文摘
细胞凋亡和增殖的影响外源性肺表面活性剂对这些流程进行机械通风/ oxygen-treated早产儿呼吸窘迫综合征和死产胎儿。
凋亡和增殖指数测定肺组织部分来自27个通风/ oxygen-treated早产儿和29死产胎儿。外源性表面活性剂对细胞凋亡和增殖的影响,研究了在16个通风早产儿;11治疗婴儿作为控制。凋亡和增殖细胞被双标签结合终端deoxynucleotidyltransferase-mediated脱氧尿苷三磷酸尼克end-labelling或者Ki 67细胞标志蛋白。细胞死亡通路是探索的immunolabelling裂解还存在高3 8和9。
在肺部的通风/ oxygen-treated早产儿,凋亡和增殖细胞的数量显著增加而相应的数字流产胎儿的肺部。在肺泡上皮细胞凋亡检测,而上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。表面活性剂处理减少细胞凋亡诱导通风/氧气治疗;然而,降低不显著。还存在8和9不会导致ventilation-induced应承担的细胞凋亡,而半胱天冬酶3有关。
总之,通风/氧气治疗诱导上皮细胞凋亡和增殖的上皮、内皮细胞和平滑肌细胞在肺部的早产儿。
几个过程中细胞凋亡和增殖在胚胎和胎儿生命和发挥重要作用在正常细胞营业额和组织发展。
尽管他们牵扯机制获得正确的手机号,它们参与病理过程。在肺中,这些过程会导致氧损伤引起的高氧浓度。然而,氧气疗法往往患有肺部疾病的必要条件。尤其是早产儿和新生儿呼吸窘迫综合征(RDS),他们需要supraphysiological维持充足的血氧浓度的紧张。
在动物模型中,证明了细胞凋亡明显增加肺部暴露于氧过多1- - - - - -3。此外,它可以表明,氧过多诱发apoptosis-promoting基因编码蛋白的表达增加1,2。然而,扩散停止由于氧过多与肺泡上皮细胞在细胞培养实验中,成纤维细胞和气管平滑肌细胞4- - - - - -6。
外源性表面活性剂RDS的治疗仍然是一个建立治疗。最近,它已经变得越来越明显,外源性表面活性剂准备有显著影响细胞生理和肺部炎症过程包括抑制促炎细胞因子、超氧化物肺宿主防御的生产和监管7,8。然而,没有什么了解的影响表面活性剂在肺组织细胞的凋亡和增殖hyperoxia-damaged肺。
尽管细胞凋亡和增殖明显发挥重要作用的发展和氧损伤肺组织,调查仅仅是对动物模型,且只有一个最近的研究认为细胞凋亡与RDS几个通风早产儿的器官9。在目前的工作报告进行了研究细胞凋亡和增殖,尤其是人类流产胎儿的肺和肺组织的早产儿RDS暴露在机械通气和氧浓度升高。两个过程的组成部分肺的发生发展和通风的影响在高氧浓度对细胞凋亡和增殖进行了研究。在这些hyperoxia-damaged过早人类肺部,可能表面活性剂对细胞凋亡和增殖的影响也被研究。此外,调查是否还存在高3列车8或9应承担被激活的信号级联,导致细胞凋亡。
材料和方法
研究人群
报告从所有婴儿尸体解剖过程中执行部门的病理学(德国维尔茨堡大学维尔茨堡)综述了1985 - 2000年期间。
胎儿和早产儿22-36交货周的妊娠没有肺部和泌尿生殖畸形被选为研究如果他们没有显示出肺炎、绒毛膜羊膜炎,炎症的脐带和胎盘炎;159例达到这些标准。相应的肺组织解剖样已经常formalin-fixed和石蜡包埋。部分被切割的厚度4µm和苏木精和伊红染色。他们检查了显微镜下,只有nonautolytic本研究和保存完好的材料选择。56受试者选择和研究人口分为两组。一组由29岁的死产胎儿22-36周的妊娠(平均28.0±0.8±sem周)和其他27个婴儿住在23-36周的早产儿与RDS(27.9±0.7周),曾收到通气支持和补充氧气。综述了通风机记录和平均每日吸入氧气比例和平均气道压力测定和平均呼吸机治疗的持续时间。
