摘要
肺移植术后睫状体功能是否正常尚不清楚。我们的目的是研究儿童肺移植术后气道吻合口及外周气道上下上皮细胞的纤毛功能及超微结构。
利用高速数字视频成像和透射电镜超微结构,对10例囊性纤维化(CF)和10例非化脓性肺疾病(NSLD)儿童肺移植受者气道吻合口上下及周围气道的支气管上皮进行了睫状搏动频率(CBF)和搏动模式的研究。
与吻合口下方的上皮细胞相比,CF组吻合口上方的上皮细胞CBF降低(中位数(四分位范围):10.5 (9.0-11.4)Hz与7.4 (6.4-9.2) Hz;p<0.01)和运动障碍增加(中位数(IQR): 16.5 (12.9-28.2)%与42.2 (32.6 - -56.4) %;p < 0.01)。在CF组和NSLD组中,与吻合口上方的上皮组织相比,吻合口下方的上皮组织表现出明显的超微结构异常(移植后平均持续时间为7-12个月)。
睫状上皮功能障碍是儿童CF肺移植受者天然气道上皮的一个特征。在移植数月后,CF和NSLD肺移植受者气道吻合口下方的上皮细胞均显示严重的超微结构异常。
肺移植是终末期肺病儿童的一种公认的治疗方法。与其他实体器官移植相比,儿童肺移植受者的总体生存率仍然较低[1].根据最近的报告[1],几乎一半的肺移植后一年内的死亡可归因于感染。感染也可能在闭塞性细支气管炎综合征(BOS)的发病机制中发挥作用,BOS是肺移植后5年死亡的主要原因[2- - - - - -5].
覆盖在气道表面的纤毛上皮形成了一个免疫活性的天然屏障,以抵御吸入的病原生物的入侵和伤害。上皮细胞被气道表面液体包围,纤毛在其中以10-14赫兹的频率跳动,清除粘液中捕获的病原体。这一过程被称为粘液纤毛清除[6],是肺防御的重要因素。粘液纤毛清除受损和呼吸道上皮损伤导致感染和炎症易感性增加。
尽管从两种动物[7,8]和人类[9,10研究表明,肺移植受者的粘液纤毛清除功能可能受损,特别是在移植后早期,造成这种损害的原因还远未完全了解。有限证据显示可能存在上皮超微结构异常[10]及气道黏液流变学的改变[7,11]在肺移植术后早期。虽然少数研究检查了成年肺移植受者的睫状体搏动频率(CBF),但一些作者发现,与原生支气管相比,移植支气管中的CBF显著降低[12]无法被他人复制[9,13,14].迄今为止,还没有关于肺移植后儿童睫状体功能的研究,以前也没有儿童或成人研究评估肺移植后睫状体搏动模式。除CBF外,对纤毛搏动模式的评估最近被认为是评估纤毛功能的一个重要部分,因为纤毛可能在以严重动力障碍的方式搏动时保持其搏动频率[15,16].
本研究的目的是评估小儿肺移植受者气道吻合口近端呼吸道上皮的纤毛功能和详细超微结构,并将其与气道吻合口远端气道和外周气道进行比较。
方法
主题
在2年的时间内(2007-2009年),在大奥蒙德街儿童医院(伦敦,英国)进行肺移植后接受柔性支气管镜检查的20名儿童(年龄<18岁)被研究,并收集了人口统计学和临床细节。所有受试者都进行了pH/阻抗研究,以检查病理性胃食管反流的证据。根据欧洲呼吸学会指南进行柔性支气管镜检查[188bet官网地址17].在直视下从气道吻合口上方2-3厘米和下方2-3厘米处取上皮刷,在透视下从外周气道取上皮刷,确认所有病例的刷均位于肺边缘;详细的方法可以在在线补充材料中找到。进行支气管肺泡灌洗(BAL),并检测各种病原体,包括细菌、分枝杆菌、真菌和病毒。用油红O染色技术处理BAL,以估计含脂巨噬细胞的比例和>10%被认为是显著的的比例。获得经支气管肺活检样本并进行组织病理学研究以寻找排斥反应的证据。在收集支气管上皮样本时,受试者已经至少6周没有并发呼吸道感染。
该研究方案由儿童健康研究所和大奥蒙德街医院研究伦理委员会批准。参与实验的儿童提供了同意,并获得了父母的书面知情同意。
CBF和拍型
