文摘
原发性纤毛运动障碍(PCD)是一种罕见的遗传性疾病导致反复呼吸道感染。高速video-microscopy分析(HVMA)纤毛殴打,目前金刚石在最中心的一线诊断工具,是具有挑战性的,因为最近的研究扩大HVMA发现纤毛运动从严重的光谱异常非常微妙的。本研究的目的是描述的多样性HVMA发现基因证实PCD的个人。
HVMA作为常规检查的一部分执行的怀疑纤毛运动。随后的分子分析确定biallelic PCD-related基因突变的66人。1072个视频这些受试者评估与基因型的相关性。
Biallelic基因突变(小说)19日被发现在17:DNAI1, DNAI2,DNAH5,DNAH11,CCDC103,ARMC4,KTU / DNAAF2作,LRRC50 / DNAAF1,LRRC6,DYX1C1,ZMYND10,CCDC39、CCDC40 CCDC164 HYDIN,RSPH4A和RSPH1。纤毛击败模式变化相关基因的发现,使分类的典型HVMA发现不同的遗传群体。相比之下,纤毛拍频分析并没有导致额外的诊断的影响。
总之,这项研究提供了详细的知识的多样性HVMA发现纤毛运动,可能因此被视为改善金刚石诊断的指南。
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纤毛与各种各样的纤毛击败模式异常与基因亚型http://ow.ly/zh5jP
介绍
原发性纤毛运动障碍(PCD) (MIM 244400)是一种罕见的遗传性疾病的纤毛运动导致新生儿呼吸窘迫,慢性上下呼吸道疾病,男性不育,和器官一侧缺陷在大约50%的情况下)出现(1]。
PCD是诊断不足和确诊太晚了2]。直接可视化的纤毛击败模式(CBP)和频率(CBF)高速video-microscopy分析(HVMA)已被推荐为一线诊断测试,以及透射电子显微镜(TEM) (3]。进一步金刚石诊断方法,完成医疗设备包括免疫荧光显微镜(如果),遗传学和测量鼻一氧化氮(nNO)生产4]。
虽然HVMA越来越多的应用,它是一个具有挑战性的方法由于种种原因:1)慢性感染和炎症经常导致额外的二级纤毛受损,这掩盖了主要打异常(1,5];2)标准化程序中心之间缺乏;3)缺乏定量数据对cbp的解释;和4)HVMA异常可能在最近发现微妙的变体。
在多个基因突变已被描述为常染色体隐性的一个原因,nonsyndromic PCD。在九个基因突变影响外动力蛋白臂(ODA)组件:DNAI1,DNAI2,DNAH5,DNAL1,CCDC103,NME8 / TXNDC3,CCDC114和ARMC4(1,6,7)导致ODA缺陷,而DNAH11突变导致纤毛超微结构正常(8]。九个基因编码所需的细胞质蛋白质组装ODA和内在动力蛋白臂(IDA)复合物:KTU/DNAAF1,LRRC50/DNAAF2,C19orf51 / DNAAF3,LRRC6,HEATR2,DYX1C1 / DNAAF4,ZMYND10,SPAG1和C21orf59(1,9- - - - - -12]。突变CCDC39和CCDC40结果在一个IDA和微管杂乱无章的缺陷13,14]。突变CCDC164和CCDC65导致nexin链接缺陷(15,16]。突变HYDIN导致缺乏C2b投影的中卫搭档(CP)微管17]。RSPH9, RSPH4A(18),RSPH1(19)影响径向说蛋白质组件。突变基因影响鞭毛运动,如DNAH1(IDA组件)(20.),尚未与纤毛运动。
在这项研究中,我们相关的发现HVMA金刚石变体使用一组不同的遗传Sisson-Ammons视频分析(萨瓦河)(美国亚扪人工程,太莫里斯,MI) (21纤毛击败),一个被广泛接受的系统分析。这些视频是在临床常规的PCD检查。这不是学习的目的比较系统地评估萨瓦河,或其他系统。
方法
主题