为了调查是否凋亡和增殖细胞的数量的变化取决于通风时间的氧气浓度升高,早产儿RDS被分成三组,婴儿通风0 - 1天,1 - 3天,> 3天,分别。此外,表面活性剂处理和:被认为是在机械通风/ oxygen-treated早产儿RDS。
婴儿的临床细节研究表1中给出⇓。
终端deoxynucleotidyltransferase-mediated脱氧尿苷三磷酸尼克end-labelling化验
脱氧核糖核酸(DNA)分化与凋亡的检测是通过终端deoxynucleotidyltransferase-mediated脱氧尿苷三磷酸尼克end-labelling (TUNEL),使用一个Apopdetect工具包(Qbiogene、海德堡、德国)根据制造商的指示。过氧化物酶是观想使用20毫克·L−13,3 '还是diaminobenzidine tetrahydrochloride 0.05三-(羟甲基)氨基甲烷(三)(pH值7.6)包含0.01%过氧化氢。标本在水冲洗和复染色1 g·L−1迈耶的苏木精解。消极的控制处理标记脱氧尿苷三磷酸deoxynucleotidyltransferase没有终端。
Ki量67免疫组织化学
采用示范Ki量67进行雇佣一个兔多克隆抗体针对Ki 67 (Dako,汉堡,德国)稀释1:50 in0.25 M磷酸盐(PBS) (pH值7.4)/ 10% foetalcalf血清(FCS)和链霉亲和素、生物素共轭工具包(美国Biogenex,圣拉蒙,CA)与20 mg·L−13,3 '还是diaminobenzidine tetrahydrochloride色原,0.05三羟甲基氨基甲烷(pH值7.6)液中含0.01% H2O2。组织部分微波六次5分钟每个在800 W 10毫米柠檬酸缓冲(pH值6.0)。消极的控制由样品提交和PBS / FCS初级孵化。的部分是复染色1 g·L−1迈耶的苏木精解。
量化细胞凋亡和增殖
为了量化肺组织细胞凋亡和增殖的程度,四个随机领域从每个组织切片拍摄40倍放大使用蔡司应承担Axiophot显微镜(蔡司、从、德国)和爱克发RSX二世电影(Agfa-Gevaert、勒沃库森、德国;ASA 50)。幻灯片被认为与幻灯机(Kindermann魔法屏幕IR、Ochsenfurt、德国)对随后的计算,手动执行。原子核的总数和积极染色细胞核的数量在每个字段确定;500 - 750核领域,即。2000 - 3000核/组织切片。凋亡指数(AI)计算了原子核的总数的百分比,TUNEL检测阳性或凋亡,增殖指数(PI)和Ki的百分比量67的应用。
半胱天冬酶免疫组织化学
免疫组织化学检测的裂解,即。还存在激活,8和9,应承担的单克隆抗体11 g10(美国新英格兰生物学实验室,贝弗利,MA)和一个兔多克隆细胞凋亡蛋白酶9裂解位点(315/316)提供有关特定抗体(Biosource国际、显示、比利时)使用,每个稀释1:50 0.25 PBS FCS (pH值7.4)/ 10%。尽管组织部分提交给裂解半胱天冬酶量9 immunolabelling没有微波,组织的免疫组织化学检测部分裂解半胱天冬酶量8是微波两次5分钟用柠檬酸缓冲。使用链霉亲和素免疫组织化学进行/生物素过氧化物酶的方法。