详细的方法在在线补充材料中给出。如前所述,使用数字高速视频显微镜系统在支气管上皮条带上测量CBF并评估搏动模式[18],在样本采集后4-6小时内。高速视频图像以盲法进行分析。这些图像由第二个观测者(a . Rutman)重新分析,并由最初的观测者(B. Thomas)第二次盲化。
实验系统允许在三个不同的平面上评估睫状体搏动模式:侧侧轮廓,直接向观察者搏动,以及从正上方搏动[18].逐帧分析纤毛在拍周期中所走的路径。这是有特征的,并与数字高速视频分析中看到的正常节拍模式进行了比较[18].运动障碍被定义为一种异常的搏动模式,包括:搏动振幅降低,搏动模式僵硬,不能沿睫体轴弯曲,闪烁或抽搐运动,以及静止的纤毛。运动障碍指数计算为样本中运动障碍纤毛的百分比(运动障碍读数数/样本总读数数×100)。不动指数计算为样本中不动纤毛的百分比(不动读数数/样本总读数数×100) [19].将纤毛上皮边缘的数字侧面图像投影到计算机屏幕上,用微米校准并测量纤毛的长度。
透射电子显微镜
使用透射电镜研究支气管上皮条的详细超微结构,如前所述,使用鼻上皮刷[20.].详细的方法在在线补充中给出。以盲法评估纤毛上皮细胞的上皮和纤毛超微结构变化。纤毛细胞、非纤毛细胞、黏液细胞和死亡细胞的数量表示为所检查的所有细胞的百分比。通过计算所有被检查细胞中纤毛丢失、细胞突出、细胞质起泡和线粒体损伤的纤毛细胞的百分比来评估上皮细胞的破坏和损伤。通过纤毛超微结构检查微管和动力臂缺陷来评估单个纤毛的损伤,并计算微管和动力臂缺陷的纤毛百分比。细胞内纤毛取向,定义为源自单个纤毛细胞的纤毛中央对微管的线角度的标准偏差,如前所述确定[21].
统计分析
以CBF作为主要指标计算样本量。年代eyboldet al。[22]研究了新鲜切除的羊气管表面液体速度,发现CBF增加16%与气管表面液体速度增加56%相关。因此,我们假设CBF中2 Hz的绝对平均差具有潜在的生物学意义。据估计,要检测两组间CBF的平均差异为2hz(标准差为1hz),置信区间为95%,幂为80%,则每组需要样本量为6。使用GraphPad Prism 5进行统计分析。非参数数据描述为中位数(四分位间距(IQR))。组间最初比较使用Friedman检验,事后分析使用Dunn的方法。P <0.05为差异有统计学意义。对于CBF(类间相关性0.94)和运动障碍指数(类间相关性0.93)的测量,两名观察者(B. Thomas和A. Rutman)之间的一致性非常好。重复性(观察者的一致性)也很好(CBF的类间相关性为0.94,运动障碍指数的类间相关性为0.99)。
结果
人口学和临床细节,包括pH值/阻抗研究,BAL和经支气管活检的结果,已给出表1.所有经支气管活检样本均未显示急性细胞排斥反应。在研究的20名儿童中,有两名儿童在BAL中有致病性有机体,被排除在睫状体功能研究和上皮超微结构分析之外。对18例儿童(囊性纤维化(CF)组和非化脓性肺病(NSLD)组各9例)的CBF和搏动模式进行了研究图1而且2]和网上补充资料中的表S1和S2。
在CF组中,气道吻合口上方上皮的中位(IQR) CBF (7.4 (6.4-9.2) Hz)明显低于气道吻合口下方上皮(10.5 (9.0-11.4)Hz;Friedman p<0.01) (图1一个).睫状搏动模式分析显示,吻合口上方上皮细胞中运动障碍纤毛比例(42.2(32.6-56.4)%)高于吻合口下方上皮细胞(16.5(12.9-28.2)%)和外周气道上皮细胞(13.9 (6.5-16.6)%;Friedman p<0.01) (图1 b).气道吻合口上方上皮细胞的不动指数(4.1(3-5.9)%)也明显高于外周气道(0%)(Friedman p<0.001;图1 c).相比之下,NSLD组与外周气道吻合口上下上皮之间的CBF、运动障碍指数和不动指数无明显差异(图2).中部(气道吻合口上方和下方)和外周气道纤毛中位数(IQR)长度分别为5.8 (5.4 ~ 6.2)μm和6.0 (5.6 ~ 6.2)μm,差异无统计学意义(p=0.17)。
