摘要
有氧训练(AT)可以减少呼吸困难和运动性支气管痉挛,提高有氧能力和生活质量,但其作用机制尚不清楚。本研究的目的是评估在建立气道炎症和重塑后,在小鼠过敏性肺炎症慢性模型中的AT效应。
小鼠分为对照组,AT组,卵清蛋白(OVA)基团或OVA + AT组,并暴露于盐水或OVA。AT was started on day 28 for 60 min five times per week for 4 weeks. Respiratory mechanics, specific immunoglobulin (Ig)E and IgG1,胶原蛋白和弹性纤维沉积,平滑肌厚度,上皮粘液,和嗜酸性粒细胞,CD3 +和CD4 +,IL-4,IL-5,IL-13,干扰素γ,IL-2的支气管周围密度,IL-1受体拮抗剂,IL-10,核因子(NF)-κB和Foxp3进行评价。
的OVA组显示IgE和IgG的增加1,嗜酸性粒细胞,CD3+,CD4+,IL-4,IL-5,IL-13,NF-κB,胶原和弹性,黏液合成,平滑肌厚度,肺组织阻力和弹性。OVA+AT组IgE、IgG升高1和减少嗜酸性粒细胞,CD3 +,CD4 +,IL-4,IL-5,IL-13,NF-κB,气道重塑,粘液合成,平滑与OVA组相比肌肉厚度和组织电阻和顺应性的(P <0.05)。的OVA + AT组也显示在IL-10的增加和IL-1受体拮抗剂(P <0.05),Foxp3的独立的。
AT逆转气道炎症和重塑和T辅助细胞2响应,并改善呼吸力学。这些结果似乎是由于发生的增加的IL-10和IL-1RA的表达,和NF-κB的降低。
哮喘的特征是慢性气道炎症和重塑、高反应性和T辅助细胞(Th)2细胞因子水平升高1. 哮喘气道中嗜酸性粒细胞和CD3-Th细胞亚群(主要是CD4+T细胞和肥大细胞)增多1,2;粘液分泌过多;平滑肌肥大和增生;增加子上皮胶原蛋白和弹性纤维的沉积;和增加的上皮厚度导致气道阻塞3。在哮喘的慢性炎症由Th2细胞因子介导的,主要是白细胞介素(IL)-4,IL-5和IL-13,其在维持炎症和气道重塑中发挥重要作用4. Th1细胞因子,特别是IL-2和IFN-γ也存在于哮喘患者中五然而,它在炎症中的作用仍有争议。一些研究表明Th1细胞因子可以减少哮喘的症状6虽然也有人认为Th1型细胞因子Th2的加剧哮喘反应五。
有氧训练(AT)已经作为哮喘患者的康复计划的重要组成部分7。AT减少呼吸困难,气道高反应,运动诱发的支气管痉挛和使用糖皮质激素,提高有氧能力和生活质量7. AT的好处在于提高了通气阈值,从而降低了轻度和中度运动时的分钟通气量8. 因此,呼吸困难和引发运动性哮喘的可能性可以减少或消除。AT也可以通过其他机制降低对呼吸困难的感觉,包括加强呼吸肌肉9。然而,通过对免疫系统介导的AT可能造成的影响已经不好评价。
在健康个体中,AT调制通过增加Th1应答的免疫系统出现抑制Th2细胞10个。例如,通过Th1细胞表达IFN-γTh2淋巴细胞的有氧训练的个人禁止显示增殖的淋巴细胞11个. 由Th1淋巴细胞和抗原提呈细胞产生的IL-12能增强IFN-γ的表达德意志北方银行。目前,很少有研究调查AT对Th2免疫反应的影响。Pastva等。13个维埃拉和他的同事14个,15个已经表明,AT降低白细胞迁移至气道以及IL-4和IL-5表达,免疫球蛋白(Ig)E水平和核因子(NF)-κB的表达在哮喘的动物模型。然而,这些研究主要批评是,在已启动同时在气道的挑战,这是没有显著炎症和结构的变化。这种情况可能并不代表提交到肺康复广大哮喘患者的临床状态。
因此,建立气道炎症后进行,并使用过敏性气道炎症的慢性模型重塑的目的是评估AT的影响,目前的研究。我们在调解这些影响研究NF-κB,Foxp3的,Th1和抗炎细胞因子的可能作用。AT的影响呼吸力学,IgE和IgG进行评价1抗原特异性的水平,气道嗜酸性粒细胞和CD3 +和CD4 + lymphocitary炎症。Th1细胞(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-4,IL-5和IL-13)细胞因子,以及监管/抗炎细胞因子(IL-10,IL-1受体拮抗剂)和表达的转录因子NF-κB和Foxp3,也进行了评价。
材料与方法
动物