受试者被称为我们的纤毛运动中心检查。PCD是基于典型的临床特征和诊断PCD-specific异常发现至少在以下两个方法:nNO测量,HVMA, TEM或者显微镜。视频从10个人没有急性或慢性呼吸道症状(健康对照组(高碳钢))和10个人与呼吸道症状但PCD是排除在外(疾病控制(DCs))进行比较。虽然DCs称为金刚石污迹,没有显示关键纤毛运动特性(位置异常、新生儿呼吸窘迫,上下呼吸道问题)。除此之外,纤毛运动是由至少一个额外的发现:排除nNO值高,正常的TEM或者。超微结构分析使用TEM或者显微镜可能不起眼的PCD (1,8,15- - - - - -17),甚至误导(22),我们只分析证实biallelic突变的个体。伦理委员会批准的这项研究是威斯特伐利亚的威斯特法明斯特大学(德国明斯特)。书面知情同意参加本研究获得每个个人或法定监护人的18岁以下或主题。
鼻毛刷活检和高速video-microscopy分析
鼻纤毛呼吸道上皮细胞是通过使用细胞学活检刷,刷,悬浮在RPMI 1640中。HVMA刷牙后直接进行。视频记录使用巴斯勒sca640 - 120 fm数字高速摄像机(巴斯勒AG,阿伦斯堡,德国)连接到一个倒置相差显微镜(蔡司Axio绿色。A1;卡尔蔡司AG)、德国哥廷根)配备了40×目标。数字图像采样是在120 - 150帧每秒执行(fps)和一个640×480像素的分辨率。图像处理是使用萨瓦河执行(21]。温度保持在25°C的Pecon临时控制器2000 - 2 (Pecon GmbH, Erbach,德国)。纤毛击败评估了视图从侧面和顶部在实时和慢动作回放。使用以下术语:CBP描述recognisability定期向前和恢复中风;静纤毛;几乎静态纤毛的运动;激烈的跳动由于减少弯曲能力/振幅;不正常的圆跳动。视频样本的质量得分是使用一个适应分类系统(5]:优秀(纤毛细胞包没有预测),好(纤毛细胞包小预测),可接受(纤毛细胞包主要预测),不足(孤立的纤毛细胞在上皮地带或单个细胞)。视频被排除在分析不足。HVMA进行由两个独立调查人员:j . Raidt或j . Wallmeier和c·沃纳或h .奥木兰·。在所有情况下,HVMA基因测试之前进行。结果HVMA没有修改知识的遗传的结果。样品只有在那些没有接受鼻类固醇或减充血剂,并没有表现出急性呼吸道感染至少3周为了减少二级纤毛运动障碍。
突变分析
突变分析后进行全基因组连锁分析所描述的其他地方(6)或通过使用直接候选基因的方法。DNA是孤立的从血液样本或淋巴细胞文化标准方法。放大的编码外显子,包括exon-intron边界,使用体积进行50μL包含30 ng的DNA, 50 pmol每个引物2毫米核苷酸和1.0 U GoTaq DNA聚合酶(WI Promega公司麦迪逊,美国)。PCR条件和底漆细节可按照客户要求定制。纯化PCR产品被琼脂糖凝胶电泳验证,使用ExoSAP-IT(美国Affymetrix,圣克拉拉,CA)和测序双向使用BigDye终结者v3.1循环测序工具包(应用生物系统公司、生命科技有限公司、佩斯利,英国)。样品分离和分析应用生物系统公司3730 xl DNA分析仪。序列数据进行评估使用CodonCode软件(www.codoncode.com)。只能清楚地确认为biallelic突变导致纤毛运动得分。
统计数据
统计分析了使用Microsoft Excel (www.microsoft.com)和SPSS 22 (www.ibm.com)。每个视频的意思是CBF评估使用萨瓦河[21),利用代表感兴趣的区域(ROI)。为每个金刚石变种基因,CBF中位数,降低/上四分位数和测定范围。
结果
遗传学
Biallelic突变被发现在金刚石的17个基因从66年55的家庭。29日主题表现出纯合突变和37个人表现出复合的杂合突变。遗传的结果49个人发表之前(见表1引用)。19突变没有先前发表在《文学或运用(www.ensembl.org)。所有相应的蛋白质的突变导致功能丧失。所有突变及其功能的后果所示表1。