由于在支气管肺泡灌洗液中发现了致病菌,故将CF组和NSLD组各1例患儿的支气管刷刷结果排除在上皮超微结构分析之外。从CF组和NSLD组的另外两名儿童身上获得的样本不足以通过透射电镜进行评估。因此,对每组7名儿童的样本进行透射电镜检查。每个研究样本中上皮细胞的中位数(IQR)为380(276-664)。结果总结于表2而且3.(以及在线补充资料中的表S3和S4)和示例电子显微照片显示于图3而且4.在CF组和NSLD组中,气道吻合口下方纤毛上皮均观察到明显的超微结构异常。CF组吻合口下方上皮与吻合口上方上皮、外周气道上皮相比,纤毛细胞比例显著降低(p<0.05),纤毛缺失的纤毛细胞比例显著增加(p<0.05),纤毛微管缺陷的纤毛比例显著增加(p<0.05)。此外,与气道吻合口上方上皮相比,CF组吻合口下方上皮中无纤毛细胞、死亡细胞、细胞表面膨出细胞、细胞质起泡细胞和线粒体损伤细胞比例均显著增加(p<0.01)。同时,CF组气道吻合口下方上皮睫状体定向障碍明显高于吻合口上方上皮(p<0.05)。
NSLD组气道吻合口下方上皮中纤毛细胞比例较吻合口上方上皮明显减少(p<0.01),而非纤毛细胞、死亡细胞、纤毛缺失细胞、细胞表面膨出细胞、细胞质起泡细胞、线粒体损伤细胞、微管缺陷纤毛比例明显增加(p<0.01)。与吻合口上方上皮相比,吻合口下方及外周气道上皮睫状体定向障碍明显增加(p<0.05)。气道吻合口下方上皮细胞黏液细胞比例较吻合口上方及外周气道黏膜细胞比例明显增加(p<0.05)。
考虑到术后即刻上皮正常愈合过程对上皮超微结构变化的可能影响,我们重新分析了排除移植后4个月内支气管刷样的2例患者(各组)的数据。这并没有改变在气道吻合口下方上皮细胞中发现的显著上皮超微结构异常(在线补充资料中的表S3和S4)。排除BAL中>10%含脂巨噬细胞的受试者(n=7),重新分析上皮细胞超微结构数据也没有改变气道吻合口下方上皮细胞明显超微结构异常的发现。
讨论
这项研究表明,在儿童CF肺移植受者中,气道吻合口上方的上皮细胞存在明显的纤毛功能障碍。然而,儿科NSLD肺移植受者原生气道的睫状体功能与移植肺相当。我们的数据表明,移植肺的外周气道纤毛的长度和搏动频率与中央气道纤毛的长度和搏动频率没有差异。我们还发现,在CF和NSLD儿童肺移植受者中,移植后几个月,气道吻合口下方的上皮细胞均存在严重的上皮超微结构异常。这是值得关注的,因为已知呼吸道上皮的损伤易导致继发感染,这是肺移植患者的一个主要问题。
据我们所知,这是第一个评估儿童肺移植受者睫状体功能(搏动频率和搏动模式)和上皮超微结构的研究。先前作者[9,12,14]研究了成年肺移植受者的CBF,除一项研究外,其他研究均报告了原生支气管和移植支气管之间的CBF无差异[12].由于受试者特征、移植指征、移植类型和CBF样本收集和分析方法的异质性,难以与我们的研究结果进行直接比较。我们的研究是任何肺移植研究的独特之处在于,除了测量CBF外,我们还评估了搏动模式。最近出现的高分辨率数字高速视频成像技术使这成为可能。18],通过在不同平面逐帧观察纤毛搏动周期,我们可以评估纤毛的精确搏动模式。使用这种方法,我们之前已经证明,尽管搏动模式明显异常,但在某些条件下纤毛可能具有正常的搏动频率[20.],而正常的睫状体搏动频率并不一定等同于正常的睫状体功能。我们发现,在CF移植受者的原生气道上皮中,搏动频率显著降低,睫状体运动障碍增加,这与R含铅et al。[14],显示他们研究的6名成年CF患者的原生气道上皮中位数(IQR) CBF较高,为10.8 (8.8-11.1)Hz。虽然慢性炎症通常存在于原生CF气道上皮中,但已知会导致纤毛功能障碍和超微结构缺陷[23],但先天CF上皮纤毛功能障碍的确切机制仍有待确定。有一种观点认为,与中央气道的纤毛相比,周围气道的纤毛更短[24]并以较慢的频率跳动[25,26].我们的数据与这一建议相矛盾,并与Y的研究一致蒸机et al。[27],在气管支气管树不同水平的上皮细胞CBF无差异。