地理检测激活半胱天冬酶3、组织部分在柠檬酸缓冲煮上5分钟,在124°C和应用使用激活半胱天冬酶3抗体(新英格兰生物学实验室)稀释1:20和Histostain +工具包(Zytomed,柏林,德国)。
双immunolabelling
执行双重immunolabelling immunoperoxidase结合3 3 '必经diaminobenzidine tetrahydrochloride作为检测TUNEL阳性细胞核应承担的发色团和Ki 67,分别和immunoalkaline磷酸酶与快速蓝色BBN重氮盐和磷酸萘酚作为必经MX作为检测细胞角蛋白18衬底,CD34或肌肉肌动蛋白。过氧化物酶开发使用20毫克·L−13,3 '还是diaminobenzidine tetrahydrochloride 0.05三羟甲基氨基甲烷(pH值7.6)液中含0.01% H2O2和碱性磷酸酶活性呈现现代50毫升1 mg·毫升−1快蓝色BNN重氮盐在三(pH值7.4)包含1毫升N,N高二甲基甲酰胺在10毫克萘酚磷酸MX和25毫克左旋咪唑10分钟给蓝色的存款。鼠单克隆抗体针对细胞角蛋白18(克隆DC 10), CD34(克隆QBEnd 10)和肌肉肌动蛋白(克隆HHF35;所有Dako)稀释1:50 0.25 PBS (pH值7.4)/ 10% FCS在一夜之间和孵化。抗体检测采用链霉亲和素、生物素共轭工具包(Biogenex,汉堡,德国)。
统计分析
单向方差分析是用来比较的差异AI和π死产胎儿在不同妊娠年龄的。流产胎儿的AIs和π与机械通风/ oxygen-treated早产儿和表面活性剂使用Mann-Whitney U /参与组比较治疗量测试。人工智能的差异和π为不同持续时间的机械通气/氧治疗进行分析利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验之后bypairwise比较使用Mann-Whitney U量测试。Ap值< 0.05被认为是显著的。数据中位数和四分位范围。
结果
细胞凋亡和增殖在人类胎儿肺(死产胎儿)
从人类死产胎儿肺部分年龄22-36周的妊娠检查的凋亡细胞,是形象化原位用TUNEL检测。它也不能排除坏死细胞包含TUNEL 3 '羟基应承担的DNA浓度可染色的目的。然而,TUNEL检测阳性的细胞显示细胞凋亡的形态学特征,如致密的细胞核和细胞收缩。此外,激活半胱天冬酶的免疫组织化学染色法检测3,一个重要的刽子手半胱天冬酶的凋亡信号通路,是执行。这证实了细胞凋亡的发生和TUNEL化验的结果。
量化TUNEL检测阳性细胞核显示无显著变化,人工智能在胎龄胎儿肺22-36周。人工智能中值为0.8(0.4 - -1.5)仍然保持不变。
相同的肺受到Ki检测样品67免疫组织化学测定细胞增殖的程度。π中值保持恒定在1.8(1.4 - -3.2)的发展在这一时期。
肺部细胞凋亡和增殖的早产儿呼吸窘迫综合征治疗通风在氧气浓度升高
在肺组织的部分从早产儿RDS 23-36岁周的妊娠需要机械通气和补充氧气,相当多的TUNEL检测阳性细胞核被证明比从死产胎儿肺组织部分(图1 a和b⇓)。这个结果证实了anti-activated地理半胱天冬酶3免疫组织化学,也揭示了更多的凋亡细胞在肺组织的部分从机械通风和oxygen-treated早产儿比从死产胎儿(图2所示⇓)。
细胞发生凋亡的平均比例在肺部的通风/ oxygen-treated RDS婴儿高出6倍流产胎儿的肺部的人工智能中值(通风/ oxygen-treated婴儿4.8(2.4 - -10.4),死产胎儿0.8 (0.4 - -1.5);p < 0.001)(图3⇓)。
