产生参与气道炎症反应发展和哮喘气道反应性改变的分子。gydF4y2Ba
鉴于IL-1在哮喘中具有重要作用的证据,本研究检测了哮喘敏感性ASM中IL-1信号分子的表达、作用和调节。结果表明:1)ASM同时表达刺激性和抑制性IL-1轴分子的mRNA和蛋白,并且这些分子的表达在哮喘致敏状态下的ASM细胞中受到调节;2) 内源性产生的IL-1信号抑制剂IL-1ra和sIL-1RII可减弱暴露于IL-5、IgE cxs或IL-1β后ASM反应性的变化;3) 用IgE cxs、IL-5和IL-1β治疗ASM以与IgE触发的IL-5释放一致的时间依赖性方式诱导IL-1轴分子的mRNA表达,从而导致IL-1β的产生;4)IL-1轴蛋白通过ASM以与早期mRNA表达模式一致的方式表达。gydF4y2Ba
在本研究中,作者已经证明,用IL-1ra或sIL-1RII预处理ASM可以消融il -5诱导的ASM响应性变化(图1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和2gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).在对IgE免疫cx治疗的反应中观察到类似的结果。这些发现与早期的报告一致,这些报告显示,在特应性哮喘血清敏感型ASM (gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba含有高水平IgE(IgE)的血清大部分通过IL-1ra预处理去除gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,从而进一步支持这一概念,即ige诱导的ASM响应性变化归因于IL-5的诱导释放和自分泌作用,随后触发了IL-1β的释放。鉴于IL-1β在气道细胞中ASM反应性改变和多种炎症通路激活的发展中发挥重要作用,我们提出了其他IL-1家族分子成员的表达和作用可能参与了前哮喘表型的起始和延续,而IL-1轴分子表达和调节的紊乱可能是哮喘气道炎症反应失调的基础。目前的数据表明,IL-1β和其他IL-1轴分子参与启动和传播哮喘敏感型ASM诱导的气道反应性变化。gydF4y2Ba
如图3中的mRNA表达模式所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba其中,IL-5可诱导所有IL-1轴分子在3 h内的mRNA表达,但IL-1α的表达在任何时候都没有变化;IL-1β仅在6 h时表达增加。由于IL-5被认为在哮喘的炎症级联反应中起着关键作用,特别有趣的是,IL-5不仅用于诱导IL-1β的表达,但诱导所有其他IL-1家族成员的表达,这些成员以时间依赖的方式与IL-1受体复合物相关,先于IL-1β本身的表达。后一种观察支持了这样一种观点,即IL-5可能为IL-1信号通路的ASM“启动”,IL-5能够在诱导IL-1β本身产生之前,触发IL-1受体复合物所需的蛋白质的产生。这些有趣的新结果进一步揭示了IL-5在实验性哮喘中肺炎症和气道高反应性发展中的调节作用gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba研究表明,IL-5的作用在很大程度上归因于它触发了一个协调的IL-1反应。这一概念与之前的一项研究结果一致,该研究表明由IL-5启动的气道高反应性对随后的IL-5阻断不敏感gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba.因此,给HASM注射IL-5被认为首先诱导IL-1受体复合物和IL-1β的产生,这两者对于激动剂介导的气道反应和放大的炎症反应的改变是必要的。考虑到这一点,由此可见,在il -5介导的IL-1轴激活后,il -5指导的治疗干预可能不足以逆转IL-1β诱导的ASM反应变化,对哮喘前反应产生的治疗益处不大,这与之前的研究一致gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba. 此外,可以假设,通过阻止初始IL-5作用,产生的IL-1介导的信号可能被抑制,导致哮喘表型的表达减弱。gydF4y2Ba
如图3所示gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba四,gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba,几个IL-1轴基因的表达在3 h时对IgE免疫反应增加。然而,尽管IL-1信号转导所需的大多数分子的表达相对早地增加,但IL-1RI是一个显著的例外,它的表达直到暴露于IgE免疫cxs 24小时后才增加。由于IL-5蛋白的表达可在给予IgE免疫cxs后3小时发生,因此可以认为,在ASM中,IL-1RI的表达是继发于IgE介导的IL-5的产生,可能是随后IL-1RI在24小时升高的原因。事实上,在抗il -5单克隆抗体存在的情况下,后一种效应被消除了(数据未显示)。gydF4y2Ba