高速video-microscopy分析
1072的1527个视频影响个人(从DCs 92 130个视频;104的125从高碳钢)完成的质量控制标准,因此分析。每个基因的可用的视频数量提出了表2。鼻纤毛上皮细胞的实时视频显示在在线补充材料(视频S1-S19)。
纤毛拍频
CBF测量总结图1和表2。cbf范围3.95 - -8.44 Hz DC组中位数5.32赫兹的频率;HC组cbf范围4.25 - -11.63 Hz值6.36赫兹的频率。CBF的受试者携带突变导致ODA缺陷(DNAH5,DNAI1,DNAI2,ARMC4和CCDC103)是严重减少,以最小残余纤毛运动在大多数视频。作为一个例外,从个人op - 1193 II2携带biallelic纤毛CCDC103突变主要是完全不能移动的。在主题与突变KTU / DNAAF2作,LRRC50 / DNAAF1,LRRC6和ZMYND10编码组合因素的ODA / IDA复合物,固定总是观察。相比之下,HVMA产生异构发现个人携带DYX1C1变异:在分离患者f - 648故,稍微CBF减少3.45 Hz最大值为7.07赫兹在场,而病人op - 86年纤毛II2是不能移动的。
在主题与突变DNAH11,CBF倾向于增加(平均8.7赫兹(25 - 75 6.92 -11.31赫兹))。有一个相当大的CBF可变性(范围1.44 - -24.86赫兹)与运动机能亢进的边缘,几乎静态纤毛在同一标本。
在CCDC39和CCDC40突变体,在测量CBF萨瓦河被证明不可靠:CBF中位数为2.58赫兹CCDC39病人和4.94赫兹CCDC40。为了进一步阐明这种差异非常明显的视觉外观的频率增加,我们比较了视频与个人携带DNAH11突变(CBF)增加和DCs正常(CBF)。我们发现CBF更高CCDC39和CCDC40(视频S13-S14)。决心CBF的时机10纤毛击败周期的慢动作回放视频文件确实导致值明显高于15赫兹。
CBF的CCDC164突变体纤毛与广泛重叠DCs略有增加。在个人HYDIN突变,CBF是正常的。与径向变异个体说话头组件,CBF略下降(RSPH4A)或正常(RSPH1)。
综上所述,CBF值很明显异常在个人官方发展援助和ODA / IDA的缺陷。其他组,CBF从DCs测量金刚石个人不能辨别。
纤毛击败模式
正常打循环的特点是强烈跳动中风后恢复中风(图2;视频S1)。而纤毛处境直跳动行程期间,经济复苏中风是由近端基因丝的弯曲。顶视图分析显示,纤毛一般打在一架飞机只有小偏离纵轴。
大多数视频对象ODA缺陷来源于个人DNAH5突变。通常情况下,DNAH5突变体纤毛弯曲位置和显示微小残留的动作。击败邻国纤毛高度不协调(视频S2)。类似的模式在其他ODA-defect变体(DNAI1,DNAI2,ARMC4和CCDC103)(视频S3-S6)。
突变导致联合特战分队/ IDA缺陷(KTU / DNAAF2作,LRRC50 / DNAAF1,LRRC6,ZMYND10和DYX1C1)导致完成纤毛固定(视频S7-S11)。作为一个例外,分离单个f - 648故,纯合子突变DYX1C1,显示一个微妙的跳动幅度的减少由于受损复苏中风在大多数视频(视频S12),而只是偶尔静纤毛在场。
海关与边境保护局的科目CCDC39和CCDC40突变非常僵硬。区分跳动和恢复中风(视频S13-S14)是不可能的。CCDC164突变体纤毛击败降低振幅(视频S15)比观察到明显要少得多CCDC39和CCDC40。
纤毛的科目DNAH11突变显示降低近端弯曲(视频S16)。比刚度的程度不明显CCDC39 / CCDC40纤毛但高于CCDC164纤毛。