地理与TUNEL阳性细胞,细胞增殖(Ki量67量积极)在早产儿肺的RDS长大与机械通气/氧气治疗(图1 c和d⇑)。π中值为3.9这组(1.9 - -6.7)和1.8(1.4 - -3.2)在胎儿流产组(p < 0.01)(图3 b⇑)。
水平的细胞凋亡和增殖依赖于机械通气的时间在氧气浓度升高
与人工智能流产胎儿的肺部,TUNEL阳性细胞应承担的比例与RDS从早产儿肺,在氧气浓度升高,通风后显著增加< 1天的通风,以及1 - 3天后> 3天的通风(死产胎儿0.8(0.4 - -1.5),通风< 1天2.8(1.0 - -8.0),3.3(2.2 - -7.7),1 - 3天> 3天13.3 (7.5 - -15.5);p < 0.001)(图4⇓)。
机械通气时间的影响在π在肺部的氧气浓度升高的早产儿RDS也被评估。π中值增加而延长通风(死产胎儿1.8(1.4 - -3.2),通风< 1天2.8(1.5 - -4.6),3.7(2.4 - -5.0),1 - 3天> 3天6.9 (6.0 - -10.7);p < 0.001)(图4 b⇑)。
凋亡和增殖细胞的识别
双染色死产胎儿肺的显示,在肺癌发展阶段发生在22 - 25周的妊娠,稀疏TUNEL检测——积极核优先局部间叶细胞和内皮细胞(图5 a和b⇓),而在老流产胎儿的肺(26-36周的妊娠),主要在肺泡上皮细胞凋亡细胞核被发现(图5度⇓)。
在肺标本与RDS暴露于机械通气早产儿氧气浓度升高,双标签显示主要细胞角蛋白18还是积极的上皮细胞凋亡(图6 a和b⇓)。相比之下,只有少数TUNEL检测阳性细胞核中CD34阳性血管内皮和平滑肌α应承担actin-positive肌肉细胞。
双标签进行识别增殖细胞类型显示,没有首选的细胞类型,无论是从死产胎儿肺组织还是在机械通风/ oxygen-treated肺标本。
表面活性剂对细胞凋亡和增殖的影响
通风的AIs以及π/ oxygen-treated早产儿与RDS接受表面活性剂相比之下,那些没有。
的平均人工智能通风/ oxygen-treated婴儿的肺部RDS接受表面活性剂是不到一半,发现病人不是表面活性剂处理(表面活性剂3.3(2.8 - -7.5),没有表面活性剂7.4(1.6 - -11.7))(图7所示⇓)。然而,统计分析表明,在人工智能实验组之间差异不显著。
π的中位数的肺机械通风/ oxygen-treated早产儿与RDS的存在和没有表面活性剂治疗是相同的(表面活性剂3.9(1.9 - -7.9),没有表面活性剂3.8 (1.9 - -6.5))。因此,扩散显然不受表面活性剂的影响治疗的肺机械通风/ oxygen-treated早产儿RDS。
途径凋亡在机械通风/ oxygen-treated肺
为了探索生化途径导致流产胎儿的肺部细胞死亡和通风/ oxygen-treated早产儿RDS, immunolabelling劈裂还存在高3 8和9了。
在流产胎儿的肺组织,还存在裂解8和9偶尔观察,应承担的上皮和间质细胞。在氧气浓度升高,通风后没有变化的程度或分布的裂解半胱天冬酶量8或者9应承担的应承担immunopositive细胞。
然而,在肺组织的通风/ oxygen-treated早产儿RDS,相当数量的增加激活半胱天冬酶3是检测而应承担的死产胎儿的肺组织。如图2 b⇑,激活半胱天冬酶3 immunopositive细胞大量和主要肺泡上皮细胞。相反,在流产胎儿的肺部,激活半胱天冬酶3只是检测免疫组织化学(图。2⇑)。