28male BALB/c mice (aged 4 weeks and weighing 28±2 g) were maintained under standard laboratory conditions with controlled temperature (22±1°C) and relative humidity (40–60%) on a 12 h light/dark cycle. They were provided with food and water自由采食(Labina;普瑞纳,巴西)。实验方案经圣保罗大学医学院(巴西圣保罗)的伦理委员会。所有的动物关心和实验程序遵循赫尔辛基公约使用的国际建议和照顾动物。
慢性过敏性肺炎的协议
The mice were assigned to one of four groups (n = 7 in each group) as follows: control; AT; ovalbumin (OVA); and OVA+AT. The OVA groups received OVA (腹腔10个 μg·mouse-1)如前所述,在第0、14、28和42天用氢氧化铝稀释14个-16个. 第21天之后,小鼠暴露于OVA气雾剂(1%);30 min/次,每周3次,直到第54天。对照组和AT组均给予生理盐水。
体能测试和运动训练协议
On days 21 to 23 mice were placed on the treadmill (Inbramed, Brazil) for 15 min at a speed of 0.2 km·h-1和一个25°倾斜。在天25和53的最大运动测试如前所述进行14个-16个. 跑步机训练(体能测试中达到最大运动能力的50%)从第28天开始,每周进行5次,每次60 分钟,为期4 周(图1⇓)。
![图。1-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/5/994/F1.medium.gif)
实验方案的示意性时间线。0天,第14,28和42表示腹膜内(腹腔)卵清蛋白(OVA)注射。第21至54天代表暴露于卵清蛋白气雾剂。训练适应期从第21天到第23天,第25天和第53天是最初和最后的身体测试。有氧训练(AT)开始于第28天,结束于第52天。安乐死是在第56天进行的。
呼吸力学评价
Mice were anesthetised (50 mg-1·公斤-1腹腔thiopental), tracheostomised and connected to a rodent ventilator (FlexiVent; Scireq, Montreal, QC, Canada) with the tidal volume and frequency set at 10 mL·kg-1and 2 Hz, respectively. Oscillatory lung mechanics was performed by producing flow oscillations at different prime frequencies (from 0.25 to 19.625 Hz) for 16 s17岁。获得压力和流量数据,并在每个频率计算的气道阻抗18岁。组织阻抗和顺应性(GTIS和HTIS,分别地)通过施加恒定相位模型获得。
IgE和IgG1被动皮肤过敏法测定抗OVA抗体
被动皮肤过敏反应(PCA)中的溶液中的Wistar菲尔特大鼠和BALB / c小鼠的抗OVA IgE和IgG进行1, 分别。动物背部被剃光,并用不同的血清稀释皮内注射。The animals were challenged intravenously with 0.5 mg of OVA in 0.25% Evans Blue solution, after a sensitisation period of 18–24 h in rats for IgE and 2 h in mice for IgG1滴定法。PCA滴定值表示为最高稀释度的倒数,该稀释度在两次试验中产生直径大于5 mm的皮内过敏反应。在1:5稀释条件下建立了检测技术阈值的方法19个。
肺组织