对肺移植后上皮细胞超微结构的有限动物和人体研究结果尚无定论[10,28].在本研究中,我们系统地量化了原生气道和移植肺的呼吸上皮的超微结构异常。我们在移植后几个月观察到气道吻合口下方上皮细胞完整性的严重丧失和显著的超微结构异常,这可能是多因素造成的。器官摘取、同种异体移植保存、再灌注和急性细胞排斥反应过程中的损伤可能导致上皮损伤。虽然没有详细研究,但移植导致的血管断流和淋巴中断、糖皮质激素等药物可能损害伤口愈合,以及胃食管反流导致的吸入气道[29都与上皮损伤有关。与吻合处下方的气道相比,外周气道上皮完整性的相对保存表明局部机制如断流和/或淋巴中断可能产生影响,尽管这仍有待确定。
我们在气道吻合口下方观察到的明显的上皮超微结构异常很可能具有重要的功能后果。首先,这些可能导致粘液和睫状液的定量和定性改变,这可能导致尽管CBF正常,但粘液纤毛清除受损。特别有趣的是,我们观察到移植肺上皮中睫状体定向障碍的增加。类似程度的定向障碍以前曾被描述为原发性纤毛运动障碍的变体[21].其次,也许更重要的是,这些上皮细胞异常可能会增加病原生物对同种异体移植物定植的风险。的确,细菌如假单胞菌已被证明优先粘附于损伤、破坏和再生的气道上皮区域[30.]并将同种异体移植物定植于双侧CF [2,31,32]和非cf [31,32肺移植受者。越来越多的证据指向异体移植物与微生物定植的潜在作用,如假单胞菌[2,31,32),曲霉属真菌[5在BOS的发展过程中。
我们的研究主要局限于它的横断面设计;因此,研究对象内纤毛功能和上皮超微结构的重复性和纵向变化还有待进一步研究。我们的数据产生了几个重要的问题,需要在未来的研究中解决。阐明先天性CF气道上皮纤毛功能障碍的原因、气道吻合口下方的上皮超微结构异常及其对粘液、睫状液和粘液纤毛清除的潜在影响,是未来研究的主要挑战。动物模型表明,肺移植期间保留支气管周围组织可能会减少粘液流变学和气道上皮的异常[7,未来的研究可以评估不同的手术技术对同种异体移植物上皮超微结构的影响,以最大限度地减少去神经、断流和淋巴阻塞的影响。尽管之前的研究[11,28提示移植后上皮超微结构异常最早可在移植后3-4个月恢复,我们的数据与这些观察结果不一致,只有长期的前瞻性研究才能确定移植后上皮超微结构变化的时间进程。此类信息可指导治疗决策,如预防性抗微生物药物的使用期限。尽管我们的研究存在局限性,但我们对睫状体功能和上皮细胞形态的测量是高度可重复的,并且在气道吻合口下方看到的上皮超微结构异常的程度是惊人的,很可能具有临床意义。
总之,我们的研究为儿童CF肺移植受者的原生气道纤毛功能障碍以及CF和NSLD儿童肺移植受者气道吻合口下方的显著上皮损伤提供了证据。同种异体移植上皮损伤的潜在主要后果是增加了同种异体移植气道微生物定植的风险,这可能在BOS的发展中发挥作用。
致谢
我们感谢参与这项研究的孩子和他们的家庭;向大奥蒙德街儿童医院(伦敦,英国)的移植科专科护士提供患者临床特征的协助;G.M. Doherty(大奥蒙德街儿童医院)帮助招募病人;向J. Bankart提供统计分析方面的建议,向M . G. Williams和N . Baker提供实验室方面的技术援助(所有莱斯特大学,莱斯特,英国)。
脚注
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权益声明书
没有宣布。
- 收到了2011年10月8日。
- 接受2012年1月21日。
- ©2012人队