讨论
在目前的研究中,这是表明,凋亡和增殖细胞的数量显著增加从早产儿肺与RDS机械通气在氧含量升高的结果。外源性表面活性剂没有对细胞增殖的影响,但可能有一个凋亡效应。引发剂还存在8和9等细胞凋亡信号通路没有导致机械通气诱导细胞凋亡atelevated氧气浓度,而半胱天冬酶3有关。
应该记住,承担临床治疗的早产儿是一个复杂的过程协调个人需要的病人。因此,一个组织的某些异质性检验无法避免。此外,机械通气辅助的氧气与氧过多以及高架气道压力和机械拉伸,和所有这些因素可能对细胞凋亡和增殖起到不同的作用。激活细胞凋亡和增殖的机制由物理力量仍有待调查。循环拉伸后细胞凋亡已被证明在II型上皮细胞和成纤维细胞10,11。鼠肺成纤维细胞的增殖,抑制了机械拉伸循环12地理,而α平滑肌细胞,应变增加扩散13。肺部细胞对氧过多的反应进行了调查在动物模型中,有接触氧过多可以诱导细胞凋亡和增殖1- - - - - -3,11。本研究机械通风的影响在高氧浓度对细胞凋亡和增殖的早产儿肺部RDS导致结果有很好的一致性与氧过多的发现在动物模型。
目前的研究清楚地表明,增殖和凋亡在人类胎儿肺是正常的流程在微管的和囊状肺的发展阶段。扩散是在上皮细胞、内皮细胞和肌肉细胞,发现与之前的调查相一致14。π是低,周22-36怀孕期间没有显著变化。相比之下,其他调查人员描述逐渐减少扩散在人类妊娠晚期肺15。
凋亡活性的人类流产胎儿的肺部检查发育时期也lowand并未改变。withstudies这个结果很好协议,描述了低恒AIs像老鼠16和人类胎儿肺15。根据所得研究结果与兔子17观察一个转变,从更多的间叶细胞和内皮细胞主要是上皮细胞凋亡在从终端囊状的微管的过渡阶段(26日妊娠周)。有可能增加上皮细胞分化的细胞凋亡可能与II型肺泡上皮细胞类型,发生在这个时候18。
提供的数据表明,凋亡的数量andproliferating人类胎儿的肺细胞显著增加机械通风在氧气浓度升高。
π的中位数从早产儿肺是增加2.2倍。这个观察是矛盾结果在细胞培养实验中,氧过多抑制成纤维细胞的增殖5平滑肌细胞4和上皮细胞19。停止扩散被认为代表一个基本的保护机制,防止损坏模板DNA的复制。p21分子如WAF / CIP1促进细胞周期阻滞和p53,期间调节氧过多20.酸和信使核糖核酸(mrna)编码细胞周期蛋白组蛋白和胸苷激酶不是氧条件下翻译19。然而,在大鼠肺和肺移植文化,在氧的条件下,增加扩散,尤其是肺泡II型细胞和成纤维细胞,观察10,11。这表明,与细胞培养实验中,组织细胞增殖是细胞/细胞相互作用影响不同的细胞类型。有丝分裂原,如碱性纤维母细胞生长因子821,角化细胞生长因子22,我和胰岛素样生长因子23可能会刺激增殖在复苏。在组织修复过程中,扩散的肺细胞类型可以被探测到24。在氧气浓度升高,肺通风没有优先增殖细胞类型可以被识别。
深刻的肺组织细胞凋亡的增加人类的早产儿,接受通气和氧的支持,达到了AI是6倍高于中位数死产胎儿。
此外,机械通气时间/氧气治疗早产儿肺细胞凋亡中起着至关重要的作用。随着机械通气时间在氧含量升高,大大增加平均凋亡细胞的比例可以证明。在几个氧动物模型系统,细胞发生凋亡的比例的增加是同样的与时间有关的1,2。这可能是由于活性氧的积累(ROS)。研究对肺泡上皮细胞培养显示执行引起的细胞凋亡并不是纯氧,而是ROS25。这些分子是在线粒体的电子传递系统26通过渗透中性粒细胞和实验细胞27和氧化酶类28。在肺组织活性氧积累长期通风在氧气浓度升高。细胞抗氧化系统的不成熟在早产儿肺部29日最有可能导致缺陷清除ROS和H2O2通过抗氧化剂andprevents有效限制调节分子的氧化剂破裂损伤导致细胞生理学的改变和细胞凋亡。