肺部的5微米厚的切片用苏木精和曙红染色,以分析气道平滑肌厚度的肺结构和定量14个,20。天狼猩红用于支气管胶原纤维量化14个,21,用于弹性纤维维格特与氧化间苯二酚品红22和露娜用于检测支气管周的嗜酸性粒细胞14个,23。高碘酸 - 希夫(PAS)-alcian蓝(AB)用于评价合成的粘液14个,24。幻灯片进行编码和谁进行的测量研究者不知道研究组。使用一个Eclipse E-200显微镜(尼康,东京,日本),酷捕捉数码相机(配光曲线,东京)和图像分析软件Image PROPLUS 4.5(Media Cybernetics公司,贝塞斯达,MD,USA),我们评估气道平滑肌厚度,胶原和上气道壁弹性纤维沉积,和上皮粘液产生。在400×放大倍数五个气道对每个动物进行了评价。平滑肌层的面积是通过描绘其内到外边界定量。气道的胶原蛋白和弹性纤维沉积在上皮基膜之间压缩,直到气道外膜的区域进行了评价。胶原蛋白和弹性纤维的阳性面积表示为总气道壁面积的百分比。粘液生产,通过计数上皮面积为PAS / AB阳性,结果以百分比表达评估24。
免疫组织化学
将石蜡包埋的标本的5微米厚的切片用于确定的表达Foxp3的,IL-4,IL-5,IL-13阳性炎性细胞的支气管周围计数,IFN-γ,IL-2,NF-κB,IL-10,IL-1受体拮抗剂和CD3 +和CD4 +淋巴细胞,通过免疫组织化学技术14个. 简单地说,切片脱蜡,在甲醇溶液中加入0.5%的过氧化物酶10 min,抑制内源过氧化物酶活性。用柠檬酸盐溶液进行抗原回收30 min。切片用抗Foxp3(1:550)、抗IL-4(1:600)、抗IL-5(1:700)、抗IL-13(1:300)、抗IFN-γ(1:400)、抗IL-2(1:500)、抗NF-κB(1:600)、抗IL-10(1:700)、抗IL-1ra(1:750)、抗CD3+(1:500)和抗CD4+(1:400)孵育(Santa Cruz Biotechnology在48℃下过夜。ABC Vectastain试剂盒(Vector Elite PK-6105;Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)用作二级抗体,3,3二氨基联苯胺(Sigma Chemical Co.,St Louis,MO,USA)用作显色剂。切片用哈里斯苏木精(德国达姆施塔特默克公司)复染。所有一级和二级抗体均应用于阴性和阳性对照。幻灯片是编码的,进行形态测量分析的研究人员不知道研究组。用50行100点(1000倍放大;10000μm)的网状眼分析上述抗体阳性炎症细胞的支气管周围计数,以及CD3+、CD4+T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的计数2区域)25。细胞密度被确定为在每个字段由组织面积除以阳性标记的细胞的数目,并表示为细胞·微米-2。然后将结果转化到细胞·毫米-2通过调整单元25,26。
统计分析
参数数据是由双向ANOVA,然后由学生纽曼 - 科伊尔斯分析事后试验和非参数数据采用双向方差分析,然后采用Holm-Sidak进行分析事后测试。数据表示为平均值±SD参数数据和中位数(方差)非参数数据。显着性水平调整为5%。Parametric data are presented as bars (figs 2⇓和3⇓) and nonparametric data as box plots (figs 4⇓,5⇓和6⇓)。
![图2-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/5/994/F2.medium.gif)
肺力学。a) 组织阻力(GTIS)和b)的组织顺应性(HTIS). AT:有氧训练;OVA:卵清蛋白。对照组:非敏感组和非训练组;AT组:非敏感组和AT组;OVA组:敏感组和非训练组;OVA+AT组:敏感组和AT组(对照组和OVA)。结果显示为平均值±SD所有群体。*:P <0.05时与其他组进行比较。
一)弹性纤维,b)中的胶原纤维,c)中的上皮粘液合成和d)平滑肌厚度。AT:有氧训练;OVA:卵清蛋白。对照组:非致敏和非培训;AT组:非致敏和AT;OVA组:致敏和未受过培训的;OVA + AT:致敏和AT(控制和OVA)。结果表示为平均值±SD对于所有组。*与对照组和AT组比较,p<0.05;¶:P <0.05时与其他组进行比较。
![图4-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/5/994/F4.medium.gif)