HYDIN突变体纤毛缺乏协调的活动。沿着纤毛基因丝弯曲能力降低,导致减少跳动振幅(视频肌力表现)。纤毛未产生明显的有效或恢复中风。在一些地区,不能游动的纤毛也被发现。只是偶尔旋转观察纤毛运动。
与径向变异个体说话头组件,我们找到了一个僵硬的海关与边境保护局在一个主题RSPH4AS18突变(视频美国)和一个主题RSPH1突变(视频S19)。未见的圆周运动RSPH4A突变体纤毛。在RSPH1突变体纤毛,圆周运动被认为只有在少数细胞集群。
讨论
金刚石需要诊断相结合的方法互补的方法,所有这些都限制在敏感性和特异性1,3,4,30.]。虽然高通量基因技术可以克服这个问题在未来,许多金刚石变异基因仍未被发现的(目前60 - 70%的病例可以确定基因(1),这对常规诊断方法还没有实现。因为某些PCD的TEM变体是不起眼的8,15,17,30.],HVMA已成为建立PCD的一线诊断测试诊断。
HVMA协议不同中心在许多方面包括:抽样技术,显微镜和相机,期间温度分析,软件和评估标准。在我们的研究中,我们使用高速摄像机在120 - 150 fps捕捉视频,和萨瓦河HVMA分析。萨瓦河方便允许CBF的决心和慢动作video-pattern分析(21]。我们分析了纤毛使用总放大倍数400×(40×客观造成的10×接目镜放大)25°C。潜在的这种方法的缺点包括减少纤毛与系统的分辨率更高的放大倍数(1000×)。然而,使用更高的放大倍数也有潜在的局限性。使用100×目标(数值孔径1.46)导致明显减少景深在z平面(0.23μm)。因此,纤毛不严格从侧面记录可能击败范围以外的焦z平面视频S20所示,这是拍摄100×目标。因此,有限的景深时使用100×cbp的客观熊误解的风险当整个纤毛击败周期不形象化。这可以避免使用40×客观(数值孔径0.56),它有一个更大的景深1.5μm。在我们的系统中,我们在120 fps捕获视频,而其他人使用相机以更高的速度高达500 fps。使用120 fps可能会妨碍分析纤毛击败变异很快,限制我们试图克服通过分析CBP 25°C。 This lowers CBF to a point that sufficient images are available for CBP analysis. The ideal temperature for HVMA is also a matter of debate: whereas some centres cool the specimen (because CBP does not change at low temperatures [31日),分析了由于减少CBF)其他人执行HVMA 37°C (32]。然而,上呼吸道的温度增加从鼻前庭的大约25°C到34°C在鼻咽33]。因此,有人可能会争辩说,37°C代表一个supra-physiological温度nasal-derived细胞。我们没有我们的协议与其他HVMA系统(系统比较31日,34,35所以目前尚不清楚的潜在差异的现实意义。然而,我们的方法使我们能够描述金刚石变异大多数已知微妙,如CP缺陷(17),孤立nexin链接缺陷(15)和功能性ODA缺陷(8]。
决心萨瓦河计算CBF的ROI内每个像素的相对光强度变化(如用于这项研究)或整个字段(整个领域分析)。从个人与萨瓦河只证明了不合适的样品CCDC39或CCDC40突变值是令人难以置信的低。我们解释这个使用非常僵硬的海关与边境保护局。这导致只有小像素不能被探测到的光强的变化使用萨瓦河准确。因此,我们建议一个关键的视觉验证CBF测量。HVMA CBP分析的另一个限制是缺乏定量描述击败模式参数异常。因此,结果是依赖于视觉解释由经验丰富的人员。而萨瓦河和其他系统是能够量化的CBF定量CBP分析的发展仍处于初步的阶段(36]。