综上所述,上述研究表明,IL-1β、IgE免疫cxs和IL-5能够诱导IL-1信号转导所需的广泛蛋白的表达和释放,并且所有这些介质可能以协调一致的方式优化HASM中的IL-1信号转导。虽然这些介质的作用可能不同,以上证据表明IL-5是产生IL-1受体复合物的主要细胞因子,但其发生的机制仍有待阐明。gydF4y2Ba
鉴于IL-5在启动IL-1受体复合物转录中的作用,有趣的是,在IL-1家族的抑制成员中,IL-1RII (mIL-1RII)的膜结合形式是在IL-5给药后观察到的主要蛋白产物。可以推测,在IL-5存在的情况下,IL-1信号在ASM本身的水平上被调节。与IL-5相比,IL-1β主要诱导IL-1ra和sIL-1RII蛋白的表达,如图6所示,Western blot和免疫分析结果均表明gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和7gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba已有研究表明,sIL-1RII和IL-1ra通过分别结合细胞因子及其功能受体,至少部分地调节局部环境中IL-1β的水平。因为炎症细胞,尤其是嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞,在哮喘发作期间浸润到哮喘气道是已知的鉴于这些免疫细胞暴露于气道中的IL-1β,这些细胞中可能存在限制过度免疫反应的反调节机制。基于上述证据,似乎为了防止过度免疫反应,IL-1β刺激的ASM细胞产生IL-1ra和sIL-1RII,这两种细胞都是可溶性的可抑制参与局部气道促炎症反应的所有细胞类型中IL-1信号的ble蛋白。gydF4y2Ba
当正常情况下触发炎症反应时,IL-1轴分子sIL-1RII、IL-1ra和IL-1β以同步方式表达和释放,从而平衡免疫反应gydF4y2Ba31gydF4y2Ba最近的研究表明,在某些疾病状态下,IL-1β和IL-1ra的产生不平衡。这种现象也可能发生在哮喘敏感状态gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba33gydF4y2Ba.因此,IL-1轴分子的不平衡,或IL-1ra或sIL-1RII水平不足,或IL-1β水平过高,可能是导致哮喘前表型的基础。虽然角色IL-5和il - 1β在维持适当的细胞因子和抑制剂的平衡在哮喘气道仍不清楚,鉴于以上介质的调节能力的表达il - 1β本身和IL-1ra, sIL-1RII,和各种其他分子,表明这些细胞因子可能是合理的,至少是哮喘气道炎症反应失调的部分原因。gydF4y2Ba
总之,本研究表明,IgE免疫cxs、IL-1β和IL-5调节与IL-1受体复合物相关的多个分子的表达和作用。特别令人感兴趣的是发现IL-5能够在IL-1β自身转录开始之前诱导参与IL-1受体复合物的所有分子的产生,这意味着IL-5作为一种介质,可能有助于增强ASM对IL-1β的反应。这些发现与先前描述的过敏性哮喘血清引起ASM致敏时IL-5和IL-1β的顺序自分泌释放一致gydF4y2Ba9gydF4y2Ba. 由于在炎症级联反应中IL-5的表达先于IL-1β的表达,IL-1信号的必要成分被诱导细胞因子自身产生的同一介质上调。此外,与IL-5可能提供最初允许IL-1信号传导的环境的概念一致,随后可能通过诱导、上调表达和作用旨在抑制IL-1信号传导途径的mIL-1RII产生反调节机制。这将有助于限制ASM的IL-1β激活,而不会显著改变周围气道环境中可用的IL-1β的数量,从而可能允许正常参与哮喘特征性炎症反应的其他细胞旁分泌激活。相反,IL-1β处理的ASM主要产生sIL-1RII和IL-1ra,其作用是减少可与IL-1RI受体结合的IL-1β的数量,这是一种调节整体免疫反应和ASM激活的机制。gydF4y2Ba
根据这些证据,目前的作者得出结论,IL-1分子家族在调节气道平滑肌反应性、自身受体动态以及局部气道环境中的水平方面发挥着重要作用。这留下了几个有趣的治疗选择,在白介素-5和白介素-1β水平的哮喘,其中一些已经进行了研究gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,但可能需要对气道平滑肌本身进行优化。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者要感谢S. Chuang和J. S. Grunstein提供的专家技术援助。gydF4y2Ba
- 收到gydF4y2Ba2003年12月3日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2004年6月8日。gydF4y2Ba
- ©ERS期刊有限公司gydF4y2Ba
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