一)嗜酸性粒细胞,B)CD4 + T淋巴细胞,和c)CD3 + T淋巴细胞的支气管周围密度。AT:有氧训练;OVA:卵清蛋白。对照组:非致敏和非培训;AT组:非致敏和AT;OVA组:致敏和未受过培训的;OVA + AT:致敏和AT(控制和OVA)。结果表示为平均值±SD. *与其他各组比较,p<0.05;¶:P <0.05当与所有非致敏组相比。
![图5-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/5/994/F5.medium.gif)
T辅助细胞的支气管周围表达细胞因子2一个)白介素(IL)-4+,B)IL-5 +和c)IL-13 +炎症细胞。AT:有氧训练;OVA:卵清蛋白。对照组:非致敏和非培训;AT组:非致敏和AT;OVA组:致敏和未受过培训的;OVA + AT:致敏和AT(控制和OVA)。结果表示为平均值±SD。***:P <0.001,与其它各组比较。
一)干扰素(IFN)-γ+,B的支气管周围密度)白细胞介素(IL)-2+,c)中的Foxp3 +,d)核因子(NF)-κB,E)IL-10 +和f)的IL-1ra +。AT:有氧训练;OVA:卵清蛋白。对照组:非致敏和非培训;AT组:非致敏和AT;OVA组:致敏和未受过培训的;OVA + AT:致敏和AT(控制和OVA)。结果表示为平均值±SD. *与其他组比较,p<0.05;#与对照组和AT组相比,p<0.05。
结果
运动能力
Control and OVA groups did not present changes in the maximal exercise capacity when we compared the initial and final tests (p>0.05) (table 1⇓)。当在与非训练组比较初始和最终的测试进行比较(P <0.01),并且还AT和OVA + AT组介绍了改进的运动能力(控制和OVA; P <0.01)。
OVA特异性IgE和IgG1
OVA致敏增加IgE和IgG1titres when compared with non-sensitised groups (p<0.01) (table 1⇑),并在致敏的动物没有改变IgE和IgG1滴度用OVA组(p> 0.05)相比时。
呼吸力学
AT非致敏小鼠并没有改变摹TIS和HTISwhen compared with the control group (p>0.05) (fig. 2⇑)。OVA曝光增加摹TIS和HTIS与对照组和AT组比较(p<0.05)。在致敏动物(OVA+AT组)中进行AT,导致G降低TIS和HTIS和....相比control levels (p<0.05) (fig. 2⇑)。
支气管周嗜酸性粒细胞,CD3 +和CD4 + T细胞
AT in non-sensitised animals (AT group) did not change the peribronchial density of eosinophils and CD3+ and CD4+ T lymphocytes compared with the control group (p>0.05) (fig. 4⇑). 慢性OVA暴露组支气管周围嗜酸性粒细胞、CD3+、CD4+T淋巴细胞密度高于非敏感组(p<0.05)。与OVA组相比,AT致敏动物(OVA+AT组)支气管周围嗜酸性粒细胞、CD3+和CD4+淋巴细胞显著减少(p<0.05),与非致敏组相比增加(p<0.001)(图4)⇑)。
Th2细胞因子的表达支气管周围
AT in non-sensitised animals did not change the peribronchial expression of IL-4, IL-5 and IL-13 when compared with the control group (p>0.05) (fig. 5⇑)。当与未致敏组(p <0.05)相比OVA致敏增加IL-4,IL-5和IL-13的表达支气管周围。The OVA+AT group presented a significant decrease in the peribronchial expression of IL-4, IL-5 and IL-13 (p<0.05) when compared with the OVA group (fig. 5⇑)。Figure 7⇓示出了在所有组中IL-5的支气管周围表达的代表性显微照片。