在我们的研究中,CBF测量确定了PCD和严重CBF减少变异。然而,在这些变异,CBP也同样严重改变和歧视影响DCs的纤毛运动主题是随时可能单靠视觉分析。在PCD变异检测纤毛蠕动:1)意味着CBF往往增加DNAH11突变的个体但与DCs显示重叠;2)意味着CBF是在正常范围内;或3)CBF测量不准确(CCDC39/CCDC40)。
在DCs,意味着CBF略低于高碳钢,可能由于更高程度的辅助运动障碍。cbf以我们的价值观符合24°C与慢性鼻窦炎、鼻腔鼻窦上皮细胞从个人细菌在哪里值范围3.37 - -9.13赫兹(37),而另一些发现高值(7.9赫兹)(34]。这些差异可能反映了异质性HVMA协议和突出每个中心需要仔细确定参考价值。
不像CBF, CBP分析相关基因的发现和允许HVMA发现分为不同的组,如下所示。1)结合ODA / IDA缺陷几乎总是显示完整的纤毛固定。2)隔离ODA缺陷表现出微小残留,高度混乱跳动。完全不能移动的纤毛被认为只是偶尔。3)CCDC39和CCDC40突变导致极其僵硬CBP几乎没有任何振幅和CBF增加。4)DNAH11突变导致的运动机能亢进的CBP不如在僵硬CCDC39和CCDC40突变。CBF倾向于增加而控制。值得注意的是,我们还发现视频几乎静态的纤毛DNAH11突变体,证实最近发现在老鼠38]。5)突变CCDC164导致了非常微妙的HVMA异常。CBP出现刚性由于振幅降低。这种表型很温和,很容易被解释为正常。6)突变影响中央副或径向说设备已经被描述为导致圆周运动18,39)或小幅度的运动(19]。在我们的纤毛运动主题,HYDIN突变导致旋转运动只在少数的纤毛字段。减少这种变体的特点是一种温和的纤毛弯曲能力很难与HVMA单独建立诊断。的两个人RSPH4A和RSPH1突变展出的CBP跳动幅度的减少,一个模式中描述RSPH1突变(19]。圆周运动在场只在少数的纤毛RSPH1主题。因此,循环纤毛运动并不是一个强制性的发现在CP或径向说话的缺陷。
尽管典型HVMA发现可以归因于金刚石变异基因,应该强调,可以发现即使在一个基因表型的变化,体现在个人DYX1C1突变。同样的,相差的表型患者甚至报道相同的基因型(19),强调纤毛击败不仅取决于分子的缺陷。综上所述,这些研究结果强调HVMA发现不容易翻译超微结构或基因的发现。因此,额外的分析还需要阐明底层机制导致纤毛运动(6,9,15]。
目前,许多机构实现HVMA为了提供最先进的PCD诊断。我们希望我们HVMA发现不同金刚石变异基因将有助于诊断PCD传播所需的有价值的知识。意识与纤毛运动相关的异常结果的可变性将避免假阳性和假阴性结果,并因此提高PCD护理。因为HVMA发现的解释需要足够的样本大小不同的变体,我们读者参考网站pcd.uni-muenster.de,一个广泛的,不断更新的集合HVMA视频不同的金刚石变异可以遗传。
确认
我们感谢PCD-affected个人及其家庭的参与。我们也欣然承认德国的耐心支持小组出现通气和Primaere Ciliaere Dyskinesie汽车。最后,我们要感谢m .懂得d·恩斯特k Vorspohl和s·赫尔姆斯(明斯特大学儿童医院,部门一般儿科,小儿肺学单元,明斯特,德国)为他们的优秀的技术工作。
脚注
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可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:这项工作是由欧洲委员会支持FP7研究)(第七框架项目之下批准号305404 (BESTCILIA) Heymut奥木兰·,欧洲委员会FP7格兰特没有之下。241955 (SYSCILIA) Heymut奥木兰·“德意志Forschungsgemeinschaft”(DFG OM 6/4, OM 6/5)和IZKF明斯特(Om2/009/12)。
利益冲突:没有宣布。
- 收到了2014年1月16日。
- 接受2014年7月2日。
- ©2014人队