肺的机械通风/ oxygen-treated早产儿的RDS 23-36周的妊娠期,细胞凋亡是优先增加肺泡和细支气管上皮细胞。在老鼠身上,Barazzoneet al。1发现,此外,在氧过多增加肺内皮细胞的凋亡。研究细胞凋亡在肺部的机械通风/ oxygen-treated早产儿RDS,这个发现也没有被证实。肺泡上皮细胞作为一线防御氧的侮辱和含有抗氧化活性,增加氧的条件下,对II型pneumocytes如图所示30.。肺的其他研究动物暴露于氧过多还透露,尽管所有细胞车厢危险性氧化损伤,肺泡和细支气管上皮细胞结合氧毒性和凋亡的主要目标3。
自不同的研究在动物模型和细胞培养haveemphasised肺表面活性物质的生理和免疫调节作用7,8外源性表面活性剂对细胞凋亡和增殖的影响在通风/ oxygen-treated肺是感兴趣的。以前,它已经表明,表面活性剂在成纤维细胞抑制增殖的文化8也,表面活性剂脂质引起抑制mitogen-induced淋巴细胞增殖31日。然而,在肺部与RDS暴露于机械通气早产儿和补充氧气,外源性表面活性剂没有对扩散的影响。
关于细胞凋亡,只有趋势观察外源性表面活性剂的保护作用。表面活性剂处理后人工智能中值下降;然而,降低不显著。
细胞凋亡的主要效应是aspartate-specific蛋白酶家族,还存在。模型提出了激活半胱天冬酶8应承担的死亡受体介导细胞凋亡,而半胱天冬酶量9是激活药物治疗,或用紫外线或化学诱导物32。到目前为止,无论是半胱天冬酶检测8还是半胱天冬酶9已经调查了在人类发展中应承担的胎儿或机械通风/ oxygen-treated肺。
还都是偶尔激活期间流产胎儿的肺囊状和微管的阶段。迄今为止,半胱天冬酶量9 mRNA已经证明在人类胎儿肺33,这可能会证实目前的发现。apoptosis-mediating的检测表面抗原(Fas)受体及其配体(FasL)发展中肺细支气管上皮和上皮II型细胞的啮齿动物17,34还支持目前的结果。这些蛋白可能参与信号级联导致乳沟的半胱天冬酶8。
令人惊讶的是,在肺部与RDS机械通气治疗早产儿氧气浓度升高,既不增加裂解半胱天冬酶量8和9是检测。然而,更多的半胱天冬酶3被激活而应承担的死产胎儿的肺组织部分。在这些考试组、半胱天冬酶3应承担的检测阳性的细胞发生在相同的解剖区域和大致相同的号码TUNEL阳性细胞。显然,一个信号级联通过半胱天冬酶3还存在没有参与裂解量8和9导致肺部细胞死亡等早产儿暴露于氧过多。半胱天冬酶3介导细胞凋亡中应承担的应承担的半胱天冬酶检测8和半胱天冬酶量9是激活,乳沟也展示了最近在AKR 2 b细胞血清剥夺的结果35。
总之,细胞凋亡和增殖是肺的固有成分发展岁流产胎儿的肺部22-36周的妊娠。目前的研究表明,细胞发生细胞凋亡和增殖的数量在肺部的早产儿呼吸窘迫综合征与机械通气/氧气治疗,增加通风的持续时间是一个重要因素。是介导细胞凋亡增加通过半胱天冬酶3。凋亡和增殖指数显著不同的表面活性剂的治疗。细胞凋亡和增殖的分子机制在这些机械通风/ oxygen-treated肺仍然被定义。
- 收到了2003年4月7日。
- 接受2003年7月29日。
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