![图7](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/5/994/F7.medium.gif)
炎症细胞在支气管周围表达白细胞介素5的显微照片。注意,大多数表达IL-5的细胞是单核细胞。a) 卵清蛋白(OVA)组(敏感组和非训练组),b)OVA+有氧训练(AT)组(敏感组和AT(对照组和OVA)),c)对照组(非敏感组和非训练组),d)AT组(非敏感组和AT)。比例尺 = 25 μm。
Th1时,规则/抗炎细胞因子的表达支气管周围IL-10和IL-1受体拮抗剂,和NF-κB和Foxp3
AT组IL-2、IFN-γ、Foxp3、IL-10、IL-1ra和NF-κB的表达与对照组比较无显著性差异(p>0.05)(图6)⇑). OVA组支气管周围NF-κB表达较对照组明显升高(p<0.05)。而OVA敏感性对IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-1ra的表达无明显影响(p>0.05)。OVA+AT组NF-κB表达降低(p<0.05)(图6c)⇑),并且当与OVA组(p <0.05)相比,增加的IL-10和IL-1RA的表达。的OVA + AT组并没有改变的IL-2和IFN-γ的表达支气管周围。的Foxp3的表达不是由OVA诱导的变应性炎症或由AT在致敏的动物(P> 0.05)改性。
气道重塑
The AT group did not change airway collagen and elastic fibre deposition, smooth muscle thickness or mucus production when compared with the control group (p>0.05) (fig. 3⇑). 与对照组相比,OVA敏感性增加了气道胶原和弹性纤维沉积、平滑肌厚度和上皮粘液生成。OVA+AT组较OVA组气道胶原沉积、平滑肌厚度及上皮黏液生成均明显减少(p<0.05),而弹性纤维无明显变化(p>0.05)。
讨论
本研究表明,有氧训练反转嗜酸性粒细胞,CD3 +和CD4 +淋巴细胞,IL-4的支气管周表达,IL-5,IL-13,NF-κB,胶原纤维的沉积和增加气道平滑肌厚度的OVA诱导的支气管周围积累和上皮粘液产生,以及减少组织性和顺应性。我们的结果还表明,这些效应与抗炎细胞因子IL-10和IL-1受体拮抗剂的表达增加有关。
参与AT项目的哮喘患者糖皮质激素消耗、呼吸困难和运动性支气管痉挛减少,有氧能力和健康相关生活质量特征改善7,9。以前的实验研究调查的假设是,在哮喘患者这种影响可能与运动训练的抗炎作用有关13个-15个. 帕斯瓦等。13个表明AT降低中性粒细胞浸润到呼吸道,IL-4水平在支气管肺泡灌洗液和NF-κB的表达;似乎介导的,至少部分,由内源性糖皮质激素的影响。维埃拉和他的同事14个,15个证明低强度或中等强度也能降低嗜酸性粒细胞炎症和IL-4和IL-5的表达,这些作用至少部分地由抗炎细胞因子IL-10的增加介导。尽管这些研究在描述肺过敏性炎症的抗炎作用方面是独特的,但这两种模型都有一个主要的批评:运动训练是在OVA挑战的同时开始的,因此,在气道炎症和结构改变发展之前。
我们使用的过敏性肺部炎症的慢性动物模型和运动训练是建立气道炎症和重塑后开始。Our results demonstrate that AT reverses airway eosinophilic migration (fig. 4a⇑) and lymphocyte migration (CD3+ and CD4+) (fig. 4b⇑和c)。这些结果如CD3 +和CD4 + T细胞高度相关涉及IgE的特定合成和具有通过嗜酸性粒细胞的募集上气道的直接作用27以及作为促炎Th2细胞因子(IL-4,IL-5和IL-13),它们的发展和呼吸道炎症的维护和重塑相关的源极4。
例如,IL-4似乎延续肥大细胞活化,这是负责IgE和IgG1释放、嗜酸性粒细胞活化和募集、粘液产生及在Th2维持中的作用1,2,28。IL-5刺激增殖,分化,迁移,在骨髓嗜酸性粒细胞的存活和激活,并且是趋化到嗜酸性粒细胞4,26降低IL-2对嗜酸性粒细胞迁移的抑制作用29。IL-13导致由气道上皮细胞黏液产生增加的水平4,24。Our study showed that AT decreased the peribronchial expression of IL-4, IL-5 and IL-13 by inflammatory cells, predominantly by mononuclear cells (fig. 5⇑)。这些数据强化了AT能够扭转哮喘的鼠模型中的Th2免疫应答。
气道重塑被定义为在气道中具有增加的胶原蛋白和弹性纤维及其他细胞外基质蛋白,平滑肌增生和肥大的沉积结构改变的存在,以及杯状细胞增生,随后过度粘液分泌3。以前studies using animal models have shown that after 30 days exposure to OVA inhalation mice present with airway remodelling三十-32。In the present study, the AT was started after 28 days of OVA inhalation and our results demonstrate that AT reduces OVA-induced airway remodelling, including collagen fibre deposition, smooth muscle thickness and mucus production in this murine model of asthma (fig. 3⇑)。由于没有以前的研究已经表明,AT能逆转气道炎症和重塑这些数据是相关的。Our murine model of asthma also resulted in an increased tissue resistance and elastance, which was completely reversed by AT (fig. 2⇑). 我们的研究结果进一步证实了先前的发现,即在敏感小鼠中,肺力学的变化似乎与气道炎症和重塑有关31-33。
通过增加Th1应答(IL-2和IFN-γ1)):我们评估三个可能的机制,通过该运动可以调节观察到的效果34(2)通过改变调节性细胞因子(IL-10和IL-1ra)的表达35;和3)通过调节NF-κB和Foxp336-38。We observed that AT did not change the expression of IL-2 and IFN-γ either in non-sensitised or in sensitised mice (fig. 7a⇑和b),这表明AT在我们的哮喘小鼠模型中的有益作用不是由Th1反应的改善介导的。我们还观察到,在致敏动物炎性细胞暗示它可能由AT诱导既抗炎和抗纤维化作用参与减少NF-κB的支气管周围表达。此外,我们还表明,在增加的抗炎细胞因子IL-10和IL-1RA的表达支气管周围表达。我们发现,Foxp3的水平不变,要么后OVA炎症或运动,这表明我们的动物模型的增加,IL-10似乎是独立的Foxp3调控的发生。
在哮喘患者诱导受试者通过在临床益处7,39已经被解释为呼吸阈值的降低8。我们的研究是第一个评价在效果几经OVA吸入模拟气道炎症,如哮喘患者发生。我们的研究结果可能表明,改善在可调节气道过敏性炎症。有趣的是,最近的一项研究显示,具有较高的体能目前哮喘的女性与哮喘发作的发作较少。作者假设,增加体质应作为哮喘辅助治疗40,这是由我们的研究结果的支持。
结论
我们的结论是AT逆转气道炎症和重塑,改善呼吸力学和减少哮喘小鼠模型Th2免疫应答。这些影响似乎响应于NF-κB的表达和抗炎细胞因子IL-10和IL-1RA的表达增加减少发生。我们的数据完全支持“新概念”是体质应作为哮喘的辅助治疗。
支持声明
T. Mauad,C.RF.卡瓦略和文学硕士马丁斯从Conselho国立DesenvolvimentoCientíficoËTecnológico高级研究员。这项研究是由披肩资助,Fundação日安帕罗àPesquisa做斯卡德圣保罗和LABORATORIOInvestigação国医国药(LIM-20),诊所医院,医学院(圣保罗大学,巴西圣保罗)。
利益声明
无声明。
- 收到2009年3月26日。
- 公认2009年10月7日。
- 版权所有ERS期刊